第五章核酸的分离纯化
核酸的分离与纯化
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多 糖、脂肪等生物大分子分开。 在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保 证核酸一级结构的完整性；二是尽量排除 其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
2018/7/20
2
核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料 的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大 分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的 浓缩、保存等几个主要步骤。 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联 合实现。
34
2018/7/20
5. 质粒DNA的纯化
（1）聚乙二醇沉淀法 质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子 RNA，并用RNase消化小分子RNA；然 后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大 的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。
2018/7/20
35
（2）柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。 树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来 纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附 的相互作用进行纯化。 以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是 在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合 来进行纯化。通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附 到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖 类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA 分子重新水合，并通过离心洗脱出来。
在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以
减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保
持分相的稳定性。
2018/7/20
21
为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生 自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二 酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过 高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚， 并调节至中性。使用饱和酚可以减少酚吸收更 多的DNA，降低DNA的损失率。
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述一、核酸的分离纯化技术1.超声破碎法超声破碎法是一种通过超声波的振动作用破碎细胞膜，释放细胞内的核酸分子的方法。
该方法操作简便，效果较好。
2.酚-氯仿提取法酚-氯仿提取法是一种经典的核酸提取方法，通过酚和氯仿相间重复萃取的方法，将细胞或组织中的核酸分子提取到有机相中，然后用酒精沉淀。
3.离心沉淀法离心沉淀法是利用不同物质在不同离心力下沉降速度的不同，将核酸从其他组分中分离出来的方法。
可通过高速离心使核酸沉淀到底部，将上清液中的其他杂质倒掉，最后用缓冲液重悬核酸。
4.配对离心法配对离心法是利用核酸的碱基配对性质，在特定的条件下使目标DNA 与特异性探针配对，然后通过离心将核酸-探针复合物从其他杂质中分离出来。
这种方法常用于核酸的富集和寡核苷酸修饰位点的分析。
二、核酸的鉴定技术1. 紫外-可见分光光度法（UV-Vis）紫外-可见分光光度法是通过核酸分子在紫外光或可见光波长范围内的吸收特性来确定其存在和浓度的方法。
根据核酸中含有的吸收波长为260 nm处的碱基特征吸光峰，可以判断核酸的纯度和浓度。
2.电泳分析法电泳分析法是通过核酸分子在电场中的迁移速率和特定条件下的尺寸分离效应来分析核酸的方法。
主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法。
核酸经电泳后可以观察到DNA或RNA在凝胶中的特征性带状图案，确定其分子大小、纯度和带电性。
3.PCR（聚合酶链式反应）PCR是一种常用的核酸鉴定技术，通过特定引物和聚合酶的作用，在体外进行核酸的扩增以达到检测目的。
PCR可用于快速检测目标DNA的存在与否，以及定性和定量分析。
4.基因测序技术基因测序技术是指利用测序反应将核酸序列信息转化为比特（通常指二进制），然后通过计算机软件分析的方法对核酸序列进行鉴定。
常用的基因测序技术有dideoxy测序和串联反应测序。
三、应用核酸的分离纯化及鉴定技术广泛应用于生物医学研究、遗传学、分子生物学、基因工程和疾病诊断等领域。
核酸分离纯化的原则
核酸分离纯化的原则
核酸的分离纯化原则主要包括以下几个方面：
1. 根据物理化学性质分离：包括碱基成分、大小、形态等，如使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA和RNA；利用离心、超滤和电泳等技术可分离DNA、RNA和蛋白质。
