染色体畸变实验

实验十染色体畸变试验

可用末梢血淋巴细胞，或人和哺乳动物体细胞系作为材料，常用的体细胞系有中国地鼠卵巢细胞（CHO），中国地鼠肺成纤维细胞（V79和CHL），人胚肺2倍体成纤维细胞等。这里介绍外周血淋巴细胞为对象的染色体畸变的试验方法。

1．实验原理

外周血中小淋巴细胞几乎都处在细胞增殖周期的G1期或G0期（不同于体外培养的体细胞），一般条件下是不会再分裂的。当在培养物中加入适量的PHA，在37℃下，经52～72h 的培养，淋巴细胞开始转化，进入细胞增殖周期，此时可获得大量的有丝分裂的细胞。再经过秋水仙素处理，低渗、固定，即可在显微镜下观察到良好的中期染色体分裂相。电离辐射，化学有害物质作用于机体或体外细胞，均可引起细胞染色体的损伤，且与剂量（浓度）呈良好的线性关系。因此，染色体畸变已用于电力辐射事故的生物计量估算。

2．方法与步骤

（1）试剂

①RPMI-1640培养液，含20%小牛血清。

②肝素：每支含肝素12500U，使用时用生理盐水配成500U/ml，4℃冰箱内保存备用。

③秋水仙素：配成40ug/ml浓度。称取秋水仙素4mg，溶解于100ml 0.85%Nacl 溶液中，经6号细菌漏斗过滤，4℃冰箱内保存。使用时吸取0.05或0.1ml加入到5ml细胞培养物中，其终浓度为0.4～0.8ug/ml。

④双抗：青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml。

⑤PHA:PHA为冰干注射剂（广州生产）每支10mg，使用时用2ml生理盐水溶解。

⑥KCl低渗液：KCl 1.88g，双蒸水1000ml使之溶解，其浓度为0.025M.

⑦冰醋酸甲醇固定液：冰醋酸1份，甲醇3份，混合而成。

（2）细胞培养

常规细胞培养。

（3）受试物的处理

实验分组：至少设立五个组，即阳性对照、阴性（溶剂）对照及三个剂量组。最高剂量

和最低剂量之间相差10倍，中间再设一个剂量，阳性对照物为已知的染色体断裂剂，如丝裂霉素C(MMC)，剂量为0.02μg/ml；黄曲霉素毒素B1，浓度为10-6M等。每组中应设2～3个平行样品。

（4）操作步骤

①收集细胞：经受试验处理的细胞，培养开始后52～72h收集细胞。依不同受试物而有所差异。

②加入秋水仙素：培养终止前于培养物中加入40μg/ml秋水仙素0.05-0.1ml，终浓度为0.4～0.8μg/ml，37℃下培养4h。

③低渗处理：小心取出细胞培养物，弃去上清液，细胞沉淀在瓶底（体细胞须经胰酶消化），加入8ml KCl低渗液，用滴管轻轻吹打制成细胞悬液，移入10ml刻度离心管中，37℃下处理20min。

④离心：1000转/min，离心7～10min，弃去上清液，收集细胞，加入Hanks液。

⑤固定：加入1：3冰醋酸甲醇固定液3ml预固定，用滴管轻轻吹打，立即离心，收集细胞，再加入10ml上述固定液，处理15min，反复操作两次，每次15min。

⑥制片：弃去固定液，再加入适量新鲜固定液，混匀。取出预冷的载玻片，每片滴加1～2滴细胞悬液，用嘴轻轻吹散，或用滴管吸取少许细胞悬液，在40～50㎝高度上对准下面玻片滴加悬液，以冲力使细胞分散。自然干燥或用微热电吹风机吹干，也可在酒精灯火焰上略加烘烤。此时可在显微镜下检查有无分裂相细胞。

⑦染色：用Giemsa 染液染色15min，用自来水轻轻冲洗残留染液，待干。

⑧镜检：先在低倍镜下寻找分散良好的分裂相细胞，然后用高倍镜或目镜观察，进行染色体畸变计数，分析，分别记录染色体畸变细胞数及各种类型染色体畸变细胞数，选择良好的典型的染色体畸变图进行显微照相。

（5）结果表示

①染色体总畸变率及畸变率：

总畸变率（%）=各种畸变类型数/分析总细胞数×100

畸变率（%）=染色体畸变数/染色体总数×100

②畸变类型分析：包括断片（F）、双着丝粒（D）、环（R）、互换（E）等，电力辐射常见断片、双着丝粒、环等，而化学毒物常见单体断裂。

（6）注意事项

①接种的血样要新鲜，如不立即培养，应放在4～25℃温度下，于24h内作培养。

②培养箱温度以37±5℃为宜。

③培养过程中如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻震荡，使凝块散开，然后继续培养。

④如低渗处理不当，染色体聚集一团，可将固定时间延长数小时或过夜，热低渗过度，往往细胞全部破碎，造成染色体丢失。

⑤离心速度过快，细胞团不易打散，速度过低，则使分裂相细胞大量丢失。

⑥玻片要严格清洁，使细胞均匀铺开。

人类染色体图谱