基因工程6-1表达载体2cmx
基因工程载体
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基因诊断
利用基因工程载体携带特定的检测基因或标记物， 对疾病相关基因进行快速、灵敏的检测和诊断。
应用领域与前景
农业生产
通过基因工程载体将优良性状基因导入农作物或家畜家禽的 基因组中，改良品种性状，提高产量和品质。
前景
随着科学技术的不断进步和创新，基因工程载体的研究和应 用将更加深入和广泛。未来，基因工程载体有望在个性化医 疗、精准农业、生物安全等领域发挥更大的作用，为人类健 康和生活质量的提高做出更大的贡献。
人工染色体载体
概念
人工染色体载体是一种基于天然染色体结构设计的基因工程载体，可模拟天然染色体的功 能和特性。
优点
人工染色体载体具有较大的容量，可容纳多个外源基因和调控元件。此外，人工染色体载 体还具有稳定的遗传特性和较低的免疫原性，可实现外源基因的长期稳定表达和遗传。
缺点
人工染色体载体的构建和操作相对复杂，技术难度较大，且成本较高。目前主要应用于基 础研究和临床试验阶段。
潜在生态风险分析
基因污染
基因工程载体可能通过水平基因转移等方式，将外源基因 导入非目标生物体内，造成基因污染。
生态平衡破坏
外源基因的导入可能对目标生物及其相关生物种群的生态 平衡产生不良影响，如改变种间竞争关系、影响食物链等。
生物多样性减少
基因工程载体的广泛应用可能导致生物多样性减少，特别 是对一些濒危物种和生态系统的影响更为显著。
人类健康影响评估
食品安全问题
基因工程载体在食品生产中的应用，如转基因作物，可能对人体健 康产生潜在风险，如引发过敏反应、产生毒素等。
医药安全问题
基因治疗等医疗手段的应用，可能存在潜在的安全隐患，如基因编 辑的脱靶效应、基因治疗的副作用等。
载体介绍
pBR322—→插入在Ampr 中，基因型为Tetr 、Amps 、—— →在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培 养基可生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。
这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该 基因活性丧失的现象叫插入失活。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC）
YAC的特点： 1.只能在酵母细胞中扩增 2.克隆容量大，一般为200kb-500kb 3.构建原理，按染色体结构构建
染色体复制和遗传的三个基本组件：
1.自主复制序列（ARS） （autonomous replicating sequence） DNA复制起始点（ori） 2.着丝粒（centromere，cen） 3.端粒（telomeres，tel）
P1 噬菌体载体和 P1 人工染色体载体
P1 噬菌体 ：大肠杆菌的一种溶原性噬菌体。 P1 噬菌体载体 工作原理类似黏粒载体 外源片断70-100kb
P1 人工染色体载体 P1 噬菌体载体的改造，结合了P1 噬菌体载体和 BAC载体的优点。 克隆外源片断130-150kb
（详细介绍）质粒载体
什么是质粒？
1.“严紧型”复制控制的质粒(stringent plamid)：拷 贝数少（1-5个）； 2.“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：拷 贝数多（10-200个）。
质粒DNA的转移
1. 质粒的类型 据能否自我转移可分为:
接合型（conjugative plasmid)
非接合型（non-conjugative plasmid) 2. F质粒(fertility factor)
基因工程名词解释
基因工程名词解释1、基因工程：对不同的遗传物质在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需的基因在细胞中表达，产生人类所需的产物或新生物类型。
2、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后再转入另一个生物体（受体）内，按照人们的意愿稳定遗传并表达新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
3、基因xx：经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。
通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
（包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达。
从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
）4、限制性内切核酸酶：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。
5、修饰酶：体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalentmodificationregulation)，这类酶称为修饰酶(prosessing enzyme)。
6、同裂酶：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
（同序同切酶、同序异切酶、“同功多位”等）7、同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
