心肌检测标志物_肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究解读
心肌标志物实验室检测及临床应用
1 .急性心肌梗死 (AMI)
临床应用
心肌梗死发生后3~8h，血清CK开始上升，可高达正 常上限的10~ 12倍，较少超过30倍，10~36h达到高 峰， CK 对心肌梗死诊断较AST、LDH 的特异性高, 但此酶增高的持续时间较短, 2~ 4 d 就恢复正常。 CK活性测定有助于心肌梗死病人的早期诊断，其增 高的程度与心肌损坏的程度基本一致。在AMI病程中， 如CK再次升高，表明心肌再次梗死。溶栓治疗后心 肌再灌注时，CK活性成倍增加。
Mb 对AMI 的阴性预测值高达100%
2、急性心肌梗死溶栓治疗
溶栓治疗后，溶栓成功者, Mb会出现一较小新 峰, 并在溶栓后2h 明显下降提示再灌注成功。
3.判断再梗死 由于M b 回复快, 故为判断再梗死的良好指标, 优于cTnI和CKMB, 通常再梗死者动态观察Mb 将出现新峰。
4、骨胳肌损伤
肌酸激酶(CK)活性 自从1967年成功地发现CK 对心 肌和肌肉病变有显著的诊断价值, CK 就成为检测心肌损伤的标志 物, 时至今日CK 的升高还是诊 断人类肌病的最敏感的方法。
主要存在于骨胳肌、心肌和脑组织的胞质和线粒体 中。CK催化肌酸与ATP之间高能磷酸键转换生成 磷酸肌酸和ADP的可逆反应，为肌肉收缩和运输系 统提供能量来源。健康人血清中CK含量甚低，当 上述组织受损时，CK进入血液中，使其CK活性明 显升高。
CK-MM
CK-BB
主要存在于脑、前列腺、 肠、肺、膀胱、子宫、胎 盘及甲状腺中。
变化规律---CK和CK-MB在AMI发生后4~6小时即 可超过正常上限，24小时达峰值，48~72小时恢复 正常。
正 常 上 限
4-6h 24h
在20世纪60~70年代，CK-MB成为世界上应用 最广泛的心肌损伤指标。不但可以早期诊AMI， 也可以估计梗死范围大小或是否再梗死。
心脏标志物检验结果解读
心脏标志物检验结果解读心脏标志物也称为心肌损伤标志物，主要应用于急性心肌梗死。
一个理想的心肌损伤标志物除了高敏感性和高特异性外，还应该包括如下几方面:①主要或仅存在于心肌组织，可反映心肌小范围的损伤;②能检测早期心肌损伤，窗口期长;③能评估梗死范围大小，判断预后;④能评估溶栓治疗的效果。
传统的心脏标志物是心肌酶谱，包括门冬氨酸氨基转移酶，乳酸脱氢酶及其同工酶，肌酸激酶及其同工酶。
20世纪80年代中期以来先后应用心肌肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白I和肌红蛋白作为心脏标志物。
另一个重要进展是脑钠肽（B钠尿肽）应用于心力衰竭的诊断。
1.门冬氨酸氨基转移酶（英文缩写AST/GOT）门冬氨酸氨基转移酶的曾用名为谷草转氨酶。
【参考区间】连续监测法:5~60U/L。
赖氏比色法:8~28（卡门单位）。
【解读要点】（1）由于AST在心肌细胞内含量较多，当心肌细胞损害时，AST 的变化比ALT（丙氨酸氨基转移酶）敏感。
（2）AST在急性心肌梗死发生后6~12小时升高，24~48小时到达高峰，持续到第五天或一周后下降。
（3）由于AST敏感性不高，特异性较差，现在已逐渐淡出，为其他项目所取代。
2.乳酸脱氢酶（英文缩写LDH/LD）及其同工酶【参考区间】与“四、肝功能检验结果解读”相同。
【解读要点】（1）心肌梗死发病12~24小时，血中LD开始上升，48~96小时达到高峰，10~14天恢复正常，高峰平均值为正常的2~4倍。
对发病已数天，AST已恢复正常者，LD测定仍有较大意义。
（2）充血性心力衰竭，LD升高。
（3）LD同工酶:95%的心肌梗死患者LD1/LD2超过正常，致使LD 同工酶谱呈现LD1>LD2>LD3>LD4>LD5。
LD1/LD2>1可作为诊断急性心肌梗死的特异指标。
LD1升高还可见于急性心肌炎、心包炎等。
心肌损害发生后LD1活性升高可早于血清总LD升高。
3.肌酸激酶（英文缩写CK）及其同工酶【参考区间】CK连续监测法:男性:38~174U/L;女性:26~140U/L。
第十五章心肌标志物检验
第十五章心肌标志物检验概述心肌标志物检验是使用生物化学方法来检测心肌损伤的指标，通常用来协助诊断心肌梗死、心肌炎、心肌病等心血管疾病。
常见的心肌标志物包括肌钙蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶等。
肌钙蛋白肌钙蛋白是目前应用最广泛的心肌标志物之一，能够敏感地反映心肌细胞损伤的程度。
在心肌细胞受到损伤后，钙离子会进入细胞内，刺激肌钙蛋白释放出来。
因此，在心肌梗死等情况下，肌钙蛋白的水平会显著升高。
肌钙蛋白检测是一项高度敏感的检验方法，通常使用免疫测定法进行检测。
常见的检测方法包括化学发光、免疫层析、酶联免疫吸附等技术。
肌红蛋白肌红蛋白是一种含有血红素的酸性蛋白，主要存在于心肌细胞、骨骼肌细胞等组织中。
当心肌细胞受到损伤时，肌红蛋白会释放到血液中，从而成为心肌损伤的指标之一。
肌红蛋白检测相对于肌钙蛋白，具有更短的半衰期，因此在开始损伤后能够更快地检测到心肌细胞的变化。
同时，肌红蛋白水平与心肌损伤的面积呈正比，因此在评估心肌梗死的严重程度时，肌红蛋白也是一项重要的检测指标。
肌酸激酶肌酸激酶又称为肌酸磷酸激酶，是一种存在于肌肉组织、心肌细胞中的酶类物质。
在心肌受到损伤后，肌酸激酶会释放到血液中。
肌酸激酶水平的升高能够提示心肌损伤的发生，但是肌酸激酶的半衰期比较长，因此在检测时要比肌钙蛋白和肌红蛋白稍微耗时一些。
肌酸激酶的检测主要采用酶动力学法、放射免疫等方法。
此外，近年来还有一些新型的心肌标志物开始得到应用，例如心肌特异性脂肪酸结合蛋白、高敏感性肌钙蛋白T等。
心肌标志物的检测是一种方便、可靠的方法来判断心血管疾病。
与传统的心电图、超声心动图检查相比，心肌标志物的检测更加敏感、稳定，能够更快地反映心肌损伤的情况。
因此，在心血管疾病的诊断和治疗过程中，心肌标志物的检测也变得越来越重要。
心肌检测标志物_肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究
