第三章 cDNA文库和基因组文库
名词解释cdna文库
CDNA 文库
CDNA 文库是一种 cDNA(互补 DNA) 文库，它包含了生物体中所有基因的 mRNA 转录本的互补 DNA 序列。
在 CDNA 文库中，mRNA 被逆转录成 cDNA，然后被克隆到载体中，最终形成一个包含所有基因信息的文库。
CDNA 文库的构建过程通常包括以下步骤:
1. 从生物组织中提取 mRNA，并去除 rRNA 和 tRNA 等非编码RNA。
2. 将 mRNA 逆转录成 cDNA，使用逆转录酶将 mRNA 转录成cDNA，并在此过程中添加适配体，以产生特定长度的 cDNA 片段。
3. 将 cDNA 片段连接到载体上，通常使用质粒载体。
4. 将连接好的载体转化到大肠杆菌中，并筛选出阳性克隆。
5. 对阳性克隆进行测序和分析，以确定其序列信息。
CDNA 文库在基因组学研究中具有广泛的应用，例如:
1. 基因克隆：通过 CDNA 文库，可以克隆出感兴趣的基因，并对其进行进一步的研究。
2. 基因表达分析：通过比较不同组织或条件下的 CDNA 文库，可以分析基因的表达情况，了解基因在生物体内的功能和调控机制。
3. 基因组测序：通过 CDNA 文库，可以对生物体的基因组进行测序，以确定其基因组序列信息。
基因文库的构建
为了最大限度保证度的断裂。制备的
DNA分子规方法制备的染色体 DNA的长度一般在100 kb左右 如果先将细胞固定在低融点凝 构建流程
随机引物引导的 cDNA 合成是采用 6－10 个随机 碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的 起点。 由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合 位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特 长的 mRNA 分子的 5‘端序列。 随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建 cDNA 文 库，一般用于克隆特定 mRNA 的 5' 末端，如 RTPCR 和物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA
种类不同（即基因
① 细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； ② 第一链 cDNA 合成； ③ 第二链 cDNA 合成； ④ 双链 cDNA 克隆
Total RNA的提取 mRNA的分离 cDNA双链的合成 载体的制备 cDNA双链和载体的连接 转化或转染 快速鉴定 pBlueScript cDNA库扩增
5’
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ T4-DNA ligase AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’
5’ 3’
cDNA第二链的合成
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’5 G
AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ TdT dCTP AAAAACCCCCCCOH 3’ TTTTTp 5’ NaOH TTTTTp 5’
A A A A
白酶K、RNaseA的缓冲液中浸泡，可获得 >100 kb大小的DNA片段基因的构建程序③基因组DNA的切割
cDNA文库和基因组文库比较
个人收集整理-ZQ文库和基因组文库比较文库:以为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成，与适当地载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部信息地克隆集合称为该组织细胞地文库.基因组文库: 一个生物体地基因组用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体分子中，所有这些插入了基因组片段地载体分子地集合体，将包含这个生物体地整个基因组，也就是构成了这个生物体地基因文库. b5E2R。
基因组文库与文库地比较:基因组文库地优点相对于文库,基因组文库地优点: 克隆只能反映着地分子结构,没有包括基因组地间隔序列, 文库中,不同克隆地分布状态总是反映着地分布状态,即:高丰度地克隆,所占比例较高,分离基因容易;低丰度地克隆,所占比例较低,分离基因困难; 从克隆中,不能克隆到基因组中地非转录区段序列,不能用于研究基因编码区外侧调控序列地结构与功能. p1Ean。
