实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量
考马斯亮蓝G浓度测定蛋白
实验三、考马斯亮蓝G-250比色法测定蛋白质含量一. 目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法二. 原理考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。
考马斯亮蓝G-250是一种蛋白染料，其结构如下图。
它在游离状态下最大吸收波长为464nm 。
其中： R= H 时，为R-250 （R 指红蓝色）R=CH 3时，为G-250 （G 指蓝绿色）由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合。
当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波长变为595nm 。
这种结合在2分钟左右达到平衡，生成的复合物在1小时内保持稳定。
在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在595nm 处的光吸收与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质含量的测定。
该方法非常灵敏，蛋白质最低检测量为5，而且此法操作简便、快速，干扰物质少，是实验室常用的蛋白质定量方法。
但染料易吸附在比色杯上（注意，不可用石英比色杯）而造成误差，操作时应及时用酒精清洗。
NHSO 3-C H 25SO 3-C H 25C H 25CH 2CH 2CO RR N +N三. 实验材料及设备1. 材料三鹿纯牛奶2. 仪器分光光度计电子天平3. 器材普通试管： 20mL×１０容量瓶： 100mL×1 ５00mL×1移液管： 1mL×4 5mL×1烧杯： 250mL×1 50mL×1滴管： 2洗耳球： 2坐标纸研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制1. 牛血清白蛋白标准液（100）精确称取0.0100g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。
2. 考马斯亮蓝G-250染色液取0.10g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%的乙醇中，加入100mL 85%的正磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL。
过滤待用。
考马斯亮蓝G-250染色法
结果处理： 1、绘制标准曲线 2、求样品蛋白质浓度
优点： 试剂配制简单、操作简便快捷、灵敏度 高、重复性好、显色迅速、干扰物质较少。 测定范围1-100µg。
【实验仪器及试剂】 实验仪器及试剂】 实验仪器及试剂 1、仪器： 722分光光度计、天平、试管、 移液管、离心机
2、试剂： （1）标准牛血清蛋白质溶液： 100 µg/mL牛血清蛋白。 （2）考马斯亮蓝G-250溶液： 称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90% 90%的乙醇中，加入100mL 85%（W/V）的磷酸， 100mL 85% W/V 再用蒸馏水定容至1L，贮于棕色瓶中。常温下可 保存一个月。 （3）生理盐水： 称取0.9g NaCl 加蒸馏水至100ml。
【实验步骤 实验步骤】
1．组织样品的制备： 准确称取新鲜样品0.5g，用5mL生理盐水在冰 浴中研成匀浆。在3500rpm离心10min，取上清 液待测。 2. 血清样品的稀释 取血清 µl，加生理盐水至
表1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质溶液配制表 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白质溶液 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.05 （100 µg/mL） 生理盐水（mL） 1.0 0.2 0.8 0.7 0.6 0.5 0.95 G-250试剂（mL） 3 3 3 3 3 3 3 蛋白质含量（µg）0 20 40 60 80 100 吸光度值
特点：
1、染料与蛋白质的结合，大约只需2分钟，结合物的 颜色在1小时内是稳定的。 2、一定范围内,溶液在595nm波长下的吸光度与蛋白 质含量成正比，可用比色法测定。 3、一些阳离子，如K+、Na+、Mg 2+、（NH4）2SO4， 乙醇等物质不干扰测定，但去污剂如Tritonx-100、 SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当 的对照消除。
考马斯亮蓝g-250法测定蛋白质含量的原理
考马斯亮蓝g-250法测定蛋白质含量的原理
马斯亮蓝g-250法测定蛋白质含量是互联网中一种应用广泛的方法，它是一种
特殊的分光光度法，通过紫外可见分光光度法来测定某个蛋白质 HbA1c（糖化血红蛋白）含量。
它能够准确、快速、简便地检测出特定蛋白质的含量，在不同的生物样品中具有显著的抗污染特性，可有效避免干扰因素的影响，从而获得高精度的检测结果。
在马斯亮蓝g-250法测定蛋白质含量的过程中，会使用紫外分光光度法来测定
糖化血红蛋白的含量。
这是因为糖化血红蛋白本身对紫外光有一定的吸收的特性。
当紫外光照射到样本中包含的糖化血红蛋白上时，会使其被分解成不同的肽。
这些肽段会有一定的反应，当在特定波长下照到波长光源上时，就可以由紫外可见分光光度仪测量出糖化血红蛋白含量。
通过比较波长光源的测定值以及未受照射样品的测定值，就可以计算出糖化血红蛋白含量，从而得出蛋白质含量的结果。
马斯亮蓝g-250法测定蛋白质含量具有准确性高、快速、经济、有效性强等特点，已被广泛应用在生命科学研究和临床检测中。
而且，其准确性和敏感度可满足多种档次需求，因此可以用于科学研究和临床医疗诊断等不同领域。
总之，马斯亮蓝g-250法测定蛋白质含量是一种应用广泛的方法，它的准确性、快速、简便、有效性强等特点，使其在生物、临床诊断等多个领域有重要的应用，也是互联网上比较流行的一种蛋白质测量方法。
考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量
实验7 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。
在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。
涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。
2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。
在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。
