第二章 分子图谱的构建与基因定位

3）蛋白质标记 ）
用作遗传标记的蛋白质分为酶蛋白和非酶蛋白。 酶蛋白 主要是指同工酶，是指具有相同催化功能而结构及 理化性质又不同的一类酶，可以通过电泳酶谱的差 异识别。 同工酶谱的差异可能是由不同的基因座引起的，也 可能是同一基因座上的不同的等位基因引起的。 同工酶已被用来标记某些重要的质量性状，而且还 用于标记某些复杂的数量性状。
RAPD标记的优点:对DNA需要量极少，对DNA 质量要求不高；操作简单易行，不需要接触放 射性物质；一套引物可用于不同生物的基因组 分析，可检测整个基因组。 RAPD标记的不足之处是：一般表现为显性遗 传，不能区分显性纯合和杂合基因型，因而提 供的信息量不完整；由于使用了较短的引物， RAPD标记的PCR易受实验条件的影响，结果的 重复性较差
随机引物PCR标记的特点是：其所用引物的核 其所用引物的核 苷酸序列是随机的，其扩增的DNA DNA区段是事先 苷酸序列是随机的，其扩增的DNA区段是事先 未知的。 未知的。 随机引物PCR扩增的DNA区段产生多态性的分子 基础是模板DNA扩增区段上引物结合位点的碱 基序列发生了突变。因此，不同来源的基因组 在该区段(座位)上将表现为扩增产物有无的差 扩增产物有无的差 异或扩增片段大小的差异。 异或扩增片段大小的差异。
非酶蛋白 用得较多的是种子贮藏蛋白，种子贮藏蛋 白在小麦、大麦、玉米和水稻上的研究工 作比较深入，如小麦种子贮藏蛋白中的醇 溶蛋白和谷蛋白占蛋白质总量的90%，是 极为重要的生化遗传指标。
蛋白质标记的优缺点
优点： 蛋白质是基因表达的产物；数量比形态标记丰 富；受环境影响小，能更好地反映遗传多态性； 已被广泛应用于物种起源和进化研究、种质鉴 定、分类和抗病性筛选等领域。 缺点： 每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术 需特殊的显色方法和技术； 需特殊的显色方法和技术 某些酶的活性具有发育和组织特异性 具有发育和组织特异性；局限于 具有发育和组织特异性 反映基因组编码区的表达信息；标记的数量还 反映基因组编码区的表达信息 比较有限。
通常DNA上存在大量的限制性内切酶酶切位点， 限制性内切酶能将很长的DNA分子酶解成许多长短 不一的小片段，片段的数目和长度反映了DNA分子 上限制性酶切位点的分布。 特定的DNA／限制性内切酶组合所产生的片段是 特异的，它能作为某一DNA(或含有该DNA的生物) 的特有“指纹”，这种“指纹”在DNA分子水平上 直接反映了生物的遗传多态性。
利用单拷贝的基因组DNA克隆或cDNA克隆作为探针， 通过Southern杂交技术才能检测。 原因？ 由于植物基因组很大，某种限制性内切酶的酶切位点 很多，经酶解后会产生大量大小不一的限制性片段， 这些片段经电泳分离形成的电泳谱带是连续分布的， 很难辨别出某一限制性片段大小的变化。 优缺点： 共显性、信息完整、重复性和稳定性好。 应用放射性的Southern杂交技术；耗时费力。
4)DNA标记 4)DNA标记
DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的 直接反映。DNA水平的遗传多态性表现为 核苷酸序列的任何差异。 DNA标记在数量上几乎是无限的。与以往 的遗传标记相比，DNA标记无表型效应、 不受环境限制和影响。
理想的DNA标记应具备以下特点： （1）遗传多态性高。 （2）共显性遗传，信息完整。 （3）在基因组中大量存在且分布均匀。 （4）选择中性（即无基因多效性）。 （5）稳定性、重现性好。 （6）信息量大，分析效率高。 （7）检测手段简单快捷，易于实现自动化。 （8）开发成本和使用成本低。
分子图谱的构建与基因定位 第三章 分子图谱的构建与基因定位
主要内容: 一、遗传标记概述 二、DNA分子标记的开发 三、分子图谱的构建 四、质量性状基因的分子标记定位 五、数量性状基因的分子标记定位 六、分子标记辅助选择
一、遗传标记概述
遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征 遗传标记的本质？ 经典遗传学中遗传多态性指等位基因的变异，现代遗 传学中遗传多态性指基因组中任何座位上的相对差异 作用？ 1）遗传学研究：连锁分析、遗传作图、基因定位与 克隆；物种进化与亲缘关系。 2）动植物育种：目标性状的追踪选择；转基因；品 种的DNA指纹。