8、位点偏爱：某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同切割效率。
9、星星活性：极端非标准反应条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
10、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
11、DNA聚合酶：以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。
DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体基因工程是一门综合性的学科，其中一个关键方面是使用载体进行基因转移和操控。
载体是一种可以携带和传递特定基因的DNA分子。
在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体。
下面将详细介绍这三种载体的相关信息。
1. 质粒（Plasmid）质粒是一种环状双链DNA分子，通常存在于细菌细胞内，也可通过人工方法导入其他生物体内。
质粒是最常用的基因工程载体，因其结构相对简单且易于操作，可以携带外源基因并通过转染等方法传递到细胞中。
质粒的大小通常在1-20千碱基对之间，具有自主复制和不受宿主基因组限制的能力。
质粒常用于基因克隆、表达以及基因敲除等研究。
例如，在基因克隆中，通过将目标基因插入质粒中的多克隆位点，可以将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和分析。
质粒也常用于表达外源基因，可以将目标基因与促进其表达的启动子及调控元件结合在一起，构建表达载体进入目标细胞中，使其产生目标蛋白。
2. 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，是基因工程中另一常用的载体。
噬菌体具有高度选择性对细菌进行感染和复制的能力，因此可以利用噬菌体来转移和表达外源基因。
噬菌体载体通常比质粒大，可以携带更长的DNA序列。
噬菌体常用于噬菌体展示技术和抗体库构建。
噬菌体展示技术是一种用于筛选蛋白质相互作用、抗体或潜在药物靶点的方法。
通过将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面蛋白基因融合，在噬菌体所感染的细菌中进行筛选。
另外，噬菌体也常用于构建噬菌体抗体库，通过大规模的筛选，筛选出具有特定抗体活性的噬菌体克隆。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是通过基因工程方法人为合成的染色体模拟体，在某些情况下可用于携带超长的DNA分子。
人工染色体被设计成可以稳定传递和复制的DNA分子，通常包括一个原核或真核的起始序列、一个中央控制区域和一个终止序列。
人工染色体在基因组学和基因治疗研究中发挥着重要作用。
基因工程质粒载体特点
基因工程质粒载体特点基因工程质粒载体是基因工程中常用的一种工具，用于携带和传递外源基因到目标细胞中。
它具有以下特点：1. 大小合适：质粒载体通常是一个环状的DNA分子，大小在1kb 到100kb之间。
这个大小范围适中，既能容纳外源基因，又能被目标细胞较容易地摄取和转化。
2. 多拷贝数：质粒载体在细胞中一般有多个拷贝数，可以增加外源基因的表达量。
一般来说，质粒载体的拷贝数在10到100之间，可以根据需要进行调节。
3. 含有选择标记：质粒载体通常携带了一些选择标记，如抗生素抗性基因，通过在培养基中加入相应的抗生素，可以筛选出带有质粒的细胞。
这样可以方便地筛选出带有外源基因的细胞，而不带有质粒的细胞则会被抗生素杀死。
4. 含有起始子和终止子：质粒载体通常还含有起始子和终止子，这些序列可以使外源基因在目标细胞中得到正确的转录和翻译。
起始子用来启动转录过程，终止子用来终止转录过程。
5. 多克隆位点：质粒载体上通常有多个克隆位点，可以将外源基因插入其中。
这些位点通常是由特定的限制酶切位点组成，通过限制酶切割质粒和外源基因的DNA，可以将外源基因粘接到质粒上。
6. 容易提取和纯化：质粒载体通常可以通过简单的纯化步骤从细胞中提取出来。
一般来说，可以通过离心、酚/氯仿提取或商业化的质粒提取试剂盒来实现质粒的纯化。
7. 可以进行进一步改造：质粒载体可以通过基因工程技术进行改造，如插入或删除特定的序列，改变拷贝数等。
这使得质粒载体成为一个灵活的工具，可以根据实验需要进行定制。
基因工程质粒载体在基因工程和生物技术中发挥着重要的作用。
它不仅可以用于基因的克隆和表达，还可以用于基因编辑、基因治疗和转基因等领域。
质粒载体的特点使得它成为一种方便、灵活和高效的工具，为基因工程研究和应用提供了重要支持。
基因工程表达载体
第四节 表达载体
克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建 立DNA和cDNA，其上有复制子即可；
表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细 胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启 动子；
穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中 复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
腺病毒载体的应用：
基因治疗 表达真核基因 研制疫苗
二、病毒表达载体
(三)反转录病毒载体
反转录病毒RNA基因组的6个区域： 5’-LTR, psi序列，gag，pol，env， 3’-LTR
