关于疟原虫检验技术课件
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● 如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8 000个白 细胞计数(国际标准) 。
白细胞疟原虫计数法举例
●假设计数200 WBC中有35个疟原虫，在不知患 者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细 胞计数, 由此计算出每微升血液疟原虫密度为：
35（疟原虫数）÷200（计数的白细胞）x 8000（每 微升血白细胞数） =1400 / μl 答：该患者的疟原虫密度为1400 / μl。
血片制作注意事项
● 载玻片必须清洁无油污，不然会影响血片制作 和镜检结果．
● 用甲醇固定薄血膜时，甲醇不要接触到厚血膜
● 血片充分干燥后染色，清水细缓冲洗。防止厚 血膜脱落.
● 配置吉氏母液必须过滤除去杂质颗粒，有助于 提高镜检质量．
疟原虫密度计算
计算疟原虫密度的三种方法：
● 白细胞原虫密度计数法 (厚血膜 WHO) ● 半定量计数法 (厚血膜) ● 红细胞感染密度计算法 (薄血膜)
操作2 (慢染) 在量筒内量2ml蒸馏水或净水， 再 滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上， 染色30~40min。清水细缓冲洗，晾干镜检。
成批血片染色
将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染 液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升， 混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min （如染液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓 度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标 本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。
红细胞感染率计算法（薄血膜）
显微镜下（10目镜Χ100油镜）选择红细胞排列整齐密集，无重 迭的视野（ 约300红细胞/视野）
红细胞疟原虫密度按以下公式计算： 1.红细胞疟原虫感染率（%）计算
红细胞原虫感染率（%）= 疟原虫数 ÷计数的红细胞数X 100 2.红细胞疟原虫感染密度计算
红细胞疟原虫密度=红细胞原虫感染率X红细胞数/每微升血 （男性500万个/μl；女性450万个/μl）
●整个染色液配制时间不能少于5个小时
稀释吉氏原液
●原液需经缓冲液或净水稀释后，方可用 于厚薄血片染色。
●吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物 泛起影响染色效果.
吉氏染液浓度
门诊染色
操作1 （快染） 量筒内量2ml缓冲液或净水，直 接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的 厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾 干镜检。
质量好的染色 : 显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色
如果血片偏红,说明染液偏酸性 如果血片偏蓝,说明染液偏硷性
外观吉氏染色血片
偏酸 标准 偏碱
染色过程
血片干燥后, 用甲醇固定薄血膜 血片平置于染色板上 用吸管吸取已稀释的吉氏液约2ml于厚薄血 膜上，染色10 min 清水细缓轻轻冲去染液 置玻片于插板上，自然晾干
3. 如果能见到疟原虫，但是记数10000个红细胞时却 没有感染红细胞，那么设定感染率为＜１％
如何确定疟原虫血片为阴性
白细胞疟原虫密度计数法
● 在厚血膜按视野顺序，从看到第一个疟原虫开始计 数，记录200个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和 无性体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数 500~ 1 000 个。
● 白细胞疟原虫计算公式： 疟原虫数 ÷ 计数的白细胞数 × 患者每微升血白细 胞数 = 疟原虫数/μl血。
关于疟原虫检验技术
实验室技术
●分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是 确诊疟疾的“金标准” 仍然是血液显微 镜检查
●显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方 法
●厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代 的疟疾诊断的金标准
镜检技术—血片制作
厚薄血膜的制作
制作血片前，首先要核对患者的姓名和年龄
取血部位和血量
取血方法 采血部位：耳 垂或无名指，通常在耳垂 取血，先用75%酒精棉球 消毒取血部位，待酒精干 后，用左手拇指和食指紧 捏耳垂上方或无名指指尖， 右手持消毒针迅速刺入皮 肤，不宜过深或过浅。然 后用右手中指轻轻挤压出 血。厚血膜血量约一粒米 大小。
厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量 （相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片 接触，再由里向外一个方向旋转，转2~4圈，涂成 直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜。
薄血膜再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适 当远的地方.将采血玻片(推片)的边缘紧贴载玻片使 血液沿边缘散开(如图示).
正确的推片姿势
标准的疟疾厚薄血膜片位置
各种不同的疟疾血片涂制法：
标准血片
门诊发热病人血片 居民普查血片
厚薄血膜的标准
●厚血膜血量适宜，不宜过多或过少 ●薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列
红细胞疟原虫感染密度计算（薄血膜）
薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大 差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比 前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查 一个角落，应顺玻片的横轴检查。选择红细胞 排列整齐密集，无重迭的视野
镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫 虫期，不要笼统地记录为Pv或Pf。
半定量计数法
用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略 地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数 的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定 量分析。 国内常用。此方法将密度分为6级： 1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字 2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视 野不到1个虫，记录“少” 3.平均每个视野1~5个虫，记录“＋” 4.平均每个视野6~10个虫，记录“++” 5. 平均每个视野11~100个虫，记录“+++ ” 6. 平均每个视野100个虫以上，记录“++++ ”。
血片染色
两种染色方法: ●吉氏染色法 ●瑞氏染色法
常用吉氏染色法
吉氏染液(原液)的配置
吉氏染粉 (Azure B type) 5g
甘油 (纯)
250ml
甲醇 (纯)
250ml
●吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加边磨，直 至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加入少
许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中Βιβλιοθήκη Baidu再放入甲醇清洗，反 复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于 室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保存 时间越长染色效果越好。
白细胞疟原虫计数法举例
●假设计数200 WBC中有35个疟原虫，在不知患 者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细 胞计数, 由此计算出每微升血液疟原虫密度为：
35（疟原虫数）÷200（计数的白细胞）x 8000（每 微升血白细胞数） =1400 / μl 答：该患者的疟原虫密度为1400 / μl。
血片制作注意事项
● 载玻片必须清洁无油污，不然会影响血片制作 和镜检结果．
● 用甲醇固定薄血膜时，甲醇不要接触到厚血膜
● 血片充分干燥后染色，清水细缓冲洗。防止厚 血膜脱落.