文库地主要优点：①文库以为材料,特别适用于某些病毒等地基因组结构研究及有关基因地克隆分离.②文库地筛选比较简单易行.③每一个文库都含有一种序列,这样在目地基因地选择中出现假阳性地概率就会比较低,因此阳性杂交信号一般都是有意义地,由此选择出来地阳性克隆将会含有目地基因.DXDiT。
④文库可用于在细菌中能进行表达地基因地克隆,直接应用于基因工程操作.⑤克隆还可用于真核细胞地结构和功能研究.克隆地主要地缺点：文库所包含地遗传信息要远远少于基因组文库,并且受细胞来源或发育时期地影响. 文库虽能反映地分子结构和功能信息,但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列地结构与功能方面信息. 在文库中,相应于高丰度地克隆所占地比例比较高,分离起来比较容易,而相应于低丰度地克隆所占地比例则比较低,因此分离也就比较困难.RTCrp。
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第三章基因工程目的基因的获取分离
用氢氧化钠消化杂合双链 中的 mRNA 链
解离的第一链 cDNA 的 3‘末端就会形成一个发夹环 （发夹环的产生是第一链 cDNA 合成时的特性，原因 至今未知，据推测可能是 由帽子的特殊结构相关）
引导 DNA 聚合酶复制出第 二链，此时形成的双链之 间是连接在一起的
再利用 S1 核酸酶将连接处 （仅该位点处为单链结构） 切断形成平通过几种限制性内切酶切
割，所产生的基因组DNA片段与载体重组并克 隆，由此产N=ln（1DNA片段的出现概率。 f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。
第一：细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；
mRNA
总RNA
tRNA 第二：第一链 cDNA 合成；
rRNA 第三：第二链 cDNA 合成；
2 合成cDNA第一条链 第四：双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
（1）随机引物引导法
并导入宿主中繁殖。
（2）oligo（dT）引导法
（1）随机引物引导法 5´
链 cDNA 为模板合成一段段互补的序列。同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 3'--5'
cDNA 片段。这些 cDNA 片段进而核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链 cDNA 的
在 DNA 连接酶的作用下连接成一 3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。这
条链，即 cDNA 的第二链
种方法合成的 cDNA 在 5'-端存在几个核苷酸缺失， 但一般不影响编码区的完整。
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如何找回两膜或硝酸 纤维素滤膜之后，就可以同特异性
的核酸探针进行菌落或噬菌班杂交，
A 应用核酸探针分离克隆的目的基因 以便筛选出具有目的基因的阳性克 隆。这个过程叫做克隆基因的分离
第3章第1节第2课时基因工程的基本操作程序课件--苏教版2019 高中生物选择性必修3
(2)从RNA方面检测受体细胞 ①方法：分子杂交技术。 ②操作：从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子，用已标记 的目的基因片段 作为探针与mRNA杂交，观察是否出现杂交带。
(3)从蛋白质方面进行检测 ①方法：抗原—抗体杂交 。 ②操作：从待测转基因生物中提取蛋白质，再用相应的抗体进 行抗原—抗体杂交，观察是否出现 杂交带。 (4)从个体水平进行鉴定：检测转基因生物是否表现出目的基因 控制的性状。
③过程 将目的基因插到农杆菌Ti质粒的 TDNA 特定区段上→转入 农杆菌→侵染植物细胞→整合到受体细胞染色体的 DNA 上→目的 基因稳定的遗传和表达
(2)将目的基因导入动物细胞 ①主要方法：显微注射法。 ②操作对象： 受精卵。 ③其他方法：也可用 病毒DNA 与目的基因一起构建的载体， 去感染受体动物细胞。
限制酶 BamHⅠ
HindⅢ
EcoRⅠ
Sma Ⅰ
识别序
列及切
割位点
图2 图1
①构建基因表达载体时，能否用Sma Ⅰ酶切割质粒？为什么？
提示：不能；因为Sma Ⅰ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗 性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进 一步筛选。
②与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶 同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