该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。
高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英杯测定。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg（20mg）溶于50ml （20ml）95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。
该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。
2、标准蛋白溶液：称取25mg牛血清白蛋白，加蒸馏水溶解并定容至100ml，将此溶液稀释2.5倍，即为100μg/mL标准液。
4摄氏度保存备用。
3提取液：50mmol/L磷酸盐缓冲液（KPP）pH7.8：称取7.6gK2HPO4和0.89gKH2PO4蒸馏水溶解，定容至1L，调pH至7.8。
50mmol/LKPP（pH7.8）内含1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）四、操作步骤（一）标准曲线的制作3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。
(注意应在一小时内完成比色)4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定1、样品的提取：称取植物材料0.2g左右于预冷的研钵中，加入2mL预冷的提取液，研成匀浆，转至10mL离心管中，用提取液冲洗研钵2次（每次1mL），转至离心管中，总体系4mL，此即为蛋白质提取液。
实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量
实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量实验目的本实验的目的是通过考马斯亮蓝G250法测定蛋白质的含量，并了解该方法的基本原理。
实验原理蛋白质含量的测定方法有很多，其中比较常用的是考马斯亮蓝G250法。
该方法的基本原理是：靶蛋白质与染料考马斯亮蓝G250反应生成蓝色沉淀，通过比色法测定沉淀的吸光度，即可计算出蛋白质的含量。
具体来说，该方法的操作步骤如下：1.将待测蛋白质样品制备成一定的浓度，并加入一定体积的考马斯亮蓝G250试剂。
2.在一定时间内使反应到达平衡，将反应液离心沉淀。
3.由于考马斯亮蓝G250和蛋白质的结合比较强，一般可以近似认为反应液中大多数考马斯亮蓝G250都与蛋白质结合在一起。
因此，剩余的考马斯亮蓝G250浓度可以通过测定上清液的吸光度得到。
4.根据标准曲线（一般为已知浓度的蛋白质样品的吸光度与浓度的对应关系），可以将上清液的吸光度转化为蛋白质的含量。
实验步骤实验前准备准备工具和试剂，包括：•96孔微孔板•分光光度计•移液器、吸头•加样器•蒸馏水•NaOH溶液（1mol/L）•BSA标准品（2mg/mL）实验操作1.准备5个稀释比例的BSA标准品，分别为0.1、0.2、0.5、1.0和2.0mg/mL。
2.将标准品和待测样品分别加入96孔板中，每个样品重复3次。
3.加入一定体积（如200μL）的考马斯亮蓝G250试剂，混匀。
4.在室温下暗置约5min，使反应充分发生。
5.离心沉淀至液面完全透明。
6.将上清液吸取到另一个96孔板中。
7.加入100μL NaOH溶液，混匀。
8.制备一条标准曲线，测量各标准品和待测样品的吸光度。
数据处理根据标准曲线计算待测样品中蛋白质的含量。
实验注意事项•操作时要注意洁净卫生，避免交叉污染。
•要精确控制试剂的使用量，避免误差。
•每项操作要根据标准程序认真进行，做到数据准确可靠。
实验结果分析通过考马斯亮蓝G250法测定了不同浓度的BSA标准品和待测样品中的蛋白质含量，得到了标准曲线和待测样品的吸光度值。
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量呵呵你的自己检查一下你的仪器蛋白质浓度的测定(四)??考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10,100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1,10µg蛋白质。
此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明:NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，(NH4)2SO4无干扰。
强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)一、目的考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue) G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，由Bradford于1976年建立，具有简便快捷，灵敏度高，稳定性好等特点，是一种较好的蛋白质定量测定常用方法。
通过本实验学习应用该法测定蛋白质含量的原理，复习分光光度计的使用及标准曲线的绘制等基本实验技能。
二、原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，游离态呈红色，与蛋白质结合后转变为青色。
在0~1000μg 范围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与蛋白质含量正相关，可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料1．仪器设备：(具塞刻度)试管吸管分光光度计2．试剂(1) 标准蛋白质溶液称取100 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 1 mg/ml溶液。
(2) 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 ml 95%乙醇中，加入85% (m/v)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000 ml (此溶液在常温下可放置一个月)。
(3) 样品蛋白液(10~100 μg/ml)四、操作步骤1标准蛋白质含量(μg)为横坐标、吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定取2支(具塞)试管，分别准确加入0.l ml样品蛋白液，再各加5 ml考马斯亮蓝G-50试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线0号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