第38卷第2期东北师大学报(自然科学版)Vol.38No.2 2006年6月Journal of Northeast Normal University(Natural Science Edition)J une2006[文章编号]100021832(2006)022*******心肌检测标志物———肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究马玉芹1,张淑华2,范丽颖2,董 龙3,钱海刚2,丘瑜敏2(1.长春理工大学材料与化工学院,吉林长春130022;2.长春理工大学生命科学学院,吉林长春130022;3.吉林大学环境科学与资源学院,吉林长春130021)[摘 要] 肌红蛋白主要存在于心肌和骨骼肌中,具有携带氧并将其分配到生物体各个部位的作用.研究表明,心血管病人发病早期,心脏中的肌红蛋白会大量释放入血,使其成为检测急性心肌梗死的良好标志物.采用HR100凝胶过滤层析和DEAE-52离子交换层析技术,从猪心中对肌红蛋白进行了分离与纯化,后经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,得到了纯化的肌红蛋白,并利用Ph.D-7噬菌体展示肽库试剂盒对肌红蛋白特异性亲和配体进行了筛选,最终得到其特异性亲和配体序列,从而使其试剂盒的研制与应用成为可能.[关键词] 肌红蛋白;HR100;纯化;肽库筛选[中图分类号] Q513+.4 [学科代码] 180・1710 [文献标识码] A0 引言肌红蛋白(myoglobin,MB)是肌组织所特有的一种单肽键蛋白质[1],主要生物学功能是结合氧并携带氧,是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质,在心肌中含量丰富.心肌蛋白是心肌细胞胞浆蛋白,相对分子质量为17800,它在早期心肌缺血的研究中早有报道[2-3].当心肌或骨骼肌有损伤时,肌红蛋白便释放入血液中,使血中肌红蛋白明显增高.如心肌梗死发病后4～12h内,血清中肌红蛋白可达高峰,48h恢复至正常水平[4].因此,肌红蛋白成为近年来测定急性心肌梗死(AM I)的一项重要生物学指标.本文对心肌蛋白的分离纯化及配体筛选进行了具体研究,为其试剂盒的研制与应用打下了基础,使其临床诊断成为可能.1 材料与方法1.1 材料,仪器材料:新鲜猪心(市售).仪器:组织捣碎机,高速离心机,超声波破碎仪,SL-2层析柜,紫外检测仪,记录仪,TH-1000梯[收稿日期] 2005211221[基金项目] 吉林省科技发展计划项目(20030450).[作者简介] 马玉芹(1968-),女,博士研究生,副教授,主要从事环境生物学研究.度混合器,凝胶成像仪,电泳装置,超净工作台,干燥箱,高压灭菌锅,移液枪,分析天平,恒温培养箱等.低相对分子质量标准蛋白(购于上海生化试剂所),Ph.D -7噬菌体展示肽库试剂盒(购于BioLabs 公司),Sephacryl HR100柱料(购于鼎国试剂公司),DEAE -52柱料(购于鼎国试剂公司),其他试剂购自鼎国、北京益利试剂公司(均为分析纯).1.2 方法1.2.1 组织提取物的制备将新鲜猪心与一定量的p H 为8.5的10mmol/L Tris -HCl 缓冲液混合置于组织捣碎机中捣碎3min ,然后将匀浆物于高速离心机(10000r/min )中离心90min ,弃去沉淀,保留上清液.1.2.2 盐析沉淀上清液用1mol/L NaOH 调p H 至7.4,后将此上清液用80%的硫酸铵盐析沉淀,10000r/min 离心30min ,去上清,沉淀用少量磷酸盐缓冲液溶解,并置于透析袋中4℃透析过夜.1.2.3 Sephacryl HR100柱层析取一定量的透析液上Sephacryl HR100柱,控制流动相的流速,收集相对分子质量为10000～20000的蛋白质.然后将此蛋白提取液用聚乙二醇(PEG )浓缩,并用p H 值为8.5的10mmol/L Tris -HCl 缓冲液透析过夜.峰1为高相对分子质量杂质峰;峰2为含肌红蛋白的峰;峰3为低相对分子质量杂质峰.图1 Sephacryl HR 100柱层析过程中样品吸光度变化情况1.2.4 DEAE -52柱层析将透析液上DEAE -52柱,然后采用线性梯度法进行洗脱,洗脱液为0～300mmol/L NaCl 和p H 值为8.5的10mmol/L Tris -HCl 缓冲液.分别收集不同峰值的蛋白组分.1.2.5 SDS -PA GE 电泳利用SDS -PA GE 电泳对上述各步骤、不同峰值获得的样品分别进行鉴定,经与标准蛋白相对照确定肌红蛋白所在的峰,并对其进行收集,冷冻干燥后得纯品肌红蛋白.1.2.6 Ph.D -7噬菌体展示肽库筛选筛选步骤按Ph.D -7噬菌体展示肽库试剂盒的说明进行.具体为:将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板共同温育,先洗去未结合噬菌体,然后洗脱特异性结合的噬菌体.对洗脱的噬菌体进行扩增,然后再进行下一轮结合/扩增循环,以富集可结合序列.经3轮淘选后,通过DNA 测序对每个可结合克隆进行定性.2 结果与讨论2.1 结果2.1.1 Sephacryl HR100柱层析过程中洗脱液出峰情况在Sephacryl HR100凝胶层析过程中,流出液随时间延长其出峰情况如图1所示.分别收集各峰样品进行电泳.电泳结果表明,肌红蛋白存在于第二个峰中.收集第二峰,走DEAE -52离子交换柱,并收集不同峰值的蛋白组分,电泳结果表明,经离子交换后获得了纯的肌红蛋白(见图2).2.1.2 盐析、Sephacryl HR100柱层析及DEAE -52柱层析粗提液用80%的硫酸铵盐析沉淀后,离心去上清,对沉淀进行透析,并取样进行电泳,结果见图2.2.1.3 SDS -PA GE 电泳将粗提的样品、经硫酸铵处理的样品、经Sephacryl HR100柱层析的样品、经DEAE -52离子交换柱层析的样品进行电泳实验,结果见图2.511第2期马玉芹,等:心肌检测标志物———肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究从图2可知,粗提液中蛋白的种类较多(2泳道),蛋白之间不能很好分辨清楚;盐析样品中蛋白的种类有所减少(泳道3),电泳图谱较清楚;Sephacryl HR100凝胶样品中蛋白只剩两种(泳道4,样品未浓缩);经DEAE -52离子交换柱层析后的样品只留下一条带,表明已经纯化得到一种蛋白,且相对分子质量约为17800.1标准蛋白;2粗提液;3硫酸铵处理后样品;4Sephacryl HR100柱层析后样品(未浓缩);5,6,7DEAE -52柱层析后样品.图2 Sephacryl HR 100柱层析与DEAE -52柱层析电泳结果2.1.4 Ph.D -7噬菌体展示肽库筛选利用Ph.D -7噬菌体展示肽库对心肌蛋白的特异性亲和配体进行了三轮筛选,前两轮为非特异性筛选,第三轮为特异性筛选,结果如下:(1)第一轮洗脱物滴度为6.5×103个/μL ,收率为3.74×10-6;(2)第二轮洗脱物滴度为1.21×105个/μL ,收率为6.96×10-5;(3)第三轮洗脱物滴度为3.7×106个/μL ,收率为2.03×10-3.对第三轮洗脱物挑斑测序,得其特异性亲和配体序列为:Arg -His -Pro -His -Leu -Val -Ser.2.2 讨论肌红蛋白的相对分子质量约为17800,等电点为6.9.根据其两性蛋白质性质,本实验主要采取了盐析、凝胶层析与离子交换层析三种分离纯化方法.其中盐析法的采用非常必要,粗提液经80%硫酸铵沉淀后,绝大部分杂蛋白会变性,但肌红蛋白的活力没有受到影响.经过此步,部分杂蛋白被除去,样液体积也大大减少,便于后续操作.凝胶层析法主要是根据凝胶的分子筛效应,将相对分子质量大小不同的蛋白质相分离,本实验采用的Sephacryl HR100柱料理化性质稳定,且分离效率很高.