植物细胞的固定化培养

第１７卷第２期浙江：ｈ＂－Ｙ－学院学报！！！！篓！旦！！！塑！！！！三！墅！竺！些竺！墅丝！些！垒植物细胞的固定化培养王素芳（浙江万里学院。

宁波３１５１００）ｖ。

１．１７Ｎｏ．２Ａｐｒ２００４摘要；植物细胞培养己成为生产医药、食品、化妆品等重要化台物盯‘条新途径．在提高次级代谢物产龋的研究中，崮定化培养逐步硅示其优势文章重点介绍了崮定化培养的特点、固定化疗法、固定化反麻器和产物的释放四个方面的内容关键词：物细胞：固定化培养：固定化方法；产物释放；同定化反应器中田分类号：Ｑ８１３Ｉ“文献标识码：Ａ文章编号：１６７Ｉ－－２２５０（２００４）０２一００９６一０３收稿日期：２００３一ＩＩ－－０５作者镝介：于素芳，浙江万里学院生物与环境学院讲师．１９０２年．Ｈａｂｅｆｌａｎｄｔ在营养液中成功地培育了单个植物细胞，为植物细胞的培养翻开了新的一页．随厉，很多科学家对完善植物细胞培养技术展开了研究．１９７９年，Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓ首次将高等植物细胞同定化培养以获得甘的次级代谢产物．此后，植物细胞的同定化培养得到不断的发展．逐步显示其优势．据币完全统计．约有５０多种植物细胞已成功地进行了固定化培养．１固定化培养的特点经过多年的研究发现，与悬浮培养相比，固定化培养具有很多优点：（１）提高了次生物质的合成、积累；（２）能跃时间保持细胞活力：（３）可以反复使用；（４）抗剪切能力强；（５）耐受有毒前体的浓度高；（６）遗传性状较稳定；（７）后处理难度小等特点．在近几年的研究巾，不少学者又发现了固定化培养的新优点．１．１更好的光台作用一般情况下。

由于在固定化细胞团中形成了光密度梯度，内部的细胞有了较好的生长，所以固定化有助于植物细胞的光台作用Ｋｕｒａｔａ等培养用海藻钙凝胶固定阿拉伯咖啡细胞，发现生物碱产量与光密度的变化一致，而且细胞的生长小被高的光密度抑制．１．２促进或改变产物的释放在固定化培养中，产物和对细胞生Ｋ有抑制作用的代谢物可被培养基带走，这样，一方面有利于产物的生成，另一方１：５【『也防ｆ』：了已生成产物的进一步降解转化．Ｓｈｉｂａｓａｋｉ．ＫｉｔａｋａｗａＮ等…实验证明烟草细胞的固定化促进了其产物酚醛塑料（ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ）的释放．而ＧｉｌｌｅｔＦ和ＲｏｉｓｉｎＣ等““发现包埋的烟草细胞（Ｎｉｅｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）和Ｓｏｌａｎｕｍａｖｉｃｕｌａｒｅ，能够将在悬浮培养时１ｉ释放的异东莨糟酵（Ｓｃｏｐｏｌｉｎ）释放到培养基中．２固定化方法２．１传统固定化方法包埋法是目前最普遍采用的固定化方法．特别是海藻胶包埋法，条件温和、价格便宜、方法简单，且特别适用于脆弱、敏感的植物细胞“’．吸附法ｉ乜是一种比较温和的同定化方法。

但不如包埋法在植物细胞周定化成用广泛．另外还有菇价结合法和多孔载体固定等多种方法．目前．有关传统固定化方法的研究报道比较多．寻找低毒性、高强度、高孔隙率载体及通用载体的改善与研究和已有同定化技术的有效利用及其改进是研究的重要方面”“１．如王克明“…就用海藻酸钠和聚乙烯醇（ＰＶＡ）混台的双载体包埋中国红豆杉细胞，建立合适固定化条件．２２膜法植物细胞附着在玻璃、金属、术屑、海藻盐表面生长，形成的一定厚度的生物膜为宝ｌｉ｜胞的生长和次生代谢产物的合成提供了近似天然的良好条件．在有些固定化培养过程中，细胞以生物膜的形式在凝胶珠上生长，使细胞具有固定化和膜法培养的双重性质，一般能得到较高细胞生睦最和产品产率．将、｝透膜做成培养袋．然后将植整！塑墨查茎！垫竺塑堕塑里塞些些查！！物细胞放入其中培养，也取得较好的效果．２．３细胞自固定植物细胞自生固定化培养是近几年来才发展起来的一项培养技术．利用植物细胞具有聚集成团的特性．将愈伤组织细胞进行液体培养，或通过选择合适的激素配比，使悬浮培养的植物细胞自动聚集成具有一定分化程度的大颗粒，再进行悬浮培养．植物细胞的自生固定化可以免去人工载体的使用，但它仍具有人Ｔ固定化细胞培养次生代谢物含量高的特点，而且与人工固定化相比细胞生长快．目前，已经有一些植物建立了这种质地致密的愈伤组织颗粒培养系统。