2. 根据碱基组成分离：由于不同物种、不同个体的DNA碱基组成不同，因此可以利用这一差异利用测序、杂交、PCR等方法进行分离。
3. 根据功能分离：可以根据DNA和RNA的功能和特异性进行分离。
例如，使用特异性结合染料或核酸探针选择性地富集DNA或RNA。
4. 根据生化特性分离：DNA和RNA在不同条件下的生化特性差异较大，可以利用这一特点进行分离纯化，如利用酸性或碱性溶液进行分离纯化。
5. 根据亲和性分离：根据DNA或RNA与某些物质的亲和性选择性地富集、分离纯化DNA或RNA，例如使用特异性结合蛋白质来富集特定DNA或RNA序列。
核酸的纯化主要方法
分离纯化核酸时的注意事项：防止物理因素的降解：1.尽量简化操作步骤，缩短提取时间，以减少变性机会。
2.防止热变性，避免高温。
一般0-4℃。
3.防止机械剪切作用动作轻缓；搅拌温和；加山梨醇等增加渗透压。
防止化学因素的降解：1.避免强酸强碱作用，抽提液pH要保持在4-10之间。
2.保持提取液一定的离子强度，以调节核酸的溶解度和保持二级结构的稳定性。
防止核酸酶的降解防止DNA酶的降解：通常加入酶的抑制剂、蛋白质的变性剂和去垢剂来实现。
1.加入金属离子螯合剂抑制DNA酶2.去垢剂及某些RNase抑制剂，对DNA酶也有一定抑制作用。
防止RNA酶的降解：RNase很难抑制，且无处不在，汗液、唾液中均有。
很耐热，80℃处理15分钟不能灭活。
操作注意事项：1.带一次性手套、口罩；2.器皿试剂高压灭菌或用DEPC（乙二基焦炭酸）处理。
但含有Tris的试剂不宜用，因DEPC可与胺类迅速发生化学反应。
3.尽早除去蛋白质（含RNase）,并加抑制剂。
常用的抑制RNase活性的方法有：1.核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin,人胎盘中分离的一种蛋白）优点：效果好，不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
使用注意事项：（1）置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DDT）的50%甘油中，-20℃储存。
（2）最大活性的发挥要求有巯基试剂。
（3）冻融数次后应弃之不用。
（4）在变性裂解哺乳动物细胞提取RNA的初始步骤中不宜使用，在其后RNA纯化步骤中应用。
用酚抽提可除去蛋白质抑制剂，故纯化过程中应补加。
2．糖核苷复合物（vanadyl-ribinucleaside complex）由氧钒（IV）离子和4种核糖中的任意一种形成的复合物，是一种过渡态类似物，它能与多种RNase结合并几乎能百分百地抑制RNA酶的活性。
缺点：强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译。
可用0.1%羟基喹啉的苯酚（用0.01mol/L E(pH>7.8)平衡）多次抽提除去。
核酸的分离与纯化
实验室常见样本核酸提取方法
——痰标本提取方法：
Saccomno液：每50毫升固定液中含50％ 乙醇48 mL，2％聚乙
二醇1 mL、0.3利福平1 mL ；
DTT (二硫苏糖醇)液: 0.1g DTT、0.78g NaCl、0.02g KCl、
核酸提取方法——分离与纯化
——盐析法
产量较低，但方法简单，比较酚氯仿方法无化学危害； 同样不适合大规模自动化提取。 提取好的DNA用蛋白酶处理纯度会提高。
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
1、细胞裂解和酶处理同前述；
2、处理好的裂解液转入硅胶离心柱，高速离心，利用硅胶可以吸附核酸 而不能与其它物质如蛋白质，脂类等结合的特点，洗脱这类杂质；
STE 等)
在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋 白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离 子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
核酸提取方法——细胞裂解
——酶作用（生物作用）：
实验室常见样本核酸提取方法
——血清样本核酸提取方法：
血清中微生物来源RNA提取方法： 1、 酚氯仿法； 繁琐，手工操作重复性较差
2、磁珠法； 方便，易于自动化，重复性很好，成本较高
实验室常见样本核酸提取方法
——血清样本核酸提取方法：
血清中循环核酸提取方法： 1、酚氯仿法；
2、磁珠法；
人类基因组、发生肿瘤时异常升高；-孕妇的循环核酸亦可来源于 胎儿。
主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、 植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核 酸释放。
简述核酸分离纯化的主要步骤
简述核酸分离纯化的主要步骤核酸分离纯化的主要步骤其实就是一场与基因的“亲密接触”。
我们就像是在进行一场精密的科学“约会”，只不过对象是DNA或RNA，而不是人。
好啦，咱们来看看这个过程如何进行的吧。
1. 材料准备
1.1 样品收集
首先，你得找点样品，可能是植物、动物，甚至是细菌。
想象一下，就像挑选食材一样，你需要挑选新鲜的“原料”。
1.2 细胞裂解
接下来，咱们要“破壳”了！通过加入一些裂解缓冲液，把细胞膜弄开，释放出里面的核酸。
这个过程就像是打开一个“宝箱”，哇，里面可真丰富！
2. 去除杂质
2.1 去除蛋白质
这一步，你得用一些蛋白酶，把细胞里的蛋白质都搞定。
想象一下，就像是把不需要的东西清理出去，只留下最闪亮的宝物。
2.2 沉淀核酸
然后，咱们需要加入酒精，通常是乙醇。
核酸会跟酒精“亲密接触”，沉淀下来。
这个时候你会发现，核酸就像是被请出舞池的主角，闪闪发光！
3. 洗涤与重溶
3.1 洗涤
在沉淀后的核酸上，加点洗涤液，就像给它洗个澡，把残留的杂质都冲走。
你得小心翼翼，别让它“滑了”！。
3.2 重溶
最后一步，是把洗净的核酸重新溶解在缓冲液中。
这个过程就像是给核酸穿上新衣服，焕然一新，准备出门见客！
完成这些步骤后，你的核酸就“出炉”啦！感觉就像是一场成功的约会，满载而归。