NO.1 必备知识·聚焦概念
一、基因工程的基本操作程序 1．目的基因的获取 (1)通过化学合成法直接人工合成目的基因 ①对于比较小的目的基因，在明确脱氧核苷酸序列后，可以通 过DNA合成仪直接人工合成。 ②全基因或较大基因，使用半合成 的生物体 全部基因片段 的重组DNA 的克隆群体。 特点：受体菌群中的不同个体含有该种生物的不同基因拷贝， 整个菌群所含有的基因拷贝便可能涵盖了该生物的所有基因 。 筛选方法：一般采用核酸探针杂交 的方法。
基因组文库
寡聚核苷酸探针
抗体探针
克隆的鉴定
克隆的鉴定是指重组DNA分子的各种特 性，如大小、限制性图谱、基因的方向 以及核苷酸序列等，具体步骤包括：
已经克隆化的DNA样品的纯化 制作限制性图谱 DNA与RNA杂交
限制性图谱
片段大小
对于质粒或噬菌体克隆中插入的基因组DNA 片段或cDNA片段的大小，可以用将插入片段 与载体DNA分开的限制性内切酶来酶解，如 用ECOR1位点构建的cDNA克隆，最好还用 ECOR1来酶解，可以回收插入片段和载体，再 通过琼脂糖电泳就可以知道插入片段以及载 体分子的大小了
载体
质粒载体—用于基因组较小的生物，如 大肠杆菌，用质粒载体来构建基因组文 库，只需5000个克隆就可以达到高于kb 黏粒—45kb 细菌人工染色体（BAC）—350kb 酵母人工染色体(Y 3,000,000 200,000 6A的合成 cDNA末端的处理 与载体的连接
mRNA分离、纯化与分离
通常用于构建cDNA的是真核细胞的mRNA 由于cDNA从mRNA合成而来，代表了基因 组的可转录部分，不含内含子序列，因此 可被用于在大肠杆菌中表达编码蛋白
插入片段的方向以及多插入片段时的排 列顺序
采用多种限制性酶来单切或组合切割
可以得到不同的特异性酶解片段 再分别进行组合（拼接） 得到插入序列的信息
DNA与RNA的杂交
检测能与特定探针杂交的DNA（southern） 或RNA（northern）
DNA Hybridization (Southern)
变性
退火
聚合
N＝ln(1-p)/ln(1-f)
P—给定的概率，f—插入片段大小占总基因组大小的 比例 如果给定概率为0.99，插入片段为20kb的情况下， 对人类基因组（3Χ109bp）来说，所需重组体的 数目为6.9 Χ 105；而对于大肠杆菌而言，仅需要 1100个重组体
基因文库的构建
4. 筛选目的基因
原核细胞不可用来作为基因的表达系统 （无转录后加工）。 原核细胞基因库——只能用核酸探针杂 交筛选目反转录酶的作 用下将点： 1. cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操 作更为方便。 2. mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特 定功能基因工作量较小。 3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。（转录特征） 4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白 5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA不同 6. 不能研究基因组的结构功能
溶菌、使DNA 暴露 洗菌体碎片和 Pr 使单链DNA牢 固结合在膜上
• ⑵ 免疫结合法 • 噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA 表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢 固地结合在膜上。然后将膜放入含有特 异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗 去未结合的抗体后，再与125 I 标记的第 二抗体结合, 从而找出带有放射性示踪信 号的斑点, 进而找出对应噬菌斑, 克隆扩 增, 提取DNA后经酶切可获目的基因。
940 3000 30000
1440分离纯化基因组DNA, 提取哺乳动物细胞染色体DNA ⑵制备全部基因组的DNA片断 ①机械断裂 法 用超声波或高速搅拌DNA溶液 断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端, 因此插入 载体之前还需要进行修饰加工，少用 ②限制性内切酶降解（鸟枪法） 过去用EcoRⅠ,现在用Sau3A 断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与 处理过的载体连接。