实验结果表明,采用此柱料分离肌红蛋白效果较好.根据肌红蛋白表面的电荷效应,本实验采用DEAE -52离子交换柱料对其进行进一步纯化,离子交换后的电泳结果表明,利用DEAE -52纯化肌红蛋白是理想的,获得了肌红蛋白纯品.本文利用噬菌体展示肽库技术,以纯化的心肌蛋白为靶分子筛选其特异性亲和配体,三轮收率逐渐提高,第三轮洗脱物测序结果专一性较强,说明利用七肽库筛选结果较理想.3 结论肌红蛋白是第一个被确定的具有三级结构的蛋白质,主要生物学功能是结合氧[5],是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质.正常人的血液中肌红蛋白含量很少,当心肌或骨骼肌有损伤时,肌红蛋白便释放入血液中,使血中肌红蛋白明显增高,故肌红蛋白是用于心肌损伤检测的标志物[6].其对急性心肌梗死的检测具有重要的诊断意义.本实验主要是通过Sephacryl HR100凝胶层析和DEAE -52离子交换层析对匀浆、离心后的猪心进行分离纯化,每步纯化都经过SDS -PA GE 分析,结果证明,经过一系列分离纯化步骤可以得到电泳纯的肌红蛋白.噬菌体展示是一种体外筛选技术.噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA 编码序列之间建立了直接联系,使得各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过一种被称为淘选(panning )的体外选择程序得以快速鉴定[7].本文以分离纯化的心肌蛋白为靶分子,利用噬菌体展示随机肽库进行了三轮筛选,最终获得专一性较强的亲和配体,这为心肌蛋白试剂盒的临床研制与应用提供了可能.611东北师大学报(自然科学版)第38卷[参 考 文 献][1] 闵建雄.肌红蛋白及其法医学意义探讨[J ].法学杂志,1998(5):89-94.[2] KEN T S P.Diffusion of myoglobin in the diagnosis of early myocardial ischemia[J ].Lab Invest ,1982,46(3):265-270.[3] NOMO TO K I ,MORI N ,SHOJ I T ,et al.Early loss of myocardial myoglobin detected immunohistochemically following occlusion ofthe coronary artery in rats[J ].Exp Mol Pathol ,1987,47(3):390-402.[4] 贺兆发,刘云宝,陆春风.急性心肌梗塞时血清肌红蛋白动态变化的动物及临床实验研究[J ].中国心血管病杂志,1996,24:392.[5] 孙京新,周光宏.猪肉中氧合肌红蛋白的分离纯化特征研究[J ].食品科学,2002,23(12):27-37.[6] 郑佐娅.心血管疾病的生化标志物[J ].诊断学理论与实践,2004,3(3):221-222.[7] WDERSTEN M ,MANN ERVIK B.G lutathione transferases with novel active sites isolated by phage display from a library of randommutants[J ].J Mol Biol ,1995,250(2):115-122.The study on purif ication and aff inity ligand of myoglobin —a ne wmaker for detection of AMIMA Yu 2qin 1,ZHAN G Shu 2hua 2,FAN Li 2ying 2,DON G Long 3,Q IAN Hai 2gang 2,Q IU Yu 2min 2(1.College of Material and Chemical Engineering ,Changchun University of Science and Technology ,Changchun 130022,China ;2.School of Life Sciences ,Changchun University of Science and Technology ,Changchun 130022,China ;3.College of Environment and Resources ,Jilin University ,Changchun 130021,China )Abstract :Myoglobin is composed of a heme prosthetic group and a polypeptide chain (globin )which have 152residues.Myoglobin exists mainly in myocardium ,cardiac muscle and the skeletal muscle.Myoglobin can store and assign the oxygen to all over the cell and tissue of the creature.It is proved recently that myo 2globin can be used as a good biological marker for detection of acute myocardial infarction (AM I ).In this thesis ,obtained myoglobin from bovine heart muscle using Sephacryl HR100filtration chromatography and DEAE -Sephacel ion -exchange chromatography.After SDS -PA GE get the pure product.Myoglobin is a sensitive maker which can be used in diagnosis of the sudden death from myocardial ischemia.The specific sequence of affinity ligand was obtained with the Ph.D -7phage display peptide library kit.The results make it possible for clinical development and application of the kit.K eyw ords :myoglobin ;HR100;purification ;peptide library selection(责任编辑:方 林)711第2期马玉芹,等:心肌检测标志物———肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究。
生物标记物的化学分离和分析技术