希望这个过程能让你对核酸分离纯化有个更轻松的了解。
就这样，你成功地和基因建立了“深厚的友谊”，为后续的实验打下了良好的基础！。
核酸提取纯化方法
核酸提取纯化方法核酸提取是分子生物学实验中的重要步骤，它是从细胞或组织中提取核酸并纯化的过程。
核酸提取的质量和纯度直接影响着后续实验的结果，因此选择合适的提取方法非常重要。
本文将介绍几种常用的核酸提取纯化方法，希望能够为相关实验提供参考。
1. 酚氯仿法。
酚氯仿法是一种经典的核酸提取方法，它适用于从细胞或组织中提取总RNA或DNA。
该方法利用酚酚与细胞裂解液中的蛋白质结合，形成两相体系，从而实现核酸的分离。
酚氯仿法简单、快速，但需要注意操作时要避免接触到有毒的酚和氯仿。
2. 硅胶柱法。
硅胶柱法是一种常用的核酸纯化方法，它适用于从酶切产物或PCR产物中提取DNA。
该方法利用硅胶柱的亲和性吸附作用，将核酸与其他杂质分离。
硅胶柱法操作简单、产出纯度高，但需要注意避免硅胶柱干燥和避免使用含乙醚的洗涤缓冲液。
3. 磁珠法。
磁珠法是一种新型的核酸提取纯化方法，它利用表面修饰的磁珠与核酸间的亲和性吸附作用，实现核酸的快速提取和纯化。
磁珠法操作简便、高效，适用于高通量实验和自动化操作，但需要注意避免磁珠的受污染和避免磁场干扰。
4. 膜柱法。
膜柱法是一种基于离心膜柱的核酸提取方法，它适用于从血液或体液中提取DNA或RNA。
该方法利用膜柱的孔径选择性和亲和性吸附作用，将核酸与其他杂质分离。
膜柱法操作简便、适用于样品处理量大的情况，但需要注意避免膜柱的受污染和避免离心条件不当。
5. 酶切法。
酶切法是一种特异性的核酸提取方法，它适用于从混合物中提取特定序列的DNA。
该方法利用限制性内切酶对DNA的特异性切割，将目标DNA从其他DNA分离。
酶切法操作简单、适用范围广泛，但需要注意选择合适的酶切位点和酶切条件。
总结。
核酸提取纯化是分子生物学实验中的关键步骤，选择合适的提取方法可以提高核酸的质量和纯度。
不同的实验目的和样品类型需要选择不同的提取方法，科学合理地选择和操作提取方法可以为后续实验提供可靠的核酸样品。
希望本文介绍的核酸提取纯化方法能够为相关实验提供参考，提高实验的成功率和准确性。
第五章核酸的分离纯化
三、核酸的鉴定与保存
2、RNA的储存 RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70℃ 保存。如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液 中加入RNasin或VRC，保存时间可延长。
• 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的 DNA样品。可得DNA 200kb左右
三、玻棒缠绕法
• 现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方 法经改进而来。
三、玻棒缠绕法
DNA玻棒缠绕法示意图
四、其它方法
常用的一些分子诊断技术，并不需要高分子量的DNA样 品，因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法运用而 生并广泛使用
第五章 核酸的分离纯化
第一节 核酸分离纯化的设计及原则 第二节 基因组DNA的分离纯化 第三节 质粒DNA的提取与纯化 第四节 RNA的分离纯化
第一节 核酸分离纯化的设计及原则
第一节 核酸分离纯化的设计及原则
一、材料与方法的选择 二、技术路线的设计 三、核酸的鉴定与保存
一、材料与方法的选择
（一） 材料与方法的选择 （二） 选择原则
在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8 纯RNA的A260/A280比值为2.0
三、核酸的鉴定与保存
1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸
2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0
SDS的作用：
1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂； 2 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸
核酸的分离与纯化
2.DAPI （4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色反应 DAPI 为一种荧光染料，可以穿透扰乱的细胞膜与细胞核中的双链 DNA结合而发挥标记的作用，粘附在DNA双螺旋的小沟区，可以产生 比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要 高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞 标记的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常 用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。 DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。 DAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为360nm和460nm
1.核酸的变性
核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空
间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生 物活性的降低或丧失。
使氢键断裂，破
坏碱基堆集力，从
而引起核酸二级结 构的破坏。