反转录病毒载体的优点： 具有很强的穿透细胞的能力 无严格的组织特异性 可长期存放，重排较少 可包装10kb外援基因
启动子 P lac P trp P tac P traA P lL P recA
第四节 表达载体
启动子
-35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA TAGACA TTGACA TTGATA
-10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT TAAT G T GATACT TATAAT
信号肽，可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。
一、质粒表达载体
(二)酵母表达载体 原核生物和真核生物存在翻译后修饰反应机制的差异，
真核基因在原核表达系统中难以获得有活性的蛋白。 酵母是真核表达的首选系统 酵母表达载体是一种穿梭表达载体：既能在大肠杆菌中
繁殖，又能在酵母中复制、表达和选择。
一、质粒表达载体
⑴ 载体能够独立复制，具有复制起点。 ⑵ 应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆
常见的基因工程载体种类和用途
常见的基因工程载体种类和用途你知道基因工程载体吗？听起来好像特别高大上，像是外星科技一样，但其实它就在我们身边，搞不好你今天吃的早餐里就有它的“身影”。
简单说，基因工程载体就是科学家用来在细胞里“传递”基因的“邮差”。
你肯定会问，为什么需要邮差？其实很简单，我们的基因就像是一本超级复杂的食谱，而载体就是帮忙把食谱送到目标细胞的“快递小哥”。
它们的作用就是帮助那些有价值的基因进到细胞里，进而制造出我们需要的蛋白质或者其他有用的物质，能帮我们做药、治病、改善农作物，简直就是科技的神奇魔法棒！好了，说到载体的种类，那可是五花八门。
最常见的就是质粒载体。
质粒其实就是细菌里的小小DNA环。
它们能在细菌之间自由复制和传递，好像是细菌界的小银行，存储着它们的“小秘密”。
我们通常把想要转入细胞的基因装在质粒里，然后让这些质粒进入目标细胞，好像给细胞“寄”了一份礼物。
这个方法非常常用，毕竟，质粒不挑细菌，而且操作起来也比较简单。
只要用一些小手段让细菌“吸收”这些质粒，基因就可以顺利进入细胞，开始工作了。
说到质粒，有一个特别重要的概念叫做表达载体。
它不仅仅是帮你传递基因，还能让细胞“理解”这个基因，开始制作你想要的蛋白质。
这种载体的背后有个小小的“剧本”，确保细胞能够按照设定的规则生产出目标蛋白。
所以，你能想象一下，表达载体就像是给细胞发了一张详细的操作手册，它不仅告诉细胞：“嘿，你现在要做这个。
”还告诉它：“怎么样做才是最完美的。
”想要生产大量的蛋白质？没问题，交给它就行了。
再来说说病毒载体。
你以为病毒都是坏家伙？不，其实有些病毒特别“配合”，它们天生就能把基因传送到宿主细胞里。
科学家们正是利用了这一点，设计了各种病毒载体。
比如，腺病毒和逆转录病毒这两个大明星，它们通过感染细胞，把目标基因送进去。
你可能会想，病毒不就是用来害人的嘛，怎么还用它们？它们被科学家“改造”过，变得安全多了，只传递基因，不会带来任何危害。
基因工程载体的分类及其特性
基因工程载体的分类及其特性田文晓 1343001125按照来源和性质分类1、质粒载体①复制：通常情况下一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。
在不同的质粒中，复制起始区的组成方式不同，有的可决定复制的方式，例如滚环复制和θ复制；在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。
②拷贝数：质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数大约为1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。
③不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。
两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
④转移性：指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。
2、噬菌体载体（包括λ噬菌体、M13噬菌体载体）1)λ噬菌体载体：大的外援插入片段在质粒中不稳定，转导是比转化效率更高的过程，避免出现无插入片段的空载体。
2)M13噬菌体载体：可以对任意克隆基因进行DNA进行诱变，测序方便，可以制备单链测序模板；含有噬菌体DNA的噬菌体颗粒从转化细胞中分泌出来后，可以在生长平板上收集。
①超感染免疫性：溶原性细菌在被噬菌体感染并溶原化后，不会被同种噬菌体再次感染。
②经过若干世代后，溶原性细菌会开始进入溶菌周期，即溶原性细菌的诱发。
此时，原噬菌体从宿主基因组上切离下来进行增殖。
3、粘粒载体（柯斯质粒）①具有λ噬菌体的特性。
柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
基因工程载体
基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到能够自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)确实是携带外源基因进入受体细胞进行繁育和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种要紧类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒〔cosmid〕载体基因工程对载体的要求〔1〕在宿主细胞内能独立复制。