• ⑶ DNA片断与载体的连接包装 • 常用载体：粘性质粒 λ噬菌体 • 酵母人工染色体 • ①基因组DNA +粘性质粒——重组DNA—— 转化细菌 菌落 • ②基因组DNA + λ噬菌体 ——重组DNA—包 装成噬菌体——感染细菌 噬菌斑 • 1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆 群体就包含基因组的全部基因组的大 小 （bp） 被克隆的=0.95
基因库、基因文库、部分基因文库的区别
1、基因库、基因文库（或基因组文库）、部分基因文库（如cDNA文库）的区别（1）基因库：一个种群中全部个体所含有的全部基因，叫做这个种群的基因库。
（2）基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
（3）部分基因文库：只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。
如：cDNA文库。
2、自交与自由交配的区别（1）自交强调的是相同基因型个体的交配，如基因型为AA、Aa群体中自交是指：AA x AA、Aa x Aa。
（2）自由交配强调的是群体中所有个体进行随机交配，如果基因型为：AA、Aa群体中自由交配是指：A A♀x Aa♂、AA x AA 、Aa x Aa 、A A♂x Aa♀（3）如果自由交配（随机交配），计算后代基因型频率，要先算出基因频率，然后按遗传平衡定律进行计算。
（A + a）2展开再进行；如果算后代显性个体杂合子的概率，要Aa/AA+Aa 来计算。
（4）基因位于性染色体上的基因频率的计算：在X染色体上的，Y没有，算基因频率时，不用算Y的；X B、X b基因频率在男女上的基因频率是一样的。
性染色体上基因频率问题性染色体基因在群体中的状况要比常染色体基因复杂。
以XY型性别决定方式为例：雌性个体有两条X染色体，一条来自父方，另一条来自母方，因而携带有两份X染色体上的基因；而雄性个体只有一条来自母方的X染色体，因而只携带一份X连锁基因。
因此，X染色体上的基因在群体中的分布就处于不平衡状态。
雌性个体的性连锁基因占群体的三分之二；而雄性个体只会有剩余的三分之一。
由于高中阶段一般只考虑X染色体上的基因，不考虑Y染色体的基因，因此，求性染色体上一对等位基因频率实际上是求X染色体上一对等位基因的基因频率。
【例】从某个种群中随机抽出100个个体，测知基因型为X B X B、X B X b、X b X b和X B Y、X b Y的个体分别是44、5、1和43、7。
(整理)第三章基因与基因组
第三章基因与基因组第一节基因概念的历史演变第二节DNA与基因第三节真核生物的割裂基因第四节基因大小第五节重叠基因第六节真核生物的基因组第七节真核生物DNA序列组织第八节细胞器基因组第九节基因鉴定第十节人类基因组计划第三章基因与基因组1 基因（gene）的概念基因是遗传的功能单位，DNA分子中不同排列顺序的DNA片段构成特定的功能单位；含有合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核苷酸序列。
广义地说，基因是有功能的DNA片段。
第一节基因概念的历史演变2 基因概念的历史演变：（1）Mendel提出基因的存在（2）Morgan证实基因在染色体上（3）“一个基因一个酶”修正为“一个基因一个多肽链”“基因”一词的创立: 1909年，丹麦遗传学家约翰逊“基因”（gene）。
Gregor MendelThomas Hunt Morgan3 基因概念的理论基础3.1 一个基因一个酶1941年G W Beadle 和E L Tatum研究证实红色链孢霉各种突变体的异常代谢是一种酶的缺陷，产生这种酶缺陷的原因是单个基因的突变。
3.2 一个基因一条多肽链本世纪50年代，Yanofsky有些蛋白质不只由一种肽链组成，如血红蛋白和胰岛素，不同肽链由不同基因编码，因而又提出了“一个基因一条多肽链”的假设。
3.3 基因的化学本质是DNA(有时是RNA)1944年，O T Avery 证实了DNA是遗传物质。
有些病毒只含有RNA。
1953年沃森和克里克建立DNA分子的双螺旋结构模型。
3.4 基因顺反子（Cistron）的概念1955年，美国本兹尔(Benzer)提出顺反子的概念：是指编码一个蛋白质的全部组成所需信息的最短片段，即一个基因。
基因仅是一个功能单位，基因内部的碱基对才是重组单位和突变单位。
一对同源染色体上两突变（a和b）在同一染色体上时，称为顺式构型，在两个染色体上时，为反式构型；顺反互补测验（cis-trans test）：比较顺式和反式构型个体的表型来判断两个突变是否发生在一个基因（顺反子）内的测验。
基因组文库和cDNA文库的比较
假阳性概率低。
简易。其克隆
概率高。
真核生物NA病毒的基 因组结构和基因克 隆分离。03 基因组优点基因组含有 全部基因，
cDNA只含有 全部蛋白质编码 的结构基因且受
02 构建双 链DNA合 成 方 法
大肠杆菌 RNaseH酶 降解取代法
Oligo寡聚 引物引导法
PCseH
酶 降 解 取 代 法02 构建Oligo寡 聚 引的分离