2.核酸的降解 核酸的降解是指多核苷酸链的磷酸二酯键的断裂 （1）RNA的降解 在稀碱溶液中能降解生成单核苷酸的混合物， 在高温浓碱下可降解生成核苷和磷酸。在低温酸性条件下稳定，在 高温酸性条件下降解成碱基或者嘌呤碱基和嘧啶单核苷酸的混合物。 RNA在Rnase和磷酸二酯酶等的作用下，降解成3 ‘或5 ’-单核 苷酸。 （2）DNA的降解 在稀碱溶液中较稳定，但在较高浓度的碱溶液中 高温处理会降解产生单核苷酸，且嘌呤和嘧啶碱基常有破坏。在低 温的酸性条件下也比较稳定，但在高温时降解生成嘌呤碱基和嘧啶 核苷酸。 DNA在Dnase、磷酸二酯酶等的作用下。降解成3 ‘或5 ’-脱氧 核糖核苷酸。
原核生物
真核生物
70S
80S
30S 50S 40S 60S
RNA的分子结构
mRNA
核酸分离纯化
1.1.2 分离核酸原则： 1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
返回
1.2 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
盐
MgCl2 NaAc KAc NH4Ac NaCl LiCl
贮存液浓度（mol/L)
1 3 (pH5.2) 3 (pH5.2)
10 5 8
终浓度(mol/L)
0.01 0.3 0.3 2.5 0.2 0.8
返回
2.3.2 有机沉淀剂
（1）乙醇
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易
挥发除去，不影响以后实验。 缺点：
返回
2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀， 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
返回
2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
返回
测定结果分析
A：测DNA： 纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m ／OD230应大于2.0。
1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。
2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；
核酸的分离和纯化
琼脂糖凝胶电泳操作注意细节
1） 根据片段大小配制不同浓度的胶（改变分辨率），片段越小， 需要胶浓度越大。 2） 胶要现制先用 3） 选择合适的Marker 4） 配胶的缓冲液与电泳缓冲液要是同一种，且浓度一致（1倍） 5） 点样时要加入loading buffer，并注意，不要将样点到点样 孔之外（飘样），也不要将胶戳漏（漏样） 6） 根据片段大小及电泳检测目的，选择合适的电压及电泳时间 7）EB染色。
检测原理：
溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中， 在紫外光照射下，发射荧光。
EB: 先染与后染
核酸凝胶电泳技术
溴化乙锭染料的化学结构及 其 对 DNA 分 子 的 插 入 作 用 。 由于插入了溴化乙锭分子， 在紫外光照射下，琼脂糖凝 胶 电 泳 中 DNA 的 条 带 便 呈 现 出荧光，易于鉴定。
琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的 能力
凝胶类型及浓度 （bp）
分离DNA的大小范围
0.3%琼脂糖
50 000~1 000
0.7%琼脂糖
20 000~1 000
1.4%琼脂糖
6 000~300
4.0%聚丙烯酰胺
1 000~100
10.0%聚~1
琼脂糖凝胶电泳的原理
rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列， 特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总 RNA纯度和完整性的重要参数。
3、 琼脂糖凝胶电泳
• 3. 1 原理： • 3. 2 用途：
琼脂糖凝胶电泳的原理
DNA电泳迁移：电荷效应＋分子筛效益
（1）DNA带负电，电场中，向正极移动； （2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，构 型（超螺旋 > 线性 > 开环）； （3） 线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成 反比（分子量越大，跑得越慢）；
医学-核酸的分离与纯化
息从父母传递给后代，并控制蛋白质的合成。
核酸的分类
DNA
DNA是脱氧核糖核酸的缩写，是细胞内主要的遗传物质，负 责携带遗传信息。根据功能和结构的不同，DNA可分为染色 体DNA和线粒体DNA。
RNA
RNA是核糖核酸的缩写，主要参与蛋白质的合成。根据功能 和结构的不同，RNA可分为信使RNA、转运RNA和核糖体 RNA等。
戊糖
戊糖是核酸中的碳水化合物部分，包括D-核糖和脱氧核糖。D-核糖是构成RNA的碳水化 合物，而脱氧核糖是构成DNA的碳水化合物。
含氮碱基
含氮碱基是构成核苷酸的有机碱，包括腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺 嘧啶（T）等，这些碱基在核酸分子中具有特定的配对规则。
核酸的结构与功能
01
DNA双螺旋结构
吸附法纯化
硅胶吸附法
利用硅胶的吸附性质，将DNA混合液通过硅胶柱，去除 杂质，得到纯化的DNA。
磁珠吸附法
利用磁珠的吸附性质，将DNA混合液加入磁珠中，去除 杂质，得到纯化的DNA。
凝胶过滤法
利用凝胶的分子筛效应，将DNA混合液通过凝胶柱，去 除杂质，得到纯化的DNA。
膜分离纯化
超滤法
利用膜的分子筛效应，将DNA混合液通过超滤膜，去除杂质，得 到纯化的DNA。
疫苗开发
在疫苗开发中，核酸可以作为抗原提供给免疫系统，刺激机 体产生免疫反应。通过核酸分离与纯化技术，可以获得高纯 度、安全性和有效性均符合标准的疫苗抗原，为疫苗研发提 供关键技术支持。
05
展望未来
核酸分离与纯化的挑战与机遇
挑战
随着医学技术的不断发展，对核酸的分离与纯化提出了更高的要求，尤其是在保 证高纯度、高效率、低成本等方面。同时，对于特殊样本的处理和复杂样本的解 析也带来了新的挑战。