生物标记物的化学分离和分析技术生物标记物是指体内或体外存在的物质，能够反映机体健康状况、生理状态和疾病的发展程度，具有重要的生物学意义和临床应用价值。
化学分离和分析技术是生物标记物研究的重要手段，其发展对人类健康的保护和医学科学的进步具有重要意义。
一、生物标记物的特点和种类生物标记物具有起源单一、结构独特、代谢稳定、分布特异、含量丰富等特点。
根据其来源、性质和应用领域，可分为以下几类：1. 蛋白质类标志物：代表性标志物包括血清肌酸激酶、C反应蛋白、肌红蛋白等，可用于心脑血管疾病、肝肾功能损伤、恶性肿瘤等疾病的诊断和病情监测。
2. 核酸类标志物：代表性标志物包括微小RNA、DNA甲基化等，可用于肿瘤、心血管疾病等疾病的诊断和疗效观察。
3. 代谢物类标志物：代表性标志物包括葡萄糖、甘油三酯等，可用于糖尿病、高血脂等疾病的诊断和治疗。
4. 小分子类标志物：代表性标志物包括铁、钙、硒等微量元素，可用于贫血、疲劳症候群等疾病的诊断和治疗。
二、生物标记物的化学分离技术生物标记物的化学分离技术是生物标记物研究的重要手段之一，包括离子交换、亲和层析、凝胶过滤、透析等技术。
这些技术是将生物标记物与其他物质分离，集中、纯化，从而方便后续的分析和研究。
其中，离子交换色谱技术是一种基于物质的电荷差异进行分离的技术。
它可以将带电荷的物质与具有相反电荷的离子树脂分离，达到纯化的目的。
亲和层析技术是一种基于分子间结合力进行分离的技术。
它利用某些分子间的化学结合力，将目标分子与相应的亲和柱中的配体结合，经冲洗等步骤，将目标分子纯化。
凝胶过滤技术主要利用生物分子不同的分子量进行分离的技术，将生物分子按照大小分离。
透析技术是一种利用半透膜将分子按其分子量和分子性质进行分离的技术。
三、生物标记物的化学分析技术生物标记物的化学分析技术主要包括光谱分析、电化学分析、质谱分析等。
这些技术是将化学分离得到的生物标记物进行解析和定量，为研究生物标记物提供了重要的依据。
心肌损伤标志物分析解析
RIA
CK-MB 质量法
肌钙蛋白
cTnT
cTnI
更特异，更敏感
4
高敏肌钙蛋白
hs-cTnT 中国
hs-cTnT 欧洲
1990
2000 AMI重新定义
2000
2007 MI的通用定义
2011 ESC 指南 - NSTEMI
2012 AMI重新定义第三版
2010 2012
hs-cTnI 欧洲
心肌损伤后，肌钙蛋白灵敏度和特异性最高
2-3小时 1-2天
＋＋＋ ＋＋＋
肌钙蛋白T（Troponin T）
38
3-4小时 7-14天 ＋＋＋＋ ＋＋＋＋
肌酸激酶(CK)
天冬氨酸转氨酶(Aspartate transaminase)
乳酸脱氢酶（LDH）
96
4-6小时 2-3天
103 6-10小时 3-5天
135 6-10小时 5-7天
＋＋ ＋＋ ＋＋
肌红蛋白
比CK-MB 和标准肌钙蛋白释放 早: AMI发作后2小时其浓度即
在血液中升高
无心肌特异性，在骨骼肌损伤 时也释放；心梗的早期排除
心肌肌钙蛋白
100 % 心肌特异且灵敏度极高, 特别是 hs-cTn检测
阳性结果非心肌梗死特有，但 Βιβλιοθήκη 肌损伤后检测结果一定是阳性
6
急性心肌梗死(MI)后心脏标志物的分泌
87.50（14/16 ）
66.66（12/18 ）
38.89（7/18）
66.66（28/42 ）
64.29（27/42 ）
57.89（22/38 ）
42.11（16/38 ）
46.42（13/28 ）
纯化及鉴定实验报告
纯化及鉴定实验报告
引言
本实验旨在分离、纯化和鉴定血浆抗体。
血浆抗体是免疫系统
抵抗外来病原体的重要组成部分，对于抗体的纯化和鉴定可以为疾
病诊断和治疗提供重要参考。
实验方法
1. 血浆样品采集：收集健康人士的血浆样品，并进行初步筛选，排除病原体感染者。
2. 抗体分离：采用某种分离方法（如凝胶过滤、电泳或亲和层析）将血浆中的抗体分离出来。
3. 抗体纯化：对分离得到的抗体样品进行纯化处理，去除杂质
和其他成分，使抗体得到更高纯度。
4. 抗体鉴定：通过某种特定的实验方法（如酶联免疫吸附试验、荧光染色或免疫荧光）对纯化得到的抗体进行鉴定，确认其特异性
和活性。
实验结果
1. 成功分离和纯化了血浆中的抗体样品。
2. 经过鉴定的抗体样品表现出特异性和活性，证实其对特定病原体或抗原的识别和结合能力。
结论
通过本实验的分离、纯化和鉴定过程，成功获得了高纯度、特异性和活性的血浆抗体样品。
这为后续的疾病诊断和治疗研究提供了有价值的参考。
参考文献
（如果有的话，请列出参考文献）。
心肌损伤标志物检验
心肌损伤标志物检验心肌损伤标志物检验是一种常见的临床检查项目，用于判断心脏是否存在损伤和疾病。
这个检验是通过对血液中心肌特异性蛋白质和酶的测量来进行的。
在正常情况下，这些蛋白质和酶都不会存在于血液中，但当心肌受损时，它们会通过血流释放到血液中，从而成为心肌损伤的标志物。
常见的心肌损伤标志物肌红蛋白（Myoglobin）肌红蛋白是在心肌受损后最早能够被检测到的标志物之一。
它是一种蛋白质，广泛存在于骨骼肌和心肌中。
当心肌细胞受损时，肌红蛋白会从心肌细胞中释放，并快速进入到血液中。
因此，肌红蛋白的检测可用于早期监测急性冠脉综合征（ACS）的预后。
肌酸激酶（CK）肌酸激酶（CK）是一种在骨骼肌组织、心肌组织和其他组织中存在的酶类。
当这些组织受损时，CK会被释放到血液中。
因此，CK的检测可以用于检测心肌损伤，包括急性心肌梗死。
肌钙蛋白（cTn）肌钙蛋白(cTn)是一种高度特异性的心肌标志物，由于释放到血液中的cTn不存在于正常血液中，因此被称为心肌特异性标志物。
在心肌细胞受损时，cTnI和cTnT（两种常见形式）从心肌细胞中释放，可用来检测急性心肌梗死、稳定性心绞痛和其他心血管疾病。
心肌损伤标志物检验的操作和结果分析心肌损伤标志物检验主要是通过血样取自患者的静脉或足背的动脉来完成的，一般情况下即采用标准化的化学发光免疫分析法或者酶联免疫分析进行检测。
在分年龄性别等典型人群样本中，心肌损伤标志物的正常检测结果是在其对应的参考值范围内检测出来的。
在未受损肌肉的情况下，这些标志物通常不会存在于血液中。
当存在心肌损伤或心脏疾病时，这些标志物的水平就会升高，并由此反映心肌损伤的严重程度。
需要注意的是，不同的标志物在不同情况下对心肌损伤的敏感度和特异性不同。
科学合理地选择心肌损伤标志物的检测有助于提高诊断的准确度。
心肌损伤标志物检验是临床常规检查中的一个重要项目，可以用来监测心肌疾病的发展和处理效果。
通过对不同标志物的检测，可以更准确地判断病情的严重程度和预后。
心肌三项的检测方法
心肌三项的检测方法
心肌三项检测通常指的是心肌酶三项检测，包括肌红蛋白（Myoglobin，Mb）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）和心肌肌钙蛋白 I（cTnI），是用于评估心肌损伤的常用指标。
以下是心肌三项的检测方法：
1. 肌红蛋白检测：肌红蛋白是一种存在于心肌和骨骼肌中的蛋白质。