包括mRNA、tRNA、rRNA
cDNA第一条链的合成
oligo引导合成法、随机引物引导合成法
双链cDNA的合成
四种常用方法
cDNA与载体的连接和噬菌体颗粒第 一 链
公式:N=ln（1-P）/ln（1-f）, 实际克隆段化
物理学方法：机械类或超声波等 生物化学方原核生物基因组较小，一般采用质粒载体 或λ载体。
重组CONTENTS01 基因组 02 cDNA 03 两者比较
01基因组概念 构建（原核） 构建（真核）0载体贮存 在一个受体菌的群体中反映 mRNA信息，但 不能直接获得基 因的内含子序列 和基因编码区外 A的
cDNA克隆,所占 比例较高,分离基
因容易;低丰度 mRNA的cDNA克 隆,所占比例较低,
分离基因困难;
感谢聆听！
THANK YOU!
cDNA文库和基因组文库比较
cDNA文库和基因组文库比较cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
基因组文库：一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库.基因组DNA文库与cDNA文库的比较：1 基因组DNA文库的优点相对于cDNA文库,基因组文库的优点: cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列，cDNA文库中,不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低,分离基因困难; 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段序列,不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能.2 cDNA文库的主要优点:①cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离.②cDNA文库的筛选比较简单易行。
③每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低,因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。
④cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。
⑤cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。
3 cDNA克隆的主要的缺点：cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库,并且受细胞来源或发育时期的影响. cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。
基因组文库与cdna二课的区别
基因组文库与cdna二课的区别基因组文库与cDNA文库是两种常用的DNA文库构建方法，在基因组学和转录组学研究中扮演着重要的角色。
本文将从构建方法、应用领域和优缺点三个方面对两者进行比较。
一、构建方法1. 基因组文库构建方法：基因组文库是由整个基因组DNA片段组成的文库。
构建基因组文库的关键步骤包括DNA提取、DNA片段切割、连接到载体、转化到宿主细胞等。
其中，DNA片段切割通常使用限制性内切酶，将基因组DNA切割成特定大小的片段，然后将片段连接到载体上，最后转化到宿主细胞中。
2. cDNA文库构建方法：cDNA文库是由转录本（mRNA）反转录合成的互补DNA（cDNA）片段组成的文库。
构建cDNA文库的关键步骤包括RNA提取、反转录、合成第一链、合成第二链、连接到载体、转化到宿主细胞等。
其中，反转录是将mRNA作为模板，使用逆转录酶合成cDNA的过程，合成的cDNA片段具有转录本的特异性。
二、应用领域1. 基因组文库的应用领域：基因组文库广泛应用于基因组测序、基因定位、基因组结构和功能研究等。
通过对基因组文库进行测序，可以获取到整个基因组的序列信息，进而进行基因组注释、基因定位、重测序等研究。
此外，基因组文库还可用于构建比较基因组文库，用于不同物种之间的基因演化和功能保守性研究。
2. cDNA文库的应用领域：cDNA文库主要应用于转录组学研究，可以用于测定不同组织、不同生长阶段或不同环境条件下基因的表达情况。
通过对cDNA文库进行测序，可以获取到转录组的信息，进而进行基因表达差异分析、功能注释、代谢途径分析等研究。
此外，cDNA文库还可用于筛选和克隆特定基因。
三、优缺点比较1. 基因组文库的优缺点：优点：基因组文库包含了整个基因组的信息，可以全面了解基因组的结构和功能；适用于基因组水平的研究，如基因组测序和基因定位等。
缺点：基因组文库的构建比较复杂，需要大量的DNA样品；基因组文库中包含大量的非编码区域，测序成本相对较高。