〔2〕有选择性标记。
〔3〕有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不阻碍载体的复制。
〔4〕分子量小，拷贝数多。
〔5〕容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依靠于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞那么不能存活，而宿主即使没有它们也能够正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常显现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA〔cccDNA〕②开环DNA〔open circular,ocDNA〕③线形DNA〔linear,lDNA〕〔二〕质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套操纵细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒〔性质粒或F因子〕甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了操纵细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒〔抗性质粒〕、Col质粒〔细菌素养粒〕。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状〔resistance〕。
Col质粒：细菌素通过与敏锐细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
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signal peptide
6His, GST, FBD,CBD,zz, intein
RBS
6His, GST, FBD,CBD
Plac
Lac O
MCS
rrnB T1T2
Xa et al
Xa et al
Lac I
Lac I Ampr
ori Lac IIq Lac
IPTG 表达载体调控展示 大肠杆菌
Protocol
14 ℃, 6h or overnight, then store at -20 ℃
Cell
Transform
37℃, 45min PCR, Sequence, Express
37℃, 16-20h
Protocol
30-32℃,200rpm,OD600=0.4-0.8 42℃，200r/min,3-5h
（5）内含肽标签表达载体
pTWIN1 和 pTWIN2 载体可以将目的蛋白融合在两个mini 内含肽之间便于进行蛋白纯化和后续操作，如蛋白环化和 连接。 pTWIN1 载体中的内含肽分别为 Mxe GyrA 内含肽和来自 蓝细菌（Synechocystis sp.）dnaB 基因的 Ssp DnaB 内 含肽。 pTWIN2 载体中的内含肽分别为 Ssp DnaB 内含肽和来自 嗜热自养甲烷杆菌（Methanobacterium thermoautotrophicum）rir1基因的 Mth RIR1 内含肽。 内含肽-目的蛋白的融和蛋白可通过几丁质结合域结合到 几丁质珠上，便于纯化。分离洗脱目的蛋白可通过改变 pH 值和温度后，再加入硫醇试剂来进行。pTWI N1 和 pTWIN2 载体的多克隆位点信息请见 NEB 网站。
pGEX-6P-3
该载体具有以下优点：
①可诱导，能高效表达所需基因或基因片段。 IPTG可诱导tac启动子进行高效表达。 ②融合蛋白极易纯化。谷胱苷肽巯基转移酶 GST分子量为25kDa，作为一种酶在大肠杆 菌表达或与外源基因融合表达时，与自然 界存在的酶具有相同的酶活性，用亲和层 析法(G1utathione Sepharose 4B)极易从 裂解液中分离纯化出融合蛋白，也可用显 色法或免疫学方法方便地检测外源蛋白的 表达量。
Xa et al
Lac I
Lac I Ampr T7RNA聚合酶 ori Plac lacO IPTG 表达载体调控展示 大肠杆菌 lacI T7 RNA聚合酶基因
5 表达产物的纯化
基因表达的产物有两种形式：直接转录并翻译出目的基因的蛋白；表达出融合蛋白P87
包涵体蛋白的纯化（目的蛋白，融合蛋白） 什么是包涵体？没有生物活性，复性，有的 仍无活性。 通过物理破碎等方法破碎细胞，离心得到包 涵体，洗涤去除杂蛋白。 可溶性蛋白的纯化（目的蛋白，融合蛋白） 普通的蛋白纯化程序（提取、盐析、透析、 浓缩、柱层析—离子交换、分子筛/亲和层 析）
表达载体
由克隆载体改造而来，按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真 核基因的编码序列，在大肠杆菌等细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆 载体。
。
克隆载体 表达载体
通过诱导控制表达，可 防止基础表达（渗漏表 达）P88
转录是由RNA聚合酶在启动子部位启动RNA转录的过程。
30
purification
Protocol
克隆
筛选转化子
（酶切、PCR、杂交）
小量表达
（活性、特异性检测）
大量表达
分离纯化
功能、应用
思考题
大肠杆菌表达载体比克隆载体多了哪些功 能元件，各有什么生物学功能？ T7噬菌体启动子的表达载体是如何控制渗 漏表达？
OVer!!!!