检测肌红蛋白的方法通常是通过免疫学检测，使用特异性抗体与样本中的肌红蛋白结合，然后通过比色法、荧光法或化学发光法等技术进行定量检测。
2. 肌酸激酶同工酶检测：肌酸激酶同工酶是心肌细胞中的一种酶。
检测肌酸激酶同工酶的方法通常也是通过免疫学检测，使用特异性抗体与样本中的肌酸激酶同工酶结合，然后进行定量检测。
3. 心肌肌钙蛋白 I 检测：心肌肌钙蛋白 I 是心肌细胞中的一种蛋白质，对心肌损伤具有高度的特异性。
检测心肌肌钙蛋白 I 的方法通常也是通过免疫学检测，使用特异性抗体与样本中的心肌肌钙蛋白 I 结合，然后进行定量检测。
这些检测方法通常使用血液样本，如血清或血浆。
在检测过程中，样本中的心肌三项指标与相应的特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，然后通过各种检测技术进行定量分析。
需要注意的是，心肌三项的检测结果需要结合临床症状、病史和其他检查结果进行综合评估，以确定是否存在心肌损伤或心肌梗死等情况。
如果检测结果异常，医生可能会进一步进行其他检查或采取相应的治疗措施。
心肌标志物三合一胶体金免疫层析法的性能评价
心肌标志物三合一胶体金免疫层析法的性能评价发表时间：2014-04-02T15:32:24.577Z 来源：《中外健康文摘》2013年36期供稿作者：邹超世1 谢钰玲2 梁建华1 吴鹏[导读] 胶体金免疫层析法能更早期、方便地对心肌梗死进行筛查和诊断，及时干预治疗因而便于在临床推广，特别是基层医院。
邹超世1 谢钰玲2 梁建华1 吴鹏3（ 1 广西玉林市第一人民医院检验科 537000）（ 2 广西玉林市妇幼保健院检验科 537000）（ 3 广西玉林市第一人民医院心内科 537000）【摘要】目的分析评价三联合一胶体金法心功酶检测卡临床检测性能。
方法以化学发光法为相对标准，从灵敏度、特异度、重复性、检出限等方面评价某国产三联合一胶体金法检测卡测定血清肌红蛋白(Mb)、肌酸激酶同工酶(CK-MB) 和肌钙蛋白I(cTnI) 的临床检测性能。
结果与化学发光法比较，胶体金法所测CK-MB，Mb 和cTnI 的相对敏感度分别为45.7%，37% 和65.7%。
相对特异度分别为88.8%，95.2% 和90.7%，相对准确度分别为88.7%，83% 和94.1%。
检测卡最适标本量为120ul，观察结果最佳时间为10m in，检测结果在20m i n 之内稳定。
该方法重复性良好，实验不受溶血、脂血的干扰。
结论心肌标志物三合一胶体金法的特异度和准确度相对较好，但敏感度偏低。
作为心肌标志物的急诊检测方法，国产试剂有必要进一步提高其临床检测性能。
【关键词】胶体金法心肌梗死性能评价【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）36-0030-03目前，心血管疾病严重威胁着人类的健康，是造成人类死亡的主要原因之一[1-2]。
目前用于心肌梗死诊断的主要心肌标志物包括肌红蛋白(Mb)、肌酸激酶同工酶(CK-MB) 和肌钙蛋白I(cTnI)[3-4]，检测方法主要为免疫分析法、化学发光法，胶体金免疫层析法等[5]。
心肌标志物解读ppt课件
用于诊断心衰和评估心衰的严重程度，有助于医生制定合适的治疗方案。
心肌标志物的检测方法
酶联免疫法
通过酶与底物的显色反应，检测心肌标志物的浓 度。具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点 。
免疫荧光法
通过荧光标记抗体与心肌标志物的特异性结合， 检测心肌标志物的浓度。具有快速、准确、自动 化等优点。
乳酸脱氢酶（LDH）
与其他引起乳酸脱氢酶升高的疾病如肝脏疾病、肺部疾病等进行鉴别。
04 心肌标志物在临床实践中 的应用
心肌标志物在心血管肌钙蛋白、肌红蛋 白和CK-MB等在心肌梗死发生后 释放到血液中，通过检测这些标 志物水平可辅助诊断心肌梗死。
鉴别诊断
心肌标志物有助于鉴别诊断其他 原因引起的胸痛，如心包炎、心
心肌标志物解读ppt课件
contents
目录
• 心肌标志物概述 • 心肌标志物的临床意义 • 心肌标志物的解读方法 • 心肌标志物在临床实践中的应用 • 心肌标志物研究展望
01 心肌标志物概述
心肌标志物的定义
01
心肌标志物是指在心肌损伤或心 肌细胞活性改变时，释放到血液 中的物质，用于诊断、监测和治 疗心肌相关疾病。
肌钙蛋白是心肌损伤的特异性标 志物，对心肌梗死的诊断有重要
意义。
CK-MB
肌酸激酶同工酶（CK-MB）是心 肌损伤的另一个重要标志物，尤其 在急性心肌梗死时明显升高。
AST和LDH
天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和 乳酸脱氢酶（LDH）也可用于心肌 损伤的诊断，但特异性相对较低。
心肌梗死标志物
肌红蛋白
好的诊断和治疗方案。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
心肌标志物
与CK-MB相比，TnI、TnT对心肌损伤的诊断 敏感性更高，特异性更强，持续时间更长。随着 对心肌肌钙蛋白的深入研究，无论是对心肌的特 异性还是敏感性，肌钙蛋白被认为是目前最好的 确定标志物，它正逐步取代CK-MB成为AMI的诊 断“金标准”。
NACB/IFCC/ESC/ACC关于cTn临床 应用的建议对检测试剂有何要求？
临床实践中已陆续发现多种反映心肌损伤的标志物， 包括心肌缺血损伤的标志物，如缺血修饰白蛋白、髓过氧 化物酶、CD40配体等；心肌缺血坏死早期暨发病6小时内 的标志物，如肌红蛋白、脂肪酸结合蛋白、糖原磷酸化酶 BB同工酶等。而AST、乳酸脱氢酶及其同工酶等因灵敏 度和特异性都相对较差，在心肌损伤的诊断检测中已不再 应用。
在考虑心肌梗死诊断时，心肌标志物检测结 果的评价应结合临床表现（病史、体格检查）和 心电图检查的结果。cTn或CK-MB质量的检测值 高于参考范围上限值的ACS病人存在心肌损伤， 结合相应的临床表现或心电图检测结果，可以考 虑诊断为心肌梗死，属于高危险性。
肌钙蛋白（Tn）的基本结构
肌钙蛋白是横纹肌收缩的重要调节蛋白，平 滑肌无肌钙蛋白。肌钙蛋白复合物由三个亚基组 成：肌钙蛋白C（TnC）、肌钙蛋白T（TnT）和 肌钙蛋白I（TnI）共同构成，参与由钙离子介导 的肌肉收缩活动的调节。
心肌型脂肪酸结合蛋白特异性亲和配体的筛选
心肌型脂肪酸结合蛋白特异性亲和配体的筛选
心肌型脂肪酸结合蛋白特异性亲和配体的筛选
心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是一种低相对分子质量的蛋白质,其相对分子质量为14 000～15 000,在心肌中含量丰富.H-FABP在脂肪酸的运输、脂类的代谢、调节细胞增殖与分化等方面具有重要的作用,是检测急性心肌梗塞(AMI) 的有效生物学标志物.以H-FABP为靶标,采用噬菌体表面展示随机十二肽库对H-FABP的特异性亲和配体进行了筛选,经四轮筛选得到一个ELISA检测阳性特征序列: W-P-H-Q-K-L-H-L-M-R-H-S,为临床检测急性心肌梗塞提供了一种新的方法.