SSR多态性 SSR多态性 分析示意图
SSR 座 位 及 引 物 序列开发示意图
STS标记 STS标记
序列标定位点(Sequence-tagged Sits，STS) STS标记是根据单拷贝的DNA片段 单拷贝的DNA片段两端的序列， 单拷贝的DNA片段 设计一对特异引物，扩增基因组DNA而产生的 一段长度为几百bp的特异序列。 STS标记采用常规PCR所用的引物长度，因此 PCR分析结果稳定可靠。 RFLP标记经两端测序，可转化为STS标记。 STS在基因组中往往只出现一次，从而能够界 定基因组的特异位点。
(2)特异引物的PCR标记
所用的引物是针对已知序列的DNA区段而设计的，具 有特定核苷酸序列，引物长度通常为18—24核苦酸。 根据引物序列的来源，主要可分为SSR标记、SCAR标 记、STS标记及RGA标记等。
SSR标记
Simple Sequence Repeats，SSR SSR的基本重复单元是由2-6个核苷酸组成的，重 复次数一般为lO-50，由于基本单元重复次数的 不同，而形成SSR座位的多态性。 每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列， 可根据两侧序列设计一对特异引物来扩增SSR序 列。 SSR标记的最大优点是具有大量的等位差异，多 态性十分丰富。但是，SSR标记必须依赖测序设 计引物，开发成本高。
(2)VNTR标记技术 (2)VNTR标记技术
小卫星或微卫量标记 依据？ 可变串联重复序列(Variable Number of Tandeபைடு நூலகம் Repeats，VNTR)。 通常将以15-75个核苷酸为基本单元的串联重复序 列称为小卫星 小卫星(minisatellites)，以2-6个核苷酸 小卫星 为基本单元的简单串联重复序列称为微卫星 (microsatellites)或简单序列重复(SSR)。
第三类为基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记 第三类为基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记。 PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记。 分二种：一种是通过对限制性酶切片段的选择性扩增 限制性酶切片段的选择性扩增来 限制性酶切片段的选择性扩增 显示限制性片段长度的多态性，如AFLP标记。另一种是 通过对PCR扩增片段的限制性酶切 扩增片段的限制性酶切来揭示被扩增区段的 扩增片段的限制性酶切 多态性，如CAPS标记。 第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记 第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记。如SNP标记。 DNA标记。 它是由DNA序列中因单个碱基的变异而引起的遗传多态 性。目前SNP标记一般通过DNA芯片技术进行分析。
ISSR标记
简 单 序 列 重 复 间 区 (Inter-Simple Sequence Repeats, ISSN)标记技术检测的是两个SSR之 间的一段短DNA序列上的多态性。主要是对两 个相距较近、方向相反的SSR序列之间的DNA区 段进行扩增。 ISSR技术所用的PCR引物长度在20个核苷酸左 右，大多数ISSR标记所用PCR引物是基于双核 苷酸重复序列的。 稳定性比RAPD好。ISSR标记呈孟德尔式遗传， 具显性或共显性特点。
2、DNA标记技术 DNA标记技术
1）、基于DNA—DNA杂交的DNA标记 ）、基于DNA DNA杂交的DNA 基于DNA DNA杂交的DNA标记
(1)RFLP标记技术 RFLP 即 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (Restriction Fragment Length Polymorphism)。这种多态件是 由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生 突变引起的。 限制性内切酶是一种能识别DNA上特定碱基组成 的序列并在这些序列位点上切断DNA分子的酶。