核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法引言：核酸分离纯化是分子生物学研究中常用的基础技术之一。
通过分离纯化核酸可以获取高纯度的目标核酸样品，为后续的核酸分析和实验提供可靠的基础。
本文将介绍几种常见的核酸分离纯化方法及其原理、步骤和应用。
一、酚/氯仿法酚/氯仿法是最早用于核酸提取的方法之一，其基本原理是利用酚和氯仿的不同溶解度和密度，将核酸从其他细胞组分中分离出来。
主要步骤包括细胞破碎、酚处理、氯仿处理和酒精沉淀等。
该方法操作简单、成本低廉，适用于从体内或体外样品中提取DNA或RNA。
然而，酚/氯仿法存在操作危险性大、提取效果依赖于操作者经验等问题。
二、硅胶柱层析法硅胶柱层析法是一种常用的核酸纯化方法，利用硅胶吸附核酸的特性实现核酸的分离纯化。
该方法主要包括样品处理、硅胶柱处理和洗脱等步骤。
硅胶柱层析法具有操作简便、纯化效果好、适用于各种核酸样品等优点，广泛应用于基因克隆、PCR扩增和测序等实验中。
然而，硅胶柱层析法的纯化效果受到核酸长度和样品质量的影响。
三、离心管柱法离心管柱法是一种基于离心技术的核酸分离纯化方法，其原理是利用离心管柱中填充的分离介质将核酸与其他杂质分离。
该方法主要包括样品处理、离心管柱处理和洗脱等步骤。
离心管柱法操作简单、纯化效果好、适用于多种核酸样品，被广泛应用于基因克隆、PCR 扩增和测序等领域。
然而，离心管柱法的分离效果受到核酸长度和样品质量的影响。
四、凝胶电泳法凝胶电泳法是一种常用的核酸分离纯化方法，可根据核酸的大小和电荷差异进行分离。
该方法主要包括制备凝胶、样品处理、电泳和染色等步骤。
凝胶电泳法操作简单、成本低廉，适用于从体内或体外样品中分离DNA或RNA。
然而，凝胶电泳法不能提供高纯度的核酸样品，常用于初步分析和检测。
五、商业化试剂盒法随着分子生物学技术的发展，商业化试剂盒法逐渐成为核酸分离纯化的主要选择。
商业化试剂盒包含了多种核酸纯化方法的关键试剂和耗材，操作简便、方便快捷。
根据不同的试剂盒，可以选择合适的纯化方法。
核酸分离纯化的主要步骤
核酸分离纯化的主要步骤1. 什么是核酸分离纯化？嘿，大家好！今天我们来聊聊核酸分离纯化这回事。
说白了，它就是从细胞里提取出DNA或RNA的过程。
就像是把美味的汤从锅里倒到碗里，确保里面没有杂质。
咱们的细胞里有很多东西，像是蛋白质、脂类和水分，真是五花八门。
但我们只想要那个最重要的核酸，嘿，这可是一项技术活哦！2. 核酸分离纯化的主要步骤2.1 细胞裂解第一步，就是把细胞搞破。
这听起来有点狠，但其实这是必须的，像个忍者一样，咱们得悄悄潜入细胞的世界。
我们用一种叫做裂解缓冲液的东西，里面有各种化学物质，可以把细胞膜弄得稀巴烂。
想象一下，把一个坚硬的蛋壳敲开，里面的蛋黄蛋白就可以流出来啦！这时候，细胞里的东西就会全部跑出来，嘿嘿，包括咱们要找的核酸。
2.2 细胞碎片去除接下来，咱们要把那些不需要的“杂物”清理掉。
细胞里面可不是清汤挂面，咱们得把破碎的细胞膜和其它大块的东西滤掉。
这个过程可以用离心来搞定，像旋转木马一样，把重的东西甩到边上，让核酸跟着跑到上面。
然后小心翼翼地把上面的液体吸出来，这可得细心，别把宝贝也给弄丢了！2.3 核酸沉淀好啦，经过一番折腾，咱们终于把核酸从那些杂七杂八的东西里解救出来了。
可是，这时候核酸还没完美地展现出来，咱们还需要进一步把它沉淀下来。
这里就要用到乙醇或异丙醇，咱们把它们加入到提取液中，就像给核酸穿上一件漂亮的外衣。
等一会儿，核酸就会像小颗粒一样沉到瓶底，真是美得不要不要的！3. 清洗和重悬核酸3.1 清洗核酸在沉淀出核酸后，我们还得给它洗个澡，别让它沾上那些脏东西。
再加点冷的乙醇，把沉淀的核酸轻轻洗一遍，像给小狗洗澡一样，既要温柔又要彻底。
洗完后，再把它离心一遍，剩下的就会是干净的核酸，闪闪发光，简直美丽动人！3.2 重悬核酸最后一步，就是把干净的核酸放到一个适合它的环境中，让它重新“生活”起来。
咱们用合适的缓冲液把它溶解开，确保它能够活跃地工作。
就像小鸟飞回温暖的家，核酸终于回到了它该待的地方。
核酸提取与纯化
核酸提取与纯化引言核酸提取与纯化是生物学研究中常用的操作步骤之一。
核酸提取是指从生物样本中分离出DNA或RNA分子，纯化则是指将提取得到的核酸分子除去杂质，获得纯净的核酸样品。
本文将介绍核酸提取与纯化的基本原理、常用方法以及注意事项。
核酸提取原理核酸提取的基本原理是利用生物样本中DNA和RNA分子与其他组分（如蛋白质、细胞壁等）之间的化学或物理性质的差异，将核酸分子从样本中分离出来。
常见的提取方法有有机溶剂法、盐析法和离心法等。
有机溶剂法有机溶剂法是一种常用的核酸提取方法。
其原理是利用有机溶剂（如酚-氯仿混合液）与生物样本中的其他组分之间的亲和性差异，将核酸分子从样本中提取出来。
这种方法操作简单，适用于提取DNA和RNA。
具体操作步骤如下：1.准备生物样本，如细胞培养物或组织样本。
2.加入细胞裂解缓冲液，破坏细胞膜、核膜等结构，释放核酸分子。
3.加入酚-氯仿混合液，与细胞裂解液混合，形成两相体系。
4.离心分离两相，核酸分子会在有机相中分配到有机相中，而其他杂质会在水相中。
5.取出有机相，加入异丙醇或乙醇等沉淀剂，沉淀核酸分子。
6.离心沉淀，弃去上清液。
7.用乙醇洗涤沉淀，去除残留的盐和有机溶剂。
8.干燥沉淀，加入适量的去离子水溶解核酸。
盐析法盐析法是利用核酸分子与盐溶液中的离子交互作用的原理进行分离。
该方法适用于高含量的核酸样本（如DNA或RNA）。
其操作步骤如下：1.准备生物样本，如细胞裂解液。
2.加入适量的盐溶液，使盐浓度达到一定程度。
3.离心分离沉淀，核酸分子会与高浓度盐溶液结合形成沉淀，而其他杂质会在上清液中。
4.取出沉淀，用盐溶液洗涤核酸，去除杂质。
5.干燥沉淀，加入适量的去离子水溶解核酸。
离心法离心法是一种快速分离核酸的方法。
其原理是利用离心力将核酸分子从样本中沉淀下来。
离心法适用于小样本量和快速提取的情况。
具体步骤如下：1.准备生物样本，如细胞裂解液。
2.加入高盐缓冲液，增加核酸与其他组分之间的亲和性差异。
核酸的分讲义离纯化及鉴定技术生化分析详解
核酸的分讲义离纯化及鉴定技术生化分析详解核酸的分离纯化及鉴定技术在生化分析领域具有重要的应用价值。