作者：张淑华范丽颖马玉芹于源华徐镜波ZHANG Shu-hua FAN Li-ying MA Yu-qin YU Yuan-hua XU Jing-bo 作者单位：张淑华,ZHANG Shu-hua(东北师范大学城市与环境科学学院,吉林,长春,130024;长春理工大学生命科学技术学院,吉林,长春,130022) 范丽颖,于源华,FAN Li-ying,YU Yuan-hua(长春理工大学生命科学技术学院,吉林,长春,130022)
马玉芹,徐镜波,MA Yu-qin,XU Jing-bo(东北师范大学城市与环境科学学院,吉林,长春,130024)
刊名：东北师大学报（自然科学版）ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NORTHEAST NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2006 38(4) 分类号：Q513 关键词：心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP) 噬菌体展示肽库亲和配体。
《心肌标志物检查》课件
肌红蛋白 (MYO)
肌红蛋白是心肌细胞中的 一种蛋白质，在心肌受损 时会释放到血液中。
心肌肌钙蛋白 (cTn)
心肌肌钙蛋白是一种蛋白 质，它在心肌受损时会释 放到血液中，是心肌标志 物检查中最敏感的指标之 一。
检测方法
化学发光法
利用化学反应产生 的发光来测量心肌 标志物的浓度。
心肌标志物检查也可以辅助其他心血管疾病 的诊断，如心绞痛、心力衰竭等。
注意事项
1
检测前的准备和禁忌
在进行心肌标志物检查前，需要遵循医生的指导并告知医生过敏史等相关信息。
2
测试过程中的注意事项
在心肌标志物检查过程中，需要保持身体放松，遵循医生的指导进行操作。
3
检测结果的干扰因素
心肌标志物的浓度可能受到其他因素的影响，如运动、应激、药物等，需要综合 分析。
心肌标志物检查
心肌标志物检查是一项重要的心血管疾病诊断工具。本课件将介绍心肌标志 物检查的意义、常见心肌标志物、检测方法、结果解读、临床应用和注意事 项。
介绍
心肌标志物检查是一项重要的心血管疾病诊断工具。通过检测血液中心肌标志物的浓度变化，可以帮助 医生判断心脏是否受损。
常见心肌标志物
肌酸激酶 (CK)
3 不同心肌标志物之
间的比较
不同心肌标志物的浓度 变化可能有所不同，医 生会综合分析进行判断。
临床应用
急性心肌梗死
心肌标志物检查对于急性心肌梗死的早期诊 断和监测非常重要。
心肌病
心肌标志物检查对于心肌病的诊断和分类具 有重要意义。
心肌炎
心肌标志物检查可以帮助诊断心肌炎，并监 测治疗效果。
其他心血管疾病诊断
心梗标志物解读
心梗标志物解读
心梗标志物是指心肌梗死时通过化学、免疫学等技术手段检查血清水平，对于心肌梗死的诊断、疾病程度、治疗效果的评价具有重要意义。
主要包括肌钙蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶等。
1. 肌钙蛋白：心肌肌钙蛋白是心肌肌肉收缩的调节蛋白，包括三种亚基，即心肌肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白I、肌钙蛋白C，对于早期心肌损伤或坏死的诊断具有特异性强、灵敏度高的特点。
正常人外周血心肌肌钙蛋白I的含量相对较低，仅为0~0.3μg/L，当患者发生心肌梗死后，浓度迅速升高，患者心肌肌钙蛋白I>0.5μg/L，则考虑存在急性心肌梗死，一般在发病后3~6小时外周血中肌钙蛋白I出现升高，12~24小时达到高峰，可持续4~10天。
2. 肌红蛋白：肌红蛋白是一种氧结合血红素蛋白，主要分布于心肌和骨骼肌组织。
对于诊断是否会发生再次梗死和评价溶栓治疗具有重要意义，一般在心肌梗死发病后2小时内即可升高，12小时达到高峰，1~2天即可恢复正常。
3. 肌酸激酶同工酶：肌酸激酶同工酶是心肌酶的同工酶之一，主要存在于心肌，分为肌肉型、脑型、杂化型、线粒体型，对于诊断心肌梗死的范围具有重要意义。
心肌梗死发病后6小时内肌酸激酶出现升高，24小时可达到高峰，3~4天可恢复正常。
这些心梗标志物的升高并不一定就是心梗发作，患者应完善心电图等相关检查，在医生的综合判断下接受规范治疗。
心肌检测标志物——肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究
心肌检测标志物——肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究马玉芹;张淑华;范丽颖;董龙;钱海刚;丘瑜敏
【期刊名称】《东北师大学报：自然科学版》
【年(卷),期】2006(38)2
【摘要】肌红蛋白主要存在于心肌和骨骼肌中,具有携带氧并将其分配到生物体各个部位的作用.研究表明,心血管病人发病早期,心脏中的肌红蛋白会大量释放入血,使其成为检测急性心肌梗死的良好标志物.采用HR100凝胶过滤层析和DEAE-52离子交换层析技术,从猪心中对肌红蛋白进行了分离与纯化,后经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,得到了纯化的肌红蛋白,并利用Ph.D-7噬菌体展示肽库试剂盒对肌红蛋白特异性亲和配体进行了筛选,最终得到其特异性亲和配体序列,从而使其试剂盒的研制与应用成为可能.
【总页数】4页(P114-117)
【关键词】肌红蛋白;HR100;纯化;肽库筛选
【作者】马玉芹;张淑华;范丽颖;董龙;钱海刚;丘瑜敏
【作者单位】长春理工大学材料与化工学院;长春理工大学生命科学学院;吉林大学环境科学与资源学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q513.4
【相关文献】
1.心肌型脂肪酸结合蛋白的纯化及亲和配体的研究 [J], 张淑华;范丽颖;何秀霞;于源华;王丽萍;侯巍
2.一次过柱法快速分离纯化驴心肌中高铁肌红蛋白 [J], 李沛军;孔保华;郑冬梅;陈倩
3.亲和层析法分离纯化人心肌肌钙蛋白Ⅰ [J], 马宏伟;赵卫国;潘柏申
4.探讨溶血标本对心肌标志物肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白、肌红蛋白检测结果的影响 [J], 兰爱纯
5.双纳米金免疫试纸条联合检测急性心肌梗死标志物肌钙蛋白I和肌红蛋白 [J], 刘全良;王晓玲;任大勇;李晓民;石慧荣
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
心肌系列项目测定及意义
• 参考范围
• 11.6---73.0ng/ml（10—46ng/ml）
• 不同厂家参考范围有所差异
注意！
• 肌红蛋白在急性心肌梗塞的时候，上升较快，可 以做迅速诊断。但由于肌红蛋白存在于所有的肌 肉组织中，所以缺乏一定的特异性，请同时参考 其它项目指标。
• 骨肉注射，运动，按摩后值有所偏高。
临床意义
• 参考值 • <0.09ng/ml （<0.11ng/ml） • 不同厂家试剂的参考范围有所差异
• 肌钙蛋白（cTn）被认为是目前用于急性冠脉综合症（ACS） 诊断最特异的生化指标，它们出现早，最早可在症状发作 后2h出现；具有较宽的诊断窗：cTnT（5～14天），cTnI （ 4～ 10天）。在它们的诊断窗中，cTn增高的幅度要比 CK-MB高5～10倍。
心肌梗死（AMI）
• 在冠状动脉病变的基础上，发生冠状动脉血供急剧减少或 中断，使相应的心肌严重而持久地急性缺血性损伤和坏死。
• 临床表现：剧烈而持久的胸骨后疼痛与心肌梗死后相关的 全身症状；特异性心电图改变和血清心肌酶增高；可能发 生的严重心律失常、休克或心力衰竭，属冠心病的严重类 型。
