活性氧

活性氧的检测及生理机制

摘要当植物所生长的外界环境如温度、湿度、土壤中的水分发生改变时植物体内会产生大量的活性氧，使作物遭到严重的损伤，即环境胁迫使植物体积累大量的活性氧，从而使植物严重损伤。在本文中主要介绍了活性氧的测定方法、生理机制及对环境胁迫所产生的影响进行了具体的阐述。

关键词活性氧（ROS）环境胁迫

1活性氧的定义

人类发现活性氧已有100年的历史了，在距离地球表面15—25公里的高空，因受太阳紫外线照射的缘故，形成了包围地球外围空间的活性氧层，这厚厚的活性氧层正是人类赖以生存的保护伞。活性氧又名三原子氧，因其类似鱼腥味的臭味而得名。其分子式为O3，是氧气的同素异形体，具有它自身的独特性质：在自然环境下，它是淡蓝色的气体；具有很强的氧化能力，是已知最强的氧化剂之一；正常情况下，极其不稳定，容易分解为氧气；在空气中的半衰期一般为20—50分钟，随温度与湿度的增高而加快。活性氧是一种强氧化剂，具有广泛杀灭微生物作用，包括细菌、芽胞、病毒、真菌等，其杀灭速度较氯快600—3000倍。

2活性氧的检测

活性氧本身具有多样性及不稳定性，这就为活性氧的检测增加了复杂性。通过研究，研究者们使用各种各样的方法和仪器去检测ROS在生物细胞内的影响，反映了ROS在调节细胞行为的许多方面增加的证据支持一个中心的角色。其中的一些方法可以用于记录ROS和体内氧化损伤。早期的关于ROS在发育中扮演的角色的研究是基于具有氧化还原敏感性的发色体物质的使用，尽管一般的荧光探针在用于荧光检测的方法中广泛使用。大量的对于ROS水平敏感的ROS探针的一直在增加。在检测细胞ROS过程中，要考虑到探针对于检测过程中的ROS 最佳特异性、保证细胞状态及荧光试剂的检测特异性。最广泛应用的荧光探针，应该是与一定范围内的ROS相反应而使其能够被检测得到，如果要检测某一种ROS，这种方法是不可行的。DCFH是目前应用最为广泛的荧光感受器检测ROS，用于在体外检测活性氧。DCFH是不具有荧光的，但是它可以被羟基、二氧化氮和过氧化氢等自由基氧化生成具有荧光的二氯荧光素（DCF）。尽管DCFH不是直接对过氧化物和超氧化物敏感，但是在目前的过氧化氢分解机制中，比如过渡金属离子和氧化物酶，基础的中间物质与DCFH反应产生DCF。由于产生的荧光物质可以被光所分解，因此在荧光检测的时候一定要严格控制检测条件。

3活性氧的生理机制[4]

ROS是生物体内的氧自由基，包括氧和含氧的高反应活性分子( 如超氧化物阴离子、组织过氧化物和自由基等)、作为细胞内和细胞间的第二信使ROS调节许多信号分子。ROS主要来源于线粒体，是线粒体由状态III向状态IV转换中高氧的环境和高还原态的呼吸链使大量电子漏出并还原氧分子而形成。Lewen 等［1］在小鼠缺血缺氧细胞模型中证实有ROS 的产生，ER腔内蛋白被氧化修饰，

因此ER可能是ROS攻击的重要目标之一。近有研究，ER上ROS的产生是通过NADH －细胞色素P450 还原酶将电子传递给O2 形成阴离子，在NADH的辅助下，核膜上的电子传递链将电子传递给O2，便产生了ROS，ROS的产生与清除之间的平衡对维持细胞的氧化还原状态非常重要，细胞内氧化还原状态的改变促进了氧自由基的产生和凋亡诱导因子的激活，致使细胞凋亡的同时又加剧了细胞内氧化还原状态的改变，进而影响细胞的生理状态，启动了氧化应激，触发细胞凋亡信号的激活。内质网的主要功能就是通过折叠酶和分子伴侣的作用使新合成的蛋白达到正确的折叠构象并有效的进入分泌途径，为蛋白的折叠提供一个独特的氧化环境生理情况下，介导UPR产生的3个ERS感受蛋白PERK ATF6 IRE1，分别与ER分子伴侣GRP78(glucose- regulated protein78)结合处于无活性状态ROS可以直接攻击维持蛋白折叠酶活性所必须的游离巯基，使得ER腔内蛋白质被氧化修饰，进而诱导ER折叠酶或分子伴侣的功能异常而引起未折叠蛋白的积累，并滞留于ER腔内触发了ERS，与此同时ERS标志性分子伴侣蛋白GRP78的表达明显增加并从3种跨膜蛋白上解离，转而去结合未折叠蛋白，以增强ER蛋白质折叠能力，减少蛋白质在ER的堆积与GRP78解离后的ERS感受蛋白随之被激活进而触发了UPR的产生，并通过限制非折叠蛋白的合成，加强ER对蛋白的折叠能力，加速非折叠蛋白的降解等方式减轻了ER的负荷压力，触发了其各自诱导的促生存响应。

4环境胁迫对活性氧的影响

环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧。从而导致蛋白质、膜脂、DNA 及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX) 等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物。

4.1活性氧造成的氧化损伤

当环境胁迫长期作用于植株，使其产生的活性氧超出活性氧清除系统的能力所及时就会产生氧化损伤。活性氧可以攻击蛋白质的氨基酸残基，尤其是Tyr、Phe 、Trp 、Met和Cys。形成羰基衍生物[2]此外，活性氧可以促进分子内和分子间的交联如二硫键的形成和蛋白质的断裂，超氧化物可使一些古金属的酶类失活，或产生羟自由基，引发磷脂的过氧化。1umo l／L的双氧水可以抑制碳固定。在l umo l／L 的低浓度下。它可使卡尔文循环中的一些巯基酶类失活最主要的是双氧水能够通过相应的反应产生更活跃、更有毒性OH，从而导致膜脂过氧化、碱基突变、DNA链的断裂和蛋白质的损伤。[1]氢氧根修饰一些蛋白质使它们对蛋白水解酶的作用更敏感，一旦被破坏，蛋白质就会进一步被肽链内切酶阵解，已发现在类囊体的膜上存在这样的酶此外，一种具有多种催化功能的蛋白酶复合体已在哺乳动物和植物中被证实其具有选择性地降解活性氧所破坏的蛋白质。

4.2活性氧的积极作用

虽然活性氧对植物细胞有很强的毒害作用，但在有些代谢过程中它却能被有效利用；①当病原体侵染植物后，细胞内的活性氧水平迅速提高，从而导致过敏细胞死亡：②活性氧参与细胞壁中富含羟脯酸的糖蛋白交联过程，这也有利于抵御病原体侵入细胞③活性氧很可能作为第二信使调控抗病相关基因的表达并启动植物抗毒素合成基因的转录。[3]