五、结果处理根据所测样品提取液的平均吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg/ml)六、思考题1．考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？2．如何正确使用分光光度计？。
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量
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实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10,100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1,10µg蛋白质。
此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明:NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，(NH4)2SO4无干扰。
强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
实验 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
实验五考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一、实验目的1.掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法2.熟练分光光度计的使用和操作方法。
二、实验原理考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。
离心机的使用说明： 1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。
2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。
3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。
分光光度计的使用说明： 1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。
2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=0.00。
3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。
4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。
5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。
三、试剂与器材：1. 试剂：（1）0.9％NaCl：9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。
（2）标准蛋白质：称取50mg结晶牛血清蛋白定溶于50ml容量瓶里。
（3）染液：考马斯亮蓝G-250 0.5g，溶于250mL95%乙醇，再加入500mL85％(W／V)磷酸，保存于棕色瓶中，称为母液。
取150 mL然后加蒸馏水定容到1000mL，保存于棕色瓶中，备用。
2.器材：试管；吸管10mL、l5mL、lmL、0.1mL；722分光光度计四、操作方法1.标准曲线的制备取6支试管，按下表加入各试剂：以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量专业班级：制药工程3班小组成员：梦娴敏林晓丝一、实验目的1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤二、实验原理1、根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G-250是比色法与色素法相结合的复合方法。
考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，当与蛋白质结合后呈青蓝色。
在一定围，也就是蛋白质含量在0~1000ug围，蛋白质-色素结合物在595nm 下的吸光度与蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。
2、考马斯亮蓝G-250法有常量法和微量法两种。
三、仪器与试剂1、仪器：分析天平；铁架台；大漏斗；洗瓶；烧杯100m l×2、50m l×1；吸管10ml×2、5ml×1；胶头滴管；移液枪；离心管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml×3；洗耳球×2；玻璃棒；记号笔。
2、试剂：（1）蒸馏水。
（2）标准蛋白质溶液：用移液枪吸取1ml浓度为1mg/ml标准蛋白质溶液，溶于蒸馏水并定容至10ml，制成0.1mg/ml的原液。
（3）考马斯亮蓝G-250(0.01%)染液:称取0.01g考马斯亮蓝G-250,溶于5ml 90%乙醇中，加入85%（m/v)的磷酸10ml,最后用蒸馏水定容至100ml（此溶液不宜久存，在常温中可放置1~2个月）；将定容好的染液过滤并装入棕色瓶中保存。
（4）样品液：用移液枪取1ml纯牛奶液体（经调查，市场上大部分纯牛奶中蛋白质的含量大致为每100ml中2.5~3.5g），用蒸馏水稍做稀释，然后转移至一号100ml的容量瓶中并定容至100ml;用10ml的吸量管吸取10ml一号容量瓶中的液体于二号100ml的容量瓶中，最后用蒸馏水定容至100ml，此时二号容量瓶中为待测样品液。
四、操作步骤1、0~100μg/ml标准曲线的制作：取8支离心管，编号后，按下表加入试剂，盖塞后，将各试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，以管一为空白对照，在595nm 下比色测定。
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量
⽤考马斯亮蓝G250法测定蛋⽩质含量⽤考马斯亮蓝G250法测定蛋⽩质含量呵呵你的⾃⼰检查⼀下你的仪器蛋⽩质浓度的测定(四)??考马斯亮蓝染⾊法⽬的要求学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋⽩质浓度的原理和⽅法。
实验原理考马斯亮蓝法测定蛋⽩质浓度，是利⽤蛋⽩质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋⽩浓度的快速、灵敏的⽅法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜⾊形式，红⾊和蓝⾊。
它和蛋⽩质通过范德华⼒结合，在⼀定蛋⽩质浓度范围内，蛋⽩质和染料结合符合⽐尔定律(Beer’s law)。
此染料与蛋⽩质结合后颜⾊有红⾊形式和蓝⾊形式，最⼤光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋⽩质的量。