基因组文库、cDNA文库的构建和筛选
物理剪切—利用振荡、超声等物理方法剪 切可以非常随机地进一步将长片段切割成 小片段，片段末端通常都是平末端
限制性酶解—位点非随机分布。常用的酶 是Sau3A，该酶产生的酶切黏性末端与 BamHI酶解载体产生的末端相同
基因组DNA片段的限制性内切酶酶解
• 使用限制性内切酶酶解基因组DNA可产生非 随机片段，为了获得15－25kb的或更大的基 因组DNA片段（适用于λ噬菌体或黏粒载体 的片段），需要进行部分酶解，即通过合理 使用限制性内切酶（种类和用量），调节酶 切片段的大小
• 也可用反转录酶或Klenow酶延伸引物来合 成第二链。
•
cDNA末端的处理
• 由于大片段的平末端连接效率非常低，因 此为了避免用平末端体（EMBL3等）
• EMBL3 ：载体大小为 43kb ，其左臂、右臂和 填充片段的大小分别为 20kb、 9kb 和 14kb 。 从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段
的大小为 9-23kb 。在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段后，重组 体将变成 red-gam- ，同时载体上含有 chiC 位
mRNA的提取
• 全长mRNA具有 一个polyA的3’ 末端，可以被用 于mRNA的分离；
• 可以用寡聚纤维 素柱，选择性地 吸附mRNA
• 纯化
• 用结合有寡聚（dT ）的磁珠加到细胞裂解 液，在用强磁铁吸出磁珠并洗出mRNA。
检测mRNA
• 翻译，检测翻译产物： 用无细胞翻译系统（如麦胚抽提液 或兔网织红细胞裂解液）来检测 mRNA的完整性，也可用凝胶电泳 直接检测，用杂交法分离 mRNA。
示差筛)
• 扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cD)得以实现的。
cDNA文库和基因组文库比较
cDNA文库和基因组文库比较cDNA文库:以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
基因组文库: 一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。
基因组DNA文库与cDNA文库的比较:1 基因组DNA文库的优点相对于cDNA文库,基因组文库的优点: cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构,没有包括基因组的间隔序列, cDNA文库中,不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态,即:高丰度mRNA的cDNA克隆,所占比例较高,分离基因容易;低丰度mRNA的cDNA克隆,所占比例较低,分离基因困难; 从cDNA克隆中,不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段序列,不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能.2 cDNA文库的主要优点：①cDNA文库以mRNA为材料,特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离.②cDNA文库的筛选比较简单易行.③每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列,这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低,因此阳性杂交信号一般都是有意义的,由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因.④cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆,直接应用于基因工程操作.⑤cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究.3 cDNA克隆的主要的缺点：cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库,并且受细胞来源或发育时期的影响. cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息,但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息. 在cDNA文库中,相应于高丰度mRNA 的cDNA克隆所占的比例比较高,分离起来比较容易,而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低,因此分离也就比较困难. 3、通过活动，使学生养成博览群书的好习惯。