如鸟摘、烟草、高山红景天和烟草细胞等．３固定化反应器３．１传统固定化反应器传统的同定化培养对生化反应器没有特殊的要求，一般，将细胞填充到生物反应器即可典犁的同定化反应器为填充床和巾空纤维反应器混合良好升气式反应器和流化床亦可用作固定化反应器．目前。

对传统固定化反应器的研究主要集中在其部件、性能、操作方式等方面的改进上，使其具有更小的剪切力、更易丁操作、更适于中试及工业化生产等性能．３２膜固定化反应器膜固定化细胞反应器足近年广泛使用的一种新型高效生物反应器，它能把报高密度的细胞进行均相固定化，使细胞免受剪切力损伤：同时能进行产物的原位分离，消除了抑制效＿Ｉ衄．固定化方法简便温和，易于放大．便于连续操作，反应器生产率高．１９９０年，Ｌａｎｇ等就曾用平盘结构的膜反应器中进行植物细胞培养．将细胞同定在聚丙烯薄膜上，培养基在膜下循环流动，细胞从渗透过膜的培养基获得营养，从周围的气柏巾获得氧气，分泌的次级代谢物透过膜扩散至培养基．近几年．有关学者又做了膜法培养系统巾细胞膜的合适厚度，不同细胞适用的膜材料以及促产物释放方法等方面的研究．“”此外，中空纤维反应器实际上也属于膜反应器．３．３自固定化反应器自生固定化细胞培养中，白絮凝细胞颗粒对生物反应器的设计有着特殊的要求．臼絮凝细胞颗粒形状不规则，大小呈一定分布，川性较荒，容易变形，不耐剪切，只有在生物反应器巾实现均匀悬浮才能有效地进行代谢产物地合成．冈此开发适宜生物反应器并解决放大问题足白生同定化细胞培养的另一个关键问题，也是固定化反应器研究的一个分支４产物释放的促进固定化培养系统仪适合于产物分泌到细胞外的情景，而植物细胞的次级代谢物大多数存在于液泡内，释放量很少或根本小释放，因此限制了固定化技术在工业上的应用．经过许多研究者的不懈努力，目前已建立起一系列的研究方法，取得了可喜的成绩．４．１传统方法一化学法在细胞培养液中加入有机溶剂，能增加膜的透性，提高次级代谢产物的分泌但膜透性的增加影响细胞活性，因而限制了其在工业上的应用．渗透压的提高也可以促进产物的外泌．除甘露醇、山梨醇等有机物常被用作有机渗透剂外．Ｔａｎａｋａ等还发现培养基中高的离子强度也能促进长春花细胞中酶的释放．而且细胞的活性在一定范围ｐｊ保持不变．添加诱导剂更足一种促进产物释放的好办法．因为诱导剂不仅可以促进植物细胞次级代谢产物的合成及释放，还能保持细胞结构的完整㈣．如Ｋ．ｉｍ等㈣用聚乙一二醇处理胡萝ｔ－发状根，使酶的释放量增加了５倍．对细胞膜无损伤余龙江等［６１发现，从红豆杉树皮中分离出的真菌培养物做诱导物能限制固定化红豆杉细胞生长，且明显促进紫杉醇合成，并诱导紫杉醇分泌到培养液巾４．２ｐＨ扰动法一些次级代谢物是与Ｈ＋通过对运方式跨膜传递的．当培养基中Ｈ＋浓度升高，即ＤＨ值降低时，就会促使次级代谢物向胞外运输，而Ｈ＋向胞内运输．如适当降低培养基中的ｐＨ值，可有效提高高山红景天细胞释放红景天甙．“”４．３重组法细胞代谢产物的跨膜运输方式与载体蛋白的作用有关．因此可以通过操纵载体蛋白从分子水平实现对物质转运的控制．利用重组分子技术将转运蛋白从液泡膜移到细胞膜，将原来贮存于液泡的代谢物分泌出来．“５’这种重组植物细胞便于工业规模的大量培养，有望在植物细胞同定化中会发挥重要的作用．但目前．还只限于少数几种物质．４．４两相培养法在有少角产物释放的培养基中，加入颗粒性的活性炭或非离子吸收树脂，能较好的从培养基中移除产物，从而达到刺激产物合成与分泌的目的．Ｒｏｂｅｒｔ等在Ｐａｐａｖｅｒｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ细胞培养中，加入诱导剂壳聚糖并用大孔树脂进行两相培养，生物量从只加诱导剂的塑－浙兰互兰兰堕鲎坚！！！！竺！旦２ｌｉｎｇ・ｇ－１干重增加到３９ｍｇ・９１干重，血根碱的释放也从只加诱导剂的３０％～６０％增加到５０％～８０％．由此可见，将加诱导剂与两相培养相结合，可以取得更好的效果．固定化植物细胞培养技术的发展为工业化生产植物性天然药物开辟了一条新途径，但仍处于发展阶段．要进入工业化生产有许多问题尚待解决固定化方法的完善、产物的释放以及如何控制同定化细胞处丁１ｉ分裂状态等都是关键性的．易污染、操作技术难度大、接种量大造成的成本高和反应器的设计不成熟等也限制了植物细胞固定化培养的进一步应用．随着固定化培养的深入研究，各种限制因素的逐步解决，会有越来越多的次级代谢产物通过嗣定化培养进行生产．参考文献［１］Ｓｈｉｂａｓａｋｉ－ＫｉｔａｋａｗａＮ，ｌｉｚｕｋａＹ．ＹｏｎｅｍｎｔｏＴ．ＣｕｌｔｕｒｅｓｏｆＮｉｃｏｔｌａｎａｔａｂａｃｕｍｃｅｌｌｓｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｉｎｃａｌｃｉｕｍａｌｇｉｎａｔｏｇｅｌｂｅａｄｓｃｏａｔａｄｗｉｔｈｃｅｌｌ—ｆｒｅｅｇｅｌｆｉｌｍ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｈｅｍｉｃａｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｊａｐａｎ２００１，３４（１１）：１４３ｌ・１４３８．（２］ＧｉｌｌｅｔＦ，Ｒｏｉｓｉｎｃ，ＦｌｉｎｉａｔＬｘＭＡ。