蛋⽩质和染料结合是⼀个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最⼤光吸收，并可稳定1h，之后，蛋⽩质―染料复合物发⽣聚合并沉淀出来。
蛋⽩质―染料复合物具有很⾼的消光系数，使得在测定蛋⽩质浓度时灵敏度很⾼，在测定溶液中含蛋⽩质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，⽐Lowry法灵敏4倍，测定范围为10,100µg蛋⽩质，微量测定法测定范围是1,10µg蛋⽩质。
此反应重复性好，精确度⾼，线性关系好。
标准曲线在蛋⽩质浓度较⼤时稍有弯曲，这是由于染料本⾝的两种颜⾊形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋⽩质结合⽽不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此⽅法⼲扰物少，研究表明:NaCl，KCl，MgCl2，⼄醇，(NH4)2SO4⽆⼲扰。
强碱缓冲液在测定中有⼀些颜⾊⼲扰，这可以⽤适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，⼄酸，2―巯基⼄醇，蔗糖，⽢油，EDTA及微量的去污剂如TritonX―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜⾊⼲扰，⽤适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，⼤量去污剂的存在对颜⾊影响太⼤⽽不易消除。
试剂与器材⼀、试剂考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%⼄醇中，加⼊100ml85%磷酸，⽤蒸馏⽔稀释⾄1000ml，滤纸过滤。
蛋白质含量测定(考马斯亮蓝 G - 250 法)
一、目的蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。
蛋自质的定量分析是蛋自质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。
根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G- 250 法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。
通过本实验学习考马斯亮蓝G －250 法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
二、原理考马斯亮蓝G - 250 是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋自质结合后变为青色。
蛋白质含量在0 - 1000ug 范围内，蛋白质一色素结合物在595 nm 下的吸光度与蛋自质含量成正比，故可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料1、仪器（1 ）分析天平（2 ）具塞刻度试管10ml X 8（3 ）吸管0 ． 1 ml X 1 ， 1 ml X 2 ，5 ml X 1（4 ）研钵（5 ）漏斗（6 ）离心管l0ml（7 ）容量瓶10ml X 1（8 ）离心机（9 ）721 型分光光度计2、试剂（ 1 ）标准蛋白质溶液称取10mg 牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml ，制成100ug/ ml 的原液。
（2 ）考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂称取100mg 考马斯亮蓝G-250 ，溶于50ml 90 乙醇中，加入85 ％（m/v ）的磷酸100ml ，最后用蒸馏水定容到1000 ml 。
此溶液在常温下可放置一个月。
3、材料绿豆芽四、操作步骤1、标准曲线的制作取6 支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。
盖上塞子，摇匀。
放置2min 后在595 nm 波长下比色测定（比色应在1h 内完成）。
以牛血清白蛋白含量（ug) 为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2、样品中蛋白质含量的测定（1 ）准确称取约200mg 绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml 蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心(4000r/min, 10min), 将上清液倒入loml 容量瓶，再向残渣中加入2ml 蒸馏水，悬浮后再离心l0min ，合并上清液，定容至刻度。
考马斯亮蓝 法测定蛋白质含量
二、Bradford法(一）、原理：考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。
这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。
该方法快速、准确、干扰因素少。
CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。
但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。
（二）器材及试剂1、器材A. 分光光度计B. 微量加样器C. 移液管、试管及试管架D. 坐标纸2. 试剂（1）考马斯亮蓝G-250溶液：称取CBB- G-250 100毫克溶于50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升85%（V/V）磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。
（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）（3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。
(4) 血清样品(已稀释200倍)(5) 层析样品(三）、操作（标准曲线制作）：取7支试管按下表操作：混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D 值为纵坐标绘制标准曲线．以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度取试管从层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。
教学内容：实验八考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量【实验目的】1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法【实验原理】此方法是1976年Bradform建立。
蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)
蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G－250法）一、目的蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。
蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。
根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。
通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
二、原理考马斯亮蓝G－250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。
蛋白质含量在0～1000μg范围内，蛋白质一色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料1．仪器（1）分析天平（2）具塞刻度试管10ml×8 （3）吸管0.lml×I，lml×Z，5ml×I （4）研钵（5）漏斗（6）离心管10ml （7）容量瓶10ml （8）离心机（9）721型分光光度计2．试剂（1）标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成100 pg／ml的原液。
（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入85％（m／v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。
此溶液在常温下可放置一个月。
3．材料绿豆芽四、操作步骤1．标准曲线的制作取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。
管号操作项目 1 2 3 4 5 6标准蛋白质溶液(ml) 0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0G-250试剂(ml) 各5蛋白质含量（μg）0 20 40 60 80 100盖上塞子，摇匀。
放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在l h内完成）。
考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
（优选）考马斯亮蓝法法测定 蛋白质含量
【实验原理】
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于 染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕 红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白 质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色， 其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数 更大。
考马斯亮蓝G-250在游离状态 下呈红色，最大光吸收在 465nm；当它与蛋白质结合 后变为青色，蛋白质-色素结 合物在595nm波长下有最大 光吸收。其光吸收值与蛋白质 含量成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G250的 结合十分迅速，约2min即可 反应完全，其复合物在1h内 保持稳定。
考马斯亮蓝R250与蛋白 质反应虽然比较缓慢， 但是可以被洗脱下去， 所以可以用来对电泳条 带染色。
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）,
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；
蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 考马斯亮蓝试剂（mL）
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液(I)
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1µg）。 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。 （优选）考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大。 可见光范围内波长和颜色的关系
考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量精
仪器和试剂
1．仪器：分析天平；吸管0.1ml×1、1ml×2、5ml×1； 试管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml、1000ml 各一个；
2．试剂： （1）0.9% NaCl溶液； （2）标准蛋白质溶液：称取10mg 牛血清白蛋白，溶于 蒸馏水并定容至100ml，制成0.1mg/ml 的原液。 （3）考马斯亮蓝G-250（0.01%）染液：称取0.1g考马斯 亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（m/v） 的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液不 宜久存，在常温中可放置1-2个月。 （4）样品液：取牛血清白蛋白0.1mg/ml 的溶液，用 0.9% NaCl溶液稀释至一定浓度。
操作步骤
1．0~100μg／mL标准曲线的制作： 取6支试管，编号后，按下表加入试剂，
混匀，室温静置5min后，以管1为空白对照， 在595nm下比色测定。以标准蛋白质含量 （μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出 标准曲线。
管号
123 4 56
蛋白质标准液 （ml）
0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
0.9%NaCl溶液 1.0 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 （ml）
考马斯亮蓝染液 5 5 5 5 5 5
蛋白质含量（μg）
A595
2．样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加 入合适浓度的待测样品，使其测定值在标 准曲线的范围内，测定方法同上，由样品 液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
实验目的