第三章基因文库的构建
频率和6Kb
★
G
Chemically synthesized
oligonucleotide
★
Anneal
TCAGGCT
T
★
Wild-type
(1) (1) DNA polymerase + 4 dNTPs
(2) T4 DNA ligase + ATP
正链DNA的合成
按照体外
DNA重组技术,将待突变的DNA片
G
段插入到M13噬菌体上. 然后制备
平末端 连接
加接头造成 粘性末端
细菌转化
重组噬菌体 DNA转染
重组质粒 的转化
体外包装 进行转导
重组体 的鉴定
表型鉴定
核酸杂交
免疫学分析
酶切A，把 所得到的大量基因组DNA片段与载体连接， 然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。 是某个生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体。
SI核酸酶处理 Klenow 酶， 连接酶处理
16
一、缺失诱变 2、通过酶切图谱完成中间缺失
17
第三节：克隆DNA序列的体外诱变
二、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序
列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的 相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征
由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按 设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在 异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。
(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe; (2) Isolate mutant
cDNA和基因组文库DNA的构建
2：cDNA第二链的合成
• 2 . 1：cDNA第二链的合成将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中、
• 10mMol/L mgcl2 70ul • 2mM/L Tris-Hcl(PH7.4) 5ul
结构 环状
线状 环状
E.coli E.coli E.coli 酵母细胞
环状 环状 环状 线性染色体
哺乳动物细胞 动物细胞
环状 环状
动物细胞和细 菌
环状
插入片段 很小， <8kb 9-24kb <10kb
35-45kb 约300kb 100-800kb
1002000kb >1000kb
举例 pUC18/19 ,T-载体,
• 2 . 8.用下面公式计算第二链反应中所合成的cDNA量。要考虑到 已掺入到DNA第一链种的dNTP的量。 [第二链反应中所掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)]*(66μg xμg)=cDNA第二链合成量/μg x表示cDNA第一链量。CDNA第二链合成量通常为第一链量的 70~80% 2 . 9.用等量酚：氯仿对含有磷酸化cDNA（来自步骤6）的反应物 进行抽提。
5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法 分离cDNA
•
Sepharose CL-4B柱的制备 5 . 1.用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1ml灭菌吸管端部，用 无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并弃去，再用滤过的压缩空气将余下的 棉拭子吹至吸管狭窄端。 5 . 2.将一段无菌的聚氯乙烯软管与吸管窄端相连，将吸管宽端浸于含有 0.1 mol/L NaCl的TE（pH7.6）溶液中。将聚氯乙烯管与相连于真空装置 的锥瓶相接。轻缓抽吸，直至吸管内充满缓冲液，用止血钳关含有某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体。
基因组文库和cDNA文库的比较(方案).ppt
01基因组概念 构建（原核） 构建（真核）0载体贮存 在一个受体菌的群体中（1-f）, 实际克隆合 成 方 法
大肠杆菌 RNaseH酶 降解取代法
Oligo寡聚 引物引导法
PCseH
酶 降 解 取 代 法02 构建Oligo寡 聚 引比较cDNA优点 基因组优点谢谢 精选文档尽在此间
材料影响cDNA能反映 mRNA信息，但 不能直接获得基 因的内含子序列 和基因编码区外 A的
cDNA克隆,所占 比例较高,分离基