3）、基于限制性酶切和PCR的DNA标记
以限制性酶切和PCR技术为基础、将两种技术 有机结合的DNA标记，主要有两种： （1）一种是先将样品DNA用限制性内切酶进行 酶切，再对其酶切片段有选择地进行扩增，然 后检测其多态性，这种标记称为AFLP标记。 （2）另一种是先对样品DNA进行专化性扩增， 再用限制性内切酶对扩增产物进行酶切检测其 多态性，称为CAPS标记。
4)、基于单个核苷酸多态性的DNA标记
SNP 即 单 核 苷 酸 多 态 性 (Single Nucleotide Polymorphism)，是指同一位点的不同等位基 因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、 缺失等。 从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测， SNP标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。 人类基因组大约每1000bpSNP出现一次，已有 2000多个标记定位于人类染色体上，对人类基 因组学研究具有重要意义。 检测SNP的最佳方法是DNA芯片技术，SNP被 称为第三代DNA分子标记技术。
玉米中利用B-A易位系，水稻中利用易位系， 小麦中利用端着丝粒染色体，棉花中利用易位和 单体等非整倍体已成功将许多质量性状定位于染 色体上。 染色体结构和数目变异常具有相应的形态学特 征，在多倍体植物中广泛用于基因定位研究。 缺点：难以获得 难以获得；某些物种对结构和数量变异 难以获得 的耐受性差；常伴有对生物有害的表型效应。
DNA标记可分为四大类： DNA标记可分为四大类： 标记可分为四大类 第一类为基于DNA DNA杂交的DNA标记 第一类为基于DNA DNA杂交的DNA标记。其中最具代表 为基于DNA—DNA杂交的DNA标记。 性的是发现最早和应用广泛的RFLP标记。 RFLP标记。 RFLP标记 第二类为基于PCR 的 DNA 标记 。 根据所用引物的特点， 标记。 第二类为基于 PCR的 DNA标记 PCR 这类DNA标记可分为随机引物 PCR 标记 随机引物PCR 标记，如RAPD标记， 随机引物 PCR标记 特异引物PCR标记，如SSR标记。 和特异引物PCR标记 特异引物PCR标记 随机引物? 特异引物? 随机引物 特异引物
1、遗传标记的种类 、 1）形态标记 ）
指能明确显示遗传多态性的外观性状或经简单测 试即可识别的生理特性、抗病虫性。 形态标记材料多数仅带有一个标记基因，少数带 有多个基因。水稻、玉米、大豆等作物形态标记。 形态标记基因的染色体定位一般是通过二点、三 点测验进行的。 缺点：标记数量少 标记数量少，可鉴别的基因有限，难以建 标记数量少 立饱和的遗传图；易受环境因素的影响 易受环境因素的影响。 易受环境因素的影响
随机引物PCR标记通常是显性的，即表现为扩增 产物有无的差异。但有时也会表现为共显性，即 扩增片段大小的差异。 常用的随机引物PCR标记主要有可分为RAPD、 AP-PCR、DAF、ISSR等
显性标记
共显性标记
RAPD标记 随机扩增多态性DNA( Random Amplified Polymorphism DNA,RAPD) RAPD标记所用的引物长度通常为9-10个碱 基，大约只有常规的PCR引物长度的一半。 使用这么短的PCR引物是为了提高揭示DNA 多态性的能力。
小卫星序列太长，无法通过PCR扩增获得满意 的结果 因此，仍需利用DNA Southern杂交和放 射性标记探针来检测。 微卫星序列常常比较短、利用PCR扩增可以获 得满意的检测效果。
2）、基于PCR技术的DNA标记 ）、基于PCR技术的DNA标记 基于PCR技术的DNA (1)随机引物的PCR标记 随机引物的PCR (1)随机引物的PCR标记
2）细胞学标记 ）
指明确反映遗传多态性的细胞学特征，主要包括 染色体的结构和数量特征。 染色体结构特征 包括染色体的核型和带型。核型反映染色体的缺 失、重复、倒位和易位等遗传变异；带型反映染 色体上常染色质和异染色质的分布差异。 染色体数量特征 包括整倍性和非整倍性的变异，如多倍体、缺体、 单体、三体等。