了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作
步骤
实验原理
考马斯亮蓝G250在酸性的溶液中游离状态 呈红褐色，与蛋白质结合后呈蓝色，其最 大吸收波长由465nm转变为595nm。在一定 的蛋白质浓度范围内，595nm处的光密度值 与蛋白质浓度成反比，可用比色法进行蛋 白质定量测定。
实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量
实验七考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量一、试验目的1. 学习分光光度计的原理及操作2. 学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度二、基本原理1.根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光谱法或分光光度法。
该法所用的仪器称为分光光度计或吸收光谱仪。
该法所使用的光谱范围包括可见光和紫外光，即包括波长在200 - 800 nm之间的光。
2.分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。
3.紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。
由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即200nm-400nmo可见光区为400nm -800nm o4.考马斯亮蓝G250法原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后，其最大吸收波长从465nm改变为595nm该蛋白-染料复合物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定1卩g /mL 的蛋白质，染料和蛋白结合只需要2分钟，颜色在1小时内稳定。
操作简便，快速，是常用的蛋白含量测定方法之一。
去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定三、试剂1.标准蛋白质溶液:0. 5mg/ml牛血清白蛋白溶液2.考马斯亮蓝G250蛋白染色剂：四、操作步骤1.标准曲线的绘制：取6只试管，分别加入浓度为0, 0. 1, 0.2, 0.3, 0.4, 0. 5mg/ml的标准蛋白质溶液0. lml,然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
2.样品测定：样品液0. ImL ,然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nni测定吸光值。
从标准曲线中查出相应的浓度。
五、试验结果2 •标准曲线的绘制标准曲线0 0. 1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6标准蛋白质溶液浓度mg/ml3 •样品的测定0. 085, 0.017 ),所以样品的浓度为根据标准曲线可以找出样品对应的点(0. 085mg/mlo六.结果讨论注意事项：1・分光光度计必须放置在固定而且不受震动的仪器台上，不能随意搬动。
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实验七考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量
一、试验目的
1. 学习分光光度计的原理及操作
2.学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度
二、基本原理
1. 根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光谱法或分光
光度法。
该法所用的仪器称为分光光度计或吸收光谱仪。
该法所使用的光谱范围包括可见光和紫外光，即包括波长在200 - 800 nm之间的光。
2.分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光
光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。
3.紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。
由于吸收池（又称样
品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即200nm-400nm。
可见光区为400nm -800nm。
4.考马斯亮蓝G250法
原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后，其最大吸收波长从465nm改变为595nm,该蛋白－染料复合物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定1μg /mL的蛋白质，染料和蛋白结合只需要2分钟，颜色在1小时内稳定。
操作简便，快速，是常用的蛋白含量测定方法之一。
去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定
三、试剂
1. 标准蛋白质溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白溶液
2. 考马斯亮蓝G250蛋白染色剂：
四、操作步骤
1.标准曲线的绘制：
取6只试管，分别加入浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/ml的标准蛋白质溶液0.1ml，然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm 测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
2.样品测定：
样品液0.1mL , 然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm 测定吸光值。
从标准曲线中查出相应的浓度。
五、试验结果
3.样品的测定
根据标准曲线可以找出样品对应的点（0.085，0.017），所以样品的浓度为
0.085mg/ml。
六.结果讨论
注意事项：
1.分光光度计必须放置在固定而且不受震动的仪器台上，不能随意搬动。
严
防震动、潮湿和强光直射。
2.盛待测液时，必须达到比色杯2/3左右，不宜过多。
若不慎使溶液流出比色
杯外面，必须先用滤纸吸干，再用擦镜纸或绸布擦净才能放入比色杯槽内。
移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。
3.千万不可用手、滤纸、毛刷等物摩擦比色杯光滑面。
4.用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。
5.每套分光光度计上的比色杯及比色槽不能随意更换。