• AMI常在饱餐或高脂饮食（血粘度增高，血小板粘附性增 强）、体力及情感负荷增大、用力大便时（心负荷增加） 以及睡眠后（血流缓慢，血小板易聚集，冠状动脉易痉挛） 发生。
• 血中升高：甲状腺功能减低症、高醛固酮血症、肾功能不 全、恶性高热以及剧烈运动后等。
• 尿中升高：卟啉病、血红蛋白尿症、血尿等。
肌钙蛋白
• 肌钙蛋白是组成横纹肌细丝的调控蛋白，包括3 个亚单位I、T和C，共同作用参于肌肉收缩活动。
• 肌钙蛋白的主要作用是抑制横纹肌肌动蛋白和肌 球蛋白之间的相互作用。
心肌标志物及临床意义
心肌蛋白检测
新标志物 除了以上物质可以反映AMI，新的标志物也出现
⍟ 肌球蛋白轻链（MLC）：比较稳定，发病后3-6h即可升高，4
天达高峰，持续10天左右，曲线也呈双峰 ⍟ 糖原磷酸化酶（GP）：胸痛2-4h开始升高，特性与CK-MB较
相似许多
⍟ 脂肪酸结合蛋白（FABP）：分子量（14-15KD）小，心肌中 含量比骨骼肌含量丰富，敏感性跟Mb相似，但特异性比其高。
心肌酶谱检测
乳酸脱氢酶（LDH）
LDH作为AMI标志物的不足之处
血中升高时间较迟，同工酶检测周期较长。 特异性低。 血中升高持续时间长，并且溶栓时多伴有溶 血，不能用于再灌注的诊断。
心肌酶谱检测
α-羟丁酸脱氢酶（αHBDH）
临床上还常选用a-羟丁酸脱氢酶（HBDH）作为急性心 肌梗死诊断指标。由于H亚单位和a-羟丁酸脱氢酶有较高亲 和力，含 H 亚单位的 LD 同工酶可催化 a- 羟丁酸脱氢。所以 a-羟丁酸脱氢酶可以代表除LD5外的其他同工酶（主要LD1 和LD2）活性。
心肌标志物及其临床意义 幻灯片专业制作2861423674
心肌标志物的概念
心肌标志物(cardiac biomarkers)
心肌标志物是指在循环血液中可测出的生物化学物
质，能够敏感、特异地反映心肌损伤及其严重程度，
因而可以用作心肌损伤的筛查、诊断、评定预后和随 访治疗效果的标志。 心脏标志物在正常情况下，主要或仅存在于心脏， 在心脏或心血管异常情况下由心脏大量释放。
Thank You!
目录
1
心肌酶（myocardial enzyme）
2
心肌蛋白（cardiac troponin）
3
总
结
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第38卷第2期2006年6月东北师大学报(自然科学版)JournalofNortheastNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.38No.2June2006 [文章编号]100021832(2006)022*******心肌检测标志物———2,董龙3,钱海刚2,丘瑜敏21.,吉林长春130022;2.长春理工大学生命科学学院,吉林长春130022;3.吉林大学环境科学与资源学院,吉林长春130021)[摘要]肌红蛋白主要存在于心肌和骨骼肌中,具有携带氧并将其分配到生物体各个部位的作用.研究表明,心血管病人发病早期,心脏中的肌红蛋白会大量释放入血,使其成为检测急性心肌梗死的良好标志物.采用HR100凝胶过滤层析和DEAE-52离子交换层析技术,从猪心中对肌红蛋白进行了分离与纯化,后经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,得到了纯化的肌红蛋白,并利用Ph.D-7噬菌体展示肽库试剂盒对肌红蛋白特异性亲和配体进行了筛选,最终得到其特异性亲和配体序列,从而使其试剂盒的研制与应用成为可能.[关键词]肌红蛋白;HR100;纯化;肽库筛选[中图分类号]Q513+.4[学科代码]180・1710[文献标识码] A 0引言肌红蛋白(myoglobin,MB)是肌组织所特有的一种单肽键蛋白质[1],主要生物学功能是结合氧并携带氧,是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质,在心肌中含量丰富.心肌蛋白是心肌细胞胞浆蛋白,相对分子质量为17800,它在早期心肌缺血的研究中早有报道[2-3].当心肌或骨骼肌有损伤时,肌红蛋白便释放入血液中,使血中肌红蛋白明显增高.如心肌梗死发病后4～12h内,血清中肌红蛋白可达高峰,48h恢复至正常水平[4].因此,肌红蛋白成为近年来测定急性心肌梗死(AMI)的一项重要生物学指标.本文对心肌蛋白的分离纯化及配体筛选进行了具体研究,为其试剂盒的研制与应用打下了基础,使其临床诊断成为可能.1材料与方法1.1材料,仪器材料:新鲜猪心(市售).仪器:组织捣碎机,高速离心机,超声波破碎仪,SL-2层析柜,紫外检测仪,记录仪,TH-1000梯[收稿日期]2005211221[基金项目]吉林省科技发展计划项目(20030450).[作者简介]马玉芹(1968-),女,博士研究生,副教授,主要从事环境生物学研究.第2期马玉芹,等:心肌检测标志物———肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究115度混合器,凝胶成像仪,电泳装置,超净工作台,干燥箱,高压灭菌锅,移液枪,分析天平,恒温培养箱等.低相对分子质量标准蛋白(购于上海生化试剂所),Ph.D-7噬菌体展示肽库试剂盒(购于BioLabs公司),SephacrylHR100柱料(购于鼎国试剂公司),DEAE-52柱料(购于鼎国试剂公司),其他试剂购自鼎国、北京益利试剂公司(均为分析纯).1.2方法1.2.1组织提取物的制备将新鲜猪心与一定量的pH为8.5的10mmol/LTris-HCl3min,然后将匀浆物于高速离心机(10000r/min)中离心,.1.2.2盐析沉淀上清液用1mol/L7.4,,10000r/min离心30min,4℃透析过夜.1.2.3SephacrylHR100柱,控制流动相的流速,收集相对分子质量为10000～20000的蛋白质.然后将此蛋白提取液用聚乙二醇(PEG)浓缩,并用pH值为8.5的10mmol/LTris-HCl缓冲液透析过夜.1.2.4DEAE-52柱层析将透析液上DEAE-52柱,然后采用线性梯度法进行洗脱,洗脱液为0～300mmol/LNaCl和pH值为8.5的10mmol/LTris-HCl缓冲液.分别收集不同峰值的蛋白组分.1.2.5SDS-PAGE电泳利用SDS-PAGE电泳对上述各步骤、不同峰值获得的样品分别进行鉴定,经与标准蛋白相对照确定肌红蛋白所在的峰,并对其进行收集,冷冻干燥后得纯品肌红蛋白.1.2.6Ph.D-7噬菌体展示肽库筛选筛选步骤按Ph.D-7噬菌体展示肽库试剂盒的说明进行.具体为:将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板共同温育,先洗去未结合噬菌体,然后洗脱特异性结合的噬菌体.对洗脱的噬菌体进行扩增,然后再进行下一轮结合/扩增循环,以富集可结合序列.经3轮淘选后,通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性.峰1为高相对分子质量杂质峰;峰2为含肌红蛋白的峰;峰3为低相对分子质量杂质峰.图1SephacrylHR100柱层析过程中样品吸光度变化情况2结果与讨论2.1结果2.1.1SephacrylHR100柱层析过程中洗脱液出峰情况在SephacrylHR100凝胶层析过程中,流出液随时间延长其出峰情况如图1所示.分别收集各峰样品进行电泳.电泳结果表明,肌红蛋白存在于第二个峰中.