● 配置吉氏母液必须过滤除去杂质颗粒，有助于 提高镜检质量．
疟原虫密度计算
计算疟原虫密度的三种方法：
● 白细胞原虫密度计数法 (厚血膜 WHO) ● 半定量计数法 (厚血膜) ● 红细胞感染密度计算法 (薄血膜)
操作2 (慢染) 在量筒内量2ml蒸馏水或净水， 再 滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上， 染色30~40min。清水细缓冲洗，晾干镜检。
成批血片染色
将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染 液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升， 混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min （如染液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓 度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标 本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。
红细胞感染率计算法（薄血膜）
显微镜下（10目镜Χ100油镜）选择红细胞排列整齐密集，无重 迭的视野（ 约300红细胞/视野）
红细胞疟原虫密度按以下公式计算： 1.红细胞疟原虫感染率（%）计算
红细胞原虫感染率（%）= 疟原虫数 ÷计数的红细胞数X 100 2.红细胞疟原虫感染密度计算
红细胞疟原虫密度=红细胞原虫感染率X红细胞数/每微升血 （男性500万个/μl；女性450万个/μl）
●整个染色液配制时间不能少于5个小时
稀释吉氏原液
●原液需经缓冲液或净水稀释后，方可用 于厚薄血片染色。
●吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物 泛起影响染色效果.
吉氏染液浓度
门诊染色
操作1 （快染） 量筒内量2ml缓冲液或净水，直 接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的 厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾 干镜检。
质量好的染色 : 显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色
如果血片偏红,说明染液偏酸性 如果血片偏蓝,说明染液偏硷性
外观吉氏染色血片
偏酸 标准 偏碱
染色过程
血片干燥后, 用甲醇固定薄血膜 血片平置于染色板上 用吸管吸取已稀释的吉氏液约2ml于厚薄血 膜上，染色10 min 清水细缓轻轻冲去染液 置玻片于插板上，自然晾干
3. 如果能见到疟原虫，但是记数10000个红细胞时却 没有感染红细胞，那么设定感染率为＜１％
如何确定疟原虫血片为阴性
白细胞疟原虫密度计数法
● 在厚血膜按视野顺序，从看到第一个疟原虫开始计 数，记录200个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和 无性体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数 500~ 1 000 个。
● 白细胞疟原虫计算公式： 疟原虫数 ÷ 计数的白细胞数 × 患者每微升血白细 胞数 = 疟原虫数/μl血。
关于疟原虫检验技术
实验室技术
●分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是 确诊疟疾的“金标准” 仍然是血液显微 镜检查
●显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方 法
●厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代 的疟疾诊断的金标准
镜检技术—血片制作
厚薄血膜的制作
制作血片前，首先要核对患者的姓名和年龄
取血部位和血量
取血方法 采血部位：耳 垂或无名指，通常在耳垂 取血，先用75%酒精棉球 消毒取血部位，待酒精干 后，用左手拇指和食指紧 捏耳垂上方或无名指指尖， 右手持消毒针迅速刺入皮 肤，不宜过深或过浅。然 后用右手中指轻轻挤压出 血。厚血膜血量约一粒米 大小。
厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量 （相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片 接触，再由里向外一个方向旋转，转2~4圈，涂成 直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜。
薄血膜再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适 当远的地方.将采血玻片(推片)的边缘紧贴载玻片使 血液沿边缘散开(如图示).
正确的推片姿势
标准的疟疾厚薄血膜片位置
各种不同的疟疾血片涂制法：
标准血片
门诊发热病人血片 居民普查血片
厚薄血膜的标准
●厚血膜血量适宜，不宜过多或过少 ●薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列
红细胞疟原虫感染密度计算（薄血膜）
薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大 差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比 前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查 一个角落，应顺玻片的横轴检查。选择红细胞 排列整齐密集，无重迭的视野
镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫 虫期，不要笼统地记录为Pv或Pf。
半定量计数法
用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略 地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数 的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定 量分析。 国内常用。此方法将密度分为6级： 1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字 2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视 野不到1个虫，记录“少” 3.平均每个视野1~5个虫，记录“＋” 4.平均每个视野6~10个虫，记录“++” 5. 平均每个视野11~100个虫，记录“+++ ” 6. 平均每个视野100个虫以上，记录“++++ ”。
血片染色
两种染色方法: ●吉氏染色法 ●瑞氏染色法
常用吉氏染色法
吉氏染液(原液)的配置
吉氏染粉 (Azure B type) 5g
甘油 (纯)
250ml
甲醇 (纯)
250ml
●吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加边磨，直 至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加入少
许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中Βιβλιοθήκη Baidu再放入甲醇清洗，反 复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于 室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保存 时间越长染色效果越好。