ｅｔａ／．ＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｅｕｍｐｌａｎｔｃｅｌｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓｗｉｔｈｉｎｃａｌｃｉｕｍａｌｇｉｎａｔｓｇｅｌｂｅａｄｓｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｅｎｈａｎｃｅｄａｍｏｕｎｔｓｏｆｓｅｏｐｏｌｉｎ［Ｊ］．ＥｎｚｙｍｅａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０００，２６ｆ２＿４）：２２９－２３４．［３］ＲｏｉｓｉｎＣ．ＧｉｌｌｅｔＭａｎｃｅａｕＦ，ＳａｕｃｅｄｏＪＥＮ．ＥｎｈａｎｃｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｃｏｐｏｌｋｔｂｙＳｏｌａｒｉｕｍａｖｉｃｕｌａｒｅｃｅｌｌｓｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｄｗｉｔｈｉｎＣａ－ａｌｇｉｎａｔｅｇｅｌｂｅａｄｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｃｅｌｌｒｅｐｏｒｔｓ１９９７．１６（５）：３４９－３５３．［４］ＢｏｄｅｕｔｓｃｈＴ．］ａｍｅｓＥＡ，ＬｅｅＪＭＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｐｌａｎｔｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｃｅｌｌｒｅｐｏｒｔｓ２００１，２０（６）：５６２ｒ５６６．［５］袁丽红，钱士辉，细胞橱定化条ｔ＇Ｌ－对紫草细胞生产紫草色素的影响［Ｊ］南京化工大学学报１９９９。

２１（２）４４—４８．［６］余龙江，李为，刘幸福，等・ｐ孱红豆杉悬浮细胞吲定化培养生产紫杉醇［Ｊ］华Ｉ＿｛＿｜理工大学学撒．１９９８．２６（５）：ｌｄ［７］王洪柞．李世勇酶和细胞的同定化［Ｊ］．化学通报，１９９７．２：２２－－２７．［８］ＣｈａｄｃｔＳ，ＧｉｌｌｅｔＦ，ＶｉｌｌａｒｒｅａｌＭＬ，ｅｔａｌＩｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｌｏｎｏｆＳｏｌａｎｕｍｃｈｒｙｓｏｔｒｉｃｈｎｍｐｌａｎｔｃｅｌｌｓｗｉｔｈｉｎＣａ－ａｌｇｉｎａｔｅｇｅｌｂｅａｄｓｔｏｐｍｄｕｃｅａｎａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓｐｉｒｏｓｔａｎｏｌｓａｐｏｎｉｎ［Ｊ］ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０００，３８（１”８７５－８８０．［ｇ］Ｓｈｉｂａｓａｋｉ・ＫｉｔａｋａｗａＮ．：ｉｚｕｋａＹ。