因容易;低丰度 mRNA的cDNA克 隆,所占比例较低,
分离基因困难;
感谢聆听！
THANK Y于筛选困难、重组效率低、文 库不易贮存，Cosmid使用不如λ 噬菌体载体普母人工染色库：以mRNA为模板， 经反转录酶催化，在体外反转录 成cDNA，与适当的载体连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一 段cDNA，并能繁殖扩增，这样 包含着细胞全部mRNA信息的 c制备基因组DNA并片段化
物理学方法：机械类或超声波等 生物化学方原核生物基因组较小，一般采用质粒载体 或λ载体。
重组核采用 质粒载体或λ载体）。下、筛选
假阳性概率低。
简易。其克隆
概率高。
真核生物NA病毒的基 因组结构和基因克 隆分离。03 基因组优点基因组含有 全部基因，
cDNA只含有 全部蛋白质编码 的结构基因且受
公式:N=ln的分离
包括mRNA、tRNA、rRNA
cDNA第一条链的合成
oligo引导合成法、随机引物引导合成法
双链cDNA的合成
四种常用方法
cDNA与载体的连接和噬菌体颗粒第 一 链
基因组文库和cDNA文库的比较
基因组文库和cDNA文库的比较首先，让我们了解一下基因组文库和cDNA文库的定义和构建方法。
1.基因组文库：基因组文库是整个基因组的DNA序列的集合，包含了一个生物体的全部遗传信息。
构建基因组文库的过程中，需要将整个基因组的DNA分解成小片段，并将其插入一个合适的DNA载体（如噬菌体、质粒或染色体）。
随后，DNA片段和载体将被放入宿主细胞（如大肠杆菌），产生许多基因组文库的克隆。
这些克隆可用于后续的DNA测序、定位和功能研究等。
-包含了一个生物体的全基因组DNA序列，不仅包括编码蛋白质的外显子，也包含调控序列、非编码RNA等。
-克隆数目较大，能覆盖整个基因组的序列。
-信息量大，能提供全面的基因组遗传信息。
-由于涵盖了大量非编码序列，分析起来比较复杂。
2.cDNA文库：cDNA文库是由转录mRNA后得到的互补DNA（cDNA）构建而成的。
转录是由DNA模板合成RNA的过程，其中mRNA是转录出的可翻译成蛋白质的分子。
cDNA文库的构建过程中，需要在转录过程中加入反转录酶，用于合成cDNA。
此后，cDNA片段会被插入到DNA载体中，并转化到宿主细胞中。
cDNA文库可用于研究特定时期或类型细胞的基因表达情况，并逆推分析源自该时期或类型细胞的mRNA信息。
同样，cDNA文库可用于DNA 测序、蛋白质表达等研究。
cDNA文库的主要特点：-反映了特定时期或类型细胞的基因表达情况。
-由于只含有编码蛋白质的序列，分析起来相对简单。
-cDNA文库总体克隆数较少，故无法覆盖全基因组的信息。
-最初的RNA模板需经过反转录，过程中可能有一定的误差和损失。
接下来我们对比基因组文库和cDNA文库的优缺点和应用：1.优点：-信息量大，提供更全面的基因组遗传信息。
-适用于定位基因和研究调控序列、非编码RNA等。
cDNA文库：-分析相对简单，只包含编码蛋白质的序列。
-反映特定细胞或时期的基因表达情况。
2.缺点：-复杂性高，涵盖了大量的非编码序列。
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片段
• 缺点： 酶切可能切断cDNA
对策：
利用切点稀少的限制酶
甲基化
• 接头（adapter）
是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，
另一头为平末端的特殊的寡核苷酸片段。
• 可能问题：
接头自身连接
• 解决方法：
接头分子一端磷酸化
具异常的5’-OH粘性末端结构的Bam稀少的限制酶
②dG：dC段可能影响转录和测序
back
同聚物加尾法克隆双链cDNA
通过依次加入、连接 合成的DNA衔接物 进行cDNA克隆
用衔接物分子连接平末端的DNA片段
• 衔接物（linker）
指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成，具
有一个或数个限制酶识别为点的5% 15000种
• 步骤： ①新鲜材料 ②提取RNA（mRNA） ③第一条cDNA链的合成
反转录酶④第二条cFra bibliotekNA链的合成⑤双链cDNA同载体的连接
置换合成/引物-衔接头法
λgt10/ λgt11
利用oligo（dT）引物和反转录酶合成cDNA第一链
自身引导法合成双链cDNA
双链cDNA的置换合成
引物-衔接头法合成双链cDNA
• 双链cDNA的置换合成缺点：
缺少对应于mRNA5’端的几个核苷酸
• 引物-衔接头法优点： ①利于获得全长cDNA ②利于和载体连接 缺点： ①酶切可能切断cDNA
• 部分酶解片段越大，所需重组体数目越少 • 载体：λ噬菌体 细抑制自身连接 ②基因组DNA不互补，稍短的片段极不可能连接成 带有原基因组上非相邻DNA区段的结构