核酸是生物体内重要的生物大分子，它们具有保存、传递和表达遗传信息的功能。
为了研究核酸的结构和功能，需要对其进行分离、纯化和鉴定。
本文将详细介绍核酸的分离纯化和鉴定技术的生物化学分析。
1.核酸的提取与分离核酸提取是获得核酸样品的第一步，通过破碎细胞膜和细胞壁来释放核酸。
核酸的提取方法主要包括酸性酚/氯仿提取法、盐酸酚/氯仿提取法以及商业化的核酸提取试剂盒等。
2.核酸的纯化核酸提取后，常常需要对核酸进行纯化。
纯化目的是去除杂质，使核酸得到高纯度、高浓度、完整和可靠的分离。
核酸纯化方法主要有：凝胶柱层析、离心柱层析、沉淀、电泳、凝胶电泳纯化、离心纯化、溶液法纯化等。
3.核酸的鉴定核酸的鉴定一般包括酶切鉴定、PCR扩增鉴定和测序鉴定等。
(1)酶切鉴定酶切鉴定是通过限制性内切酶作用分析核酸的序列和结构。
通过将样品与不同酶切加入，并经过酶切电泳后，观察电泳图的特征带，可以推测样品的核酸类型和纯度。
(2)PCR扩增鉴定PCR扩增鉴定是通过聚合酶链式反应（PCR）扩增特定片段的核酸。
通过选择特异的引物，可以扩增出目标核酸片段，从而确定核酸的存在和纯度。
(3)测序鉴定测序鉴定是通过测序技术研究核酸的序列。
常见的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（NGS）和单分子测序等。
通过测序，可以确定核酸的准确序列，从而判断核酸的类型和功能。
整体而言，核酸的分离纯化及鉴定技术是生化分析中核心的内容。
通过这些技术，可以获得高纯度、高质量的核酸样品，并准确地鉴定核酸的存在和序列信息。
这些技术的应用广泛，包括基因组学、生物信息学、分子生物学、疾病诊断和药物研发等领域。
随着生化分析技术的不断发展，核酸的分离纯化及鉴定技术将越来越重要，为科学研究和生物医学领域的发展提供强有力的支持。
核酸的分离和纯化
RNA制备前的准备
玻璃器皿 在使用前应180℃烤至少4小时 塑料器皿 用0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）或用氯仿洗涤 电泳槽 用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于
3%H2O2 液中10分钟，然后0.1%DEPC处理水彻 底冲洗。 配制的溶液应用0.1% DEPC在37℃处理12小时以上，再高 压灭菌去除 DEPC。 不能高压灭菌的溶液用
EDTA/0.1 SDS的试管收集洗脱的RNA溶液。
35
6）按步骤2重新平衡柱子，重复步骤2-4的poly(A)选 择吸附和洗脱过程。
7）调整收集的RNA溶液的乙酸钠浓度至 0.3mol/L, 加2.5倍体积乙醇，移至2个硅化的SW-55离心管 中，-20℃放置过夜 。
8）4℃离心, 30, 000g 30分钟沉淀RNA（极稀浓 度 ）。弃去乙醇，晾干沉淀，重溶于150微升无 RNA酶的TE缓冲液，合并样品。取5微升在70℃ 加热5分钟后，在1%琼脂糖凝胶电泳中检查RNA 的质量。
31
方法 一、异硫氰酸胍法制备总RNA
二、TRIzol试剂提取细胞总RNA
步骤：
1） 组织标本需在预冷的碾钵中捣碎，收获1x106-5x106细
胞, 移入1.5 ml管中。
2） 加TRIzol试剂1 ml，混匀，冰浴5 mins。
3） 加氯仿0.2毫升，混匀，冰浴10 mins。
4） 4℃,10, 000g离心5 mins。
288 kb
痘病毒
196 kb
质体 几~100以上kb
线粒体
藻类 线状
15kb
酵母 环状
19~78 kb
植物 环状 100~150 kb
动物(扁虫到人)环状 15~18 kb
锥虫 网状
《核酸分离纯化》课件
《核酸分离纯化》课件一、课件概述核酸分离纯化是分子生物学和生物技术领域中的一项基本技术，其目的是从复杂的生物样品中提取和纯化出高质量的核酸，以便进行后续的分析和应用。
本课件将介绍核酸分离纯化的基本原理、方法和步骤，帮助学生掌握这一技术。
二、课件内容1. 核酸分离纯化的意义核酸是生物体内重要的遗传物质，其分离纯化对于研究基因表达、基因调控、基因突变等方面具有重要意义。
核酸分离纯化是进行基因克隆、基因测序、PCR等实验的基础步骤。
2. 核酸分离纯化的基本原理核酸的物理化学性质：核酸具有一定的溶解度、吸附性、变性温度等。
核酸与蛋白质、RNA、DNA等分子的差异：通过特定条件下对不同分子的相互作用进行分离。
利用核酸的特异性：通过特定酶的作用，实现对核酸的分离纯化。
3. 核酸分离纯化的方法盐析法：利用核酸在高盐浓度下的溶解度降低，将核酸与其他物质分离。
有机溶剂沉淀法：利用有机溶剂（如酚、氯仿等）与水相不相溶的性质，将核酸与其他物质分离。
吸附法：利用特定吸附剂（如硅胶、纤维素等）对核酸的选择性吸附，将核酸与其他物质分离。
透析法：利用透析袋的选择性透过性，将核酸与其他大分子物质分离。
酶法：利用特定酶（如DNA酶、RNA酶等）对核酸的降解作用，实现对核酸的分离纯化。
4. 核酸分离纯化的步骤样品处理：取适量生物样品，加入适量裂解液，进行充分搅拌，使细胞破碎并释放核酸。
核酸提取：将样品转移至离心管中，进行高速离心，将核酸沉淀与其他物质分离。
核酸纯化：根据核酸的物理化学性质，选择适当的分离方法（如盐析、有机溶剂沉淀等），将核酸与其他物质分离。
核酸洗涤：用适量的洗涤液对核酸沉淀进行洗涤，去除残留的杂质。
核酸重悬：加入适量的溶解液，将核酸沉淀重悬，以便进行后续分析或应用。
5. 实验操作注意事项实验操作应在生物安全柜中进行，避免交叉污染。
实验过程中应使用无RNA酶、无DNA酶的试剂和工具。
实验操作过程中应注意个人防护，避免接触核酸样品。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激
发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与 溶液中核酸的含量呈正比。
EB与DNA的结合
三、核酸的鉴定与保存
2、纯度鉴定 ⑴ 紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280
的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与