收集第二峰,走DEAE-52离子交换柱,并收集不同峰值的蛋白组分,电泳结果表明,经离子交换后获得了纯的肌红蛋白(见图2).2.1.2盐析、SephacrylHR100柱层析及DEAE-52柱层析粗提液用80%的硫酸铵盐析沉淀后,离心去上清,对沉淀进行透析,并取样进行电泳,结果见图2.2.1.3SDS-PAGE电泳将粗提的样品、经硫酸铵处理的样品、经SephacrylHR100柱层析的样品、经DEAE-52离子交换柱层析的样品进行电泳实验,结果见图2.116东北师大学报(自然科学版)第38卷从图2可知,粗提液中蛋白的种类较多(2泳道),蛋白之间不能很好分辨清楚;盐析样品中蛋白的种类有所减少(泳道3),电泳图谱较清楚;SephacrylHR100凝胶样品中蛋白只剩两种(泳道4,样品未浓缩);经DEAE-52离子交换柱层析后的样品只留下一条带,表明已经纯化得到一种蛋白,且相对分子质量约为17800.2.1.4Ph.D-7噬菌体展示肽库筛选利用Ph.D-7噬菌体展示肽库对心肌蛋白的特异性亲和配体进行了三轮筛选,前两轮为非特异性筛选,第三轮为特异性筛选,结果如下:(1)第一轮洗脱物滴度为6.5×3个/3.74×10-6;(2)5/L,收率为6.96×10-(3)第三轮洗脱物滴度为3.7×106个/μL,收率为2.03×10-3.对第三轮洗脱物挑斑测序,得其特异性亲和配体序列为:Arg-His-Pro-His-Leu-Val-Ser.2.2讨论肌红蛋白的相对分子质量约为17800,等电点为6.9.根据其两性蛋白质性质,本实验主要采取了盐析、凝胶层析与离子交换层析三种分离纯化方法.其中盐析法的采用非常必要,粗提液经80%硫酸铵沉淀后,绝大部分杂蛋白会变性,但肌红蛋白的活力没有受到影响.经过此步,部分杂蛋白被除去,样液体积也大大减少,便于后续操作.凝胶层析法主要是根据凝胶的分子筛效应,将相对分子质量大小1标准蛋白;2粗提液;3硫酸铵处理后样品;4SephacrylHR100柱层析后样品(未浓缩);5,6,7DEAE-52柱层析后样品.图2SephacrylHR100柱层析与DEAE-52柱层析电泳结果不同的蛋白质相分离,本实验采用的SephacrylHR100柱料理化性质稳定,且分离效率很高.实验结果表明,采用此柱料分离肌红蛋白效果较好.根据肌红蛋白表面的电荷效应,本实验采用DEAE-52离子交换柱料对其进行进一步纯化,离子交换后的电泳结果表明,利用DEAE-52纯化肌红蛋白是理想的,获得了肌红蛋白纯品.本文利用噬菌体展示肽库技术,以纯化的心肌蛋白为靶分子筛选其特异性亲和配体,三轮收率逐渐提高,第三轮洗脱物测序结果专一性较强,说明利用七肽库筛选结果较理想.3结论肌红蛋白是第一个被确定的具有三级结构的蛋白质,主要生物学功能是结合氧[5],是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质.正常人的血液中肌红蛋白含量很少,当心肌或骨骼肌有损伤时,肌红蛋白便释放入血液中,使血中肌红蛋白明显增高,故肌红蛋白是用于心肌损伤检测的标志物[6].其对急性心肌梗死的检测具有重要的诊断意义.本实验主要是通过SephacrylHR100凝胶层析和DEAE-52离子交换层析对匀浆、离心后的猪心进行分离纯化,每步纯化都经过SDS-PAGE分析,结果证明,经过一系列分离纯化步骤可以得到电泳纯的肌红蛋白.噬菌体展示是一种体外筛选技术.噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系,使得各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过一种被称为淘选(panning)的体外选择程序得以快速鉴定[7].本文以分离纯化的心肌蛋白为靶分子,利用噬菌体展示随机肽库进行了三轮筛选,最终获得专一性较强的亲和配体,这为心肌蛋白试剂盒的临床研制与应用提供了可能.第2期马玉芹,等:心肌检测标志物———肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究117 [参考文献][1]闵建雄.肌红蛋白及其法医学意义探讨[J].法学杂志,1998(5):89-94.[2]KENTSP.Diffusionofmyoglobininthediagnosisofearlymyocardialischemia[J].LabInvest, 1982,46(3):265-270.[3]NOMOTOKI,MORIN,SHOJIT,etal.Earlylossofmyocardialmyoglobindetectedimmunoh istochemicallyfollowingocclusionofthecoronaryarteryinrats[J].ExpMolPathol,1987,47(3):390-402.[4]贺兆发,刘云宝,陆春风.,1996,24:392.[5]孙京新,周光宏.12[6]郑佐娅.,3(3)[7] activesitesisolatedbyphagedisplayfromalibraryofrandomMol(2122.Thestudyonpurificationandaffinityligandofmyoglobin—anew makerfordetectionofAMIMAYu2qin1,ZHANGShu2hua2,FANLi2ying2,DONGLong3,QIANHai2gang2,QIUYu 2min2(1.CollegeofMaterialandChemicalEngineering,ChangchunUniversityofScienceandTech nology,Changchun130022,China;2.SchoolofLifeSciences,ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130 022,China;3.CollegeofEnvironmentandResources,JilinUniversity,Changchun130021,China) Abstract:Myoglobiniscomposedofahemeprostheticgroupandapolypeptidechain(globin)w hichhave152residues.Myoglobinexistsmainlyinmyocardium,cardiacmuscleandtheskeletalmuscle.Myoglobincanstoreandassigntheoxygentoalloverthecellandtissueofthecreature. Itisprovedrecentlythatmyo2globincanbeusedasagoodbiologicalmarkerfordetectionofacut emyocardialinfarction(AMI).Inthisthesis,obtainedmyoglobinfrombovineheartmuscleusi ngSephacrylHR100filtrationchromatographyandDEAE-Sephacelion-exchangechromatography.AfterSDS-PAGEgetthepureproduct.Myoglobinisasensitivemakerwhichcanbeusedindiagnosisofthes uddendeathfrommyocardialischemia.Thespecificsequenceofaffinityligandwasobtainedw iththePh.D-7phagedisplaypeptidelibrarykit.Theresultsmakeitpossibleforclinicaldevelopmentandappl icationofthekit.Keywords:myoglobin;HR100;purification;peptidelibraryselection(责任编辑:方林)。