扫描电镜细菌制样方法

细菌样品前处理

取液体或固体培养基中培养20h 左右、旺盛生长的菌体。

(1) 收集菌体：①液体培养基中的菌体，可取培养液8000rpm离心3~5min,弃上清,倒入

2.5%戊二醛固定液; ②固体培养基上的菌体,可在菌落表面滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落(注意不要刮下培养基)。将菌液吸入小离心管,离心后换入新鲜戊二醛固定。

(2) 固定，脱水按常规方法。2.5%戊二醛,2~4h T磷酸缓冲液清洗3次-1%我酸4~6h-缓冲液清洗3次—乙醇梯度脱水，30%,50%,70%,85%,95各一次，100%乙醇2次,15~20min/次—乙酸异戊酯置换2次,20min/次(注意:每步均需离

心,8000rpm,3~5min,弃上清，倒入下一种试剂滴管来回吸几下，打散菌块)。

(3) 临界点干燥：普通定性滤纸裁成35mm X 18mm的纸条，将长边35mm平均分成 3 份,对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状。将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用钉书器将另一端钉牢。放入临界点干燥器样品室,进行CO

2 临界点干燥。一般每次可同时处理10~20种不同菌样(注意,需用液态CO2 置换2~

3 次)。

(4) 离子溅射金:沿两端书钉剪开滤纸包,将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿,轻

摇尽量分散菌体。碳导电胶带一面粘在1/4 盖玻片上,另一面倒扣轻压在菌体粉

末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。离子溅射金后,即可进行扫描电镜观察。

细菌样品特殊制备方法；

1 ，固体培养基中的菌体

用镊子夹一小块盖玻片，轻轻放在旺盛生长的菌体上，粘附一定的细菌。然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁，在棕色瓶内加入适量1%锇酸，盖上含有样品的瓶盖，熏蒸固定2h 以上。然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金，进行扫描电镜观察。

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2，液体培养基中的菌体

取一定的培养液，8000rpm离心3~5min,弃上清液，加入2.5%戊二醛固定2h, pH7.2磷酸盐缓冲液清洗，然后加入蒸馏水稀释，充分混合后用滴管取混合液一滴于小块盖玻片上，吸附2mi n，用滤纸吸去多余溶液。然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁,在棕色瓶内加入适量1%锇酸,盖上含有样品的瓶盖，熏蒸固定2h 以上。然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金，进行扫描电镜观察。

0.2M 磷酸缓冲液的配制：

磷酸二氢钠( NaH

2PO

4.2H

2O)2.94 克

磷酸氢二钠( Na

2HPO

4.12H

20) 29 克

纯水500mL

pH 调至7.4

2.5%戊二醛固定液的配制：

25%戊二醛10mL

双蒸馏水40mL

0.2mol/L 磷酸缓冲液50mL

戊二醛最终浓度 2.5%

2/ 3

pH 值7.3-7.4

3/ 3