降低均提示不纯。 在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8 纯RNA的A260/A280比值为2.0
五、 DNA片段的纯化
• 常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化
的柱层析法（column chromatography）
五、 DNA片段的纯化
DNA柱层析法示意图
六、 DNA片段的回收
原则与要求:
1.提高片段的回收率；
2.清除回收的DNA样品中的杂质。
六、 DNA片段的回收
（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
（二）核酸的保存 ___DNA的储存
1、短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨 反应，PH低于7.0时DNA容易变性。 2、长期贮存： TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有 效防止细菌和核酸的污染。
荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而
发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。
适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）
三、核酸的鉴定与保存
3、完整性鉴定
⑴
琼脂糖凝胶电泳法：
以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可
判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段
的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果
方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂
水解酶等。
玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化 钠溶液，然后加入玻璃珠结合DNA，经分离、 洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下。
酚抽提法
玻棒缠绕法 基因组 DNA粗品
甲酰胺解聚法 粗分离
AGE分离
PFGE分离 特定的DNA片段
PAGE分离 精分离
有机溶剂抽提 乙醇沉淀洗涤 基因组DNA纯品
离子交换层析纯化
哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线
第二节
真核基因组DNA的分离纯化
一、酚抽提法
二、甲酰胺解聚法 三、玻棒缠绕法 四、其它方法 五、DNA片段的纯化 六、DNA片段的回收
（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。若 在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。
三、核酸的鉴定与保存
总RNA电泳图谱
正常时，28S
RNA的荧光强度 约为18S RNA的
2倍，否则提示
RNA的降解
三、核酸的鉴定与保存
（二）核酸的保存
1、DNA的储存 2、RNA的储存
三、核酸的鉴定与保存
（二） 选择原则
一、材料与方法的选择
（一） 材料与方法的选择
不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓 度可能有不同的要求 • 需考虑制备核酸所需的时间与成本 • 应选择安全的试剂与制备方案
一、材料与方法的选择
（二） 选择原则 1、保持核酸碱基序列的完整性 2、尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3、保持核酸的完整性
第五章
第一节 第二节 第三节 第四节
核酸的分离纯化
核酸分离纯化的设计及原则 基因组DNA的分离纯化 质粒DNA的提取与纯化 RNA的分离纯化
第一节 核酸分离纯化的设计及原则
第一节
核酸分离纯化的设计及原则
一、材料与方法的选择 二、技术路线的设计 三、核酸的鉴定与保存
一、材料与方法的选择
（一） 材料与方法的选择
一、酚抽提法
DNA酚抽提法示意图
一、酚抽提法
• 该法于1976年由Stafford及其同事创立，现在使 用的是改进的方法 • 以含EDTA、SDS及RNase裂解缓冲液裂解细胞 • 经蛋白酶 K 处理后，用 pH8.0 的 Tris 饱和酚抽提 DNA，获得DNA粗制品
DNA样品准备
常见的标本： 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等
使蛋白质变性。
蛋白酶K：
水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。 蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可 同时使用。
• 酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。
• PH8.0的Tris溶液可以似的抽提出的DNA进入水
相，减少在蛋白质层滞留。
（二）核酸的保存
三、核酸的鉴定与保存
（一）核酸的鉴定 1、浓度鉴定 2、纯度鉴定 3、完整性鉴定
三、核酸的鉴定与保存
1、浓度鉴定 ⑴ 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子
中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收
紫外线，其最大吸收波长为260收光谱
三、核酸的鉴定与保存
至条带DNA都到膜上，取出洗下。
500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但
不适用于分子量超过10kb和单链DNA。
透析袋电洗脱 ：