6His, GST, FBD,CBD MCS
Xa et al rrnB T1T2
PL,PR
RBS
cI(ts857) Ampr 30℃,40 ℃
ori
cI(ts857)
表达载体调控展示
大肠杆菌
signal peptide
6His, GST, FBD,CBD
RBS
Lac O
PT7
Lac O
MCS
rrnB T1T2
基因工程的基本步骤
题1 克隆
EcoR I Nde I
Eco Nde I RI
Hind III EcoR I Pst I
Hind III
Hind III EcoR I
BamH I
Vector
Gene
37℃,1h
37℃,1h
ol
14 ℃, 6h or overnight, then store at -20 ℃
Cell
Transform
37℃, 45min PCR, Sequence
37℃, 16-20h
Protocol
White-blue colour selection
题2 克隆表达
Sma I EcoR I 10 TAG
Sal I Pst I 10
ATG
Vector
Gene
37℃,1h
37℃,1h
37℃,200rpm, OD600=0.4-0.8 42℃,200rpm, 3-5h
purification
Protocol
肠激酶
pGEX-6P-3
Vector
Gene
37℃,1h
37℃,1h
Protocol
14 ℃, 6h or overnight, then store at -20 ℃
Cell
P90倒数2段
该载体具有以下优点：
③可方便地从融合蛋白中获取单一外源蛋白。 在pGEX多克隆位点上游有一个位点特异的 蛋白酶(如凝血酶、prescission protease， Factor Xa)识别和切割位点，可方便地将 所需蛋白从融合蛋白中切出并纯化。所以， 近年来该系统已广泛地应用于基因表达、 分子免疫学、疫苗生产及DNA蛋白质相互作 用的研究等。
signal peptide
6His, GST, FBD,CBD
RBS
6His, GST, FBD,CBD Ptac
Xa et al
Ptac
Lac O
MCS
rrnB T1T2
Xa et al
Lac I
Lac I Ampr
ori Lac IIq Lac
IPTG 表达载体调控展示 大肠杆菌
signal peptide
第四节 表达载体p87
expressing vector
GST-VP110c 的表达和纯化的SDS-PAGE
M. 低分子量标准蛋白； 1. pET-GST 空载体诱导表达； 2. pET-GST-VP110c 未诱导菌液； 3. pET-GST-VP110c 诱导表达； 4. 纯化的蛋白。
极端例子：病原体蛋白，珍稀生物，人
CBD 几丁质结合域 intein内含肽 MCS 多克隆位点
（8）分泌表达载体
除了在细胞内表达外，还可让表达的蛋白分泌到 细胞外或细胞周质区中。 这种表达方式可避免细胞内蛋白酶的降解，或使 表达的蛋白正确折叠，或去除 N-- 末端的甲硫氨 酸，从而达到维护目标蛋白活性的目的。
利用信号肽序列作为融合标签可将融合蛋白分泌 到细胞外，可利用的信号肽有碱性磷酸酶的信号 肽和蛋白质 A 的信号肽。
Transform
37℃, 45min PCR, Sequence, Express
37℃, 16-20h
Protocol
37℃,200rpm,OD600=0.4-0.8 IPTG(1 mmol / L)，200r/min,3-5h
37℃,200rpm, OD600=0.4-0.8 IPTG(1 mmol / L)，200r/min,3-5h
非融合 蛋白
p90
p90
谷胱苷肽巯基转移酶与目的基因产物的融合体，即融合蛋白，具有酶的活性。
组成成分： 含有启动子(tac)及lac操纵基因、 SD序列 谷胱苷肽巯基转移酶(GST)基因，蛋白酶切割 位点序列，克隆的外源基因则与GST基因及蛋白 酶切割位点相连。
肠激酶
肠激酶
pGEX-6P-3
凝血酶
Xa 因子
肠激酶
（4）6×His标签融合蛋白表达系统
该系统为Ni-NTA基质对带6个组氨酸残基的重组 蛋白质具有亲和层析的高效原核表达系统， 优点：①6×His比其它标记更小，可用于任何表 达系统，包括酵母、杆状病毒和哺乳动物细胞表 达系统，不影响蛋白质的结构和功能，无需蛋白 酶把6×His切除（也可用Xa因子切除）。②生理 pH条件下6×His不带电荷，所以不影响蛋白质的 分泌。③因5×His免疫原性差，所以无需去除 6×His, 重组蛋白可直接用作抗原产生所需抗体。
p89
T7
lacUV5 启动子
T7 RNA聚合酶
表达载体
lacI
无诱导物 有诱导物
lacI
宿主细胞（溶原菌）
如何更有效控制 渗漏表达p89
RBS可由目的基因自己带入，也可用载体上的，后者必须要求重组后，具有正确阅读框。 ATG与RBS位点之间的距离符合翻译起始要求，一般间隔3-11 bp。