切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液 后继续电泳，DNA出胶后进行抽提DNA回收。
低熔点琼脂糖凝胶： 切下胶，加热到65℃熔化胶，然后抽提回收DNA。
三、核酸的鉴定与保存
2、RNA的储存
RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70℃
保存。如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液 中加入RNasin或VRC，保存时间可延长。
第二节
真核基因组DNA的分离纯化
第二节
真核基因组DNA的分离纯化
生物体组织细胞 细胞裂解 蛋白质变性沉淀降解 DNA释放 前处理
核酸的分离与纯化：
将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液
二、技术路线的设计
（二）核酸的分离与纯化
应该清除的杂质主要包括三部分
1、非核酸的大分子污染物：蛋白质、多糖及脂类 物质等 2、非需要的核酸分子：分离某一特定的核酸分子 时，其它的核酸分子皆为杂质 3、加入的有机溶剂和某些金属离子
应尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间
尽量避免各种有害因素对核酸的破坏
二、技术路线的设计
（一）核酸的释放 （二）核酸的分离与纯化 （三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤
二、技术路线的设计
（一）核酸的释放
DNA 和 RNA 均位于细胞内（病毒除外），因
此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释 放核酸。
表５-１ 各种组织细胞破碎方法
病进行分子诊断的最基础工作。
第五章
核酸的分离纯化
核酸分离纯化的原则 一、 保持核酸一级结构的完整性
二 、尽可能提高核酸制品的纯度
提取DNA总的原则
1 保证核酸一级结构的完整性；
2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子
的污染应降低到最低程度；
3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶
剂和过高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
三、玻棒缠绕法
• 现今使用的缠绕法是以 1987 年 Bowtell 的方 法经改进而来。
三、玻棒缠绕法
DNA玻棒缠绕法示意图
四、其它方法
常用的一些分子诊断技术，并不需要高分子量的DNA样
品，因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法运用而
生并广泛使用 1.异丙醇沉淀法:仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可 去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态） 2.玻璃珠吸附法
二、甲酰胺解聚法
• 1987 年 Kupiec 等报道了甲酰胺解聚法，其中细 胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进
行酚的抽提。
• 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白
质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰
胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋 白质变性。减少了酚多次抽提的步骤 • 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的 DNA样品。可得DNA 200kb左右
(A值等于1时，相当于50μg/ml双链DNA， 40μg/ml单链DNA或RNA， 20 μg/ml单链寡核苷酸）
紫外分光光度法只用于测定浓度大于 0.25ug/ml的核酸 溶液。
三、核酸的鉴定与保存
⑵荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电 泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较 RNA大得多，电泳迁移率低。
DNA的浓缩
1 、固体聚乙二醇（ PEG ）浓缩：用透析袋外敷 PEG至合适量。 2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇 或仲丁醇，但 DNA 不会。因此重复几次可显著 减少DNA体积。
DNA的检测
溴乙锭染色 ：在254nm紫外光下检测，如需回收 最好在300nm紫外光下割胶，否则易使嘌呤断 链，在1cm宽带上可检到10ng DNA。 银染法 ：Ag+与DNA形成复合物，在甲醛还原下可 染成黑褐色，灵敏度高200倍，但不能回收。
第五章
核酸的分离纯化
第五章
核酸的分离纯化
核酸的结构与功能是分子水平生命活动的基础； 内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病 基因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。
第五章
核酸的分离纯化
DNA、RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分 子生物学和分子诊断的研究对象。
DNA、RNA的分离纯化是分子生物学研究及对疾
生物组织：
最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 － 70℃或液氮
主要试剂的作用： EDTA：1 二价金属螯合剂，抑制核酸酶；
2
降低细胞膜的稳定性
SDS的作用：
1
2
溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂；