Hucker改良的革兰氏染色法(最新整理)
革兰氏染色法步骤及注意事项
1. 准备细菌涂片：将待染菌株取一小滴放在玻璃片上，用铅笔头部画成细 线，形成细菌涂片。
2. 固定：将细菌涂片在火焰上反面向上加热，使细菌附着在玻璃片上。 3. 染色： a. 涂上紫晶液：将细菌涂片浸入紫晶液中，静置 1 分钟。 b. 冲
1. 操作环境应保持干净，并采取无菌操作，以避免外界细菌污染。 2. 手套、眼镜和实验室外套是必需的个人防护装备。
3. 严格遵守安全操作规程，如避免将染料接触到皮肤或进入口鼻。
4. 使用优质的试剂和试验器材，以确保结果的准确性。
5. 注意控制染Βιβλιοθήκη 时间和冲洗时间，过长或过短都可能影响染色效果。
6. 在观察细菌涂片时，使用适当的显微镜镜头和光源，以获得清晰的图 像。
洗：用蒸馏水或脱离水轻轻冲洗玻璃片，以去除多余的紫晶液。 c. 酒 精洗涤：滴加酒精洗涤玻璃片，使其被酒精覆盖，持续洗涤 15-30 秒。 d. 再次冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃片，以去除酒精。 e. 涂上碘液： 滴加碘液覆盖细菌涂片，静置 1 分钟。 f. 冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃 片，以去除多余的碘液。 g. 酒精洗涤：滴加酒精洗涤玻璃片，使其被 酒精覆盖，持续洗涤 15-30 秒。 h. 再次冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃 片，以去除酒精。 i. 涂上脱色剂：滴加脱色剂覆盖细菌涂片，持续涂覆 15-30 秒。 j. 冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃片，以去除脱色剂。 4. 染色：将细菌涂片滴上红色染料（如苏丹三染料）覆盖细菌，静置 1 分 钟。 5. 冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃片，以去除多余的染料。 6. 干燥：将细菌涂片放在通风处晾干，或用吹风机低温吹干。 7. 观察：将干燥的细菌涂片放在显微镜下观察，细菌将呈现出紫色或蓝色 的革兰氏阳性颜色，而其他微生物将呈现出红色的革兰氏阴性颜色。 注意事项：
实验3细菌的简单染色和革兰氏染色_基础生物学实验(安徽大学研究生复试用,生物 生命科学)
实验三细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的1.学习微生物的涂片、染色和基本操作技术。
2.掌握微生物的简单染色、革兰氏染色的基本原理和方法。
3.初步认识细菌的形态特征。
二、实验原理染色是细菌学中的一项重要的基本操作技术。
由于微生物与各种性质的染料具有一定的亲和力，从而使微生物着色，着色后的菌体折光性弱，色差明显。
在显微镜下容易观察细胞的内部结构及其内含物，因此，微生物染色是进行微生物形态观察的重要方法之一。
染色分为单染（简单染色），复染（革兰氏染色）。
单染较简单，以同一种染料让菌体着色，以显示微生物的形态。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如沙黄）复染。
经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。
1884年由丹麦病理学家C. Gram创立了革兰氏染色法，后来一些学者在此基础上作了某些改进。
革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。
实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用脱色剂(乙醇)处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、含脂量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫——碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。
革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、含脂量高，当用脱色剂(乙醇)处理后，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
革兰氏染色操作方法过程
革兰氏染色操作方法过程革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，用于区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
操作步骤如下：1. 取一支细菌培养液，用无菌棉签蘸取适量的细菌样品。
2. 在显微镜片上滴加一滴细菌样品。
3. 用锡夹夹住显微镜片，将显微镜片通过火焰杀菌，以消毒细菌样品。
4. 将显微镜片上的细菌样品放置于乙醇中，浸泡1-2分钟，进行固定。
5. 取出显微镜片，倾倒掉乙醇，用水冲洗显微镜片，以去除残留的乙醇。
6. 滴加革兰氏染色液（由紫色的结晶紫和碘酒混合制成），使其完全覆盖细菌样品。
7. 静置1分钟，将显微镜片冲洗至水清。
8. 将显微镜片放入去结晶紫酒的洗涤液中，浸泡20-30秒，进行除色。
9. 冲洗干净后，加入洗净的碱性碘液，浸泡20-30秒，进行碘固定。
10. 将显微镜片放入无菌水中，冲洗干净。
11. 用酒精洗液将显微镜片沥干。
12. 将显微镜片放入苏木精洗涤液中，浸泡20-30秒，进行染色。
13. 冲洗干净后，用水洗涤。
14. 用酒精洗液将显微镜片沥干。
15. 将显微镜片放入氯仿中，浸泡1-2分钟，清洗细胞。
16. 用酒精洗液将显微镜片沥干。
17. 将显微镜片放入醋酸乙酯中，浸泡1-2分钟，清洗细胞。
18. 用酒精洗液将显微镜片沥干。
19. 将显微镜片倒置在玻璃片上晾干。
20. 最后，在显微镜下观察染色结果。
革兰氏阳性菌为紫色，革兰氏阴性菌为粉红色。
注意事项：- 操作中要使用无菌试剂和器皿，以防止细菌污染。
- 染色液的配制和保存要按照说明书进行。
- 操作过程中要注意不要受伤，避免染色液和化学物品溅到皮肤或眼睛上。
- 染色后，显微镜片要彻底干燥，以便观察。
复习思考题及答案1用光学显微镜观察细菌时为什么一般都需要
第四章复习思考题及答案1. 用光学显微镜观察细菌时, 为什么一般都需要先将细菌进行染色？制作细菌染色标本片时，为什么必须先对涂在载玻片上的细菌样品进行固定？固定时应注意什么问题？答：由于细菌细胞小且无色透明, 直接用光学显微镜观察时, 菌体和背景反差很小，难以看清细菌的形态, 更不易识别某些细胞结构, 因此，一般都需要先将细菌进行染色, 借助于颜色的反衬作用, 以提高观察样品不同部位的反差, 能更清楚地进行观察和研究。
此外，某些染色法还可用于鉴别不同类群的细菌, 故细菌的染色是工业微生物学实验中重要的基本技术。
染色前必须先对涂在载玻片上的细菌样品进行固定，固定的作用一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上, 一是增加菌体对染料的亲和力。
一般常用酒精灯火焰加热固定的方法，但应注意防止细胞膨胀和收缩，尽量保持细胞原形。
2. 革兰氏染色法包括哪几个基本步骤？你认为影响革兰氏染色结果正确性的关键环节是什么？答：革兰氏染色法的基本步骤是: 先用初染剂草酸铵结晶紫进行初染, 再用媒染剂碘液媒染,然后用脱色剂乙醇处理, 最后用复染剂石炭酸复红或番红进行复染。
经此法染色后, 若细菌不被酒精脱色，能保持结晶紫与碘的复合物而呈现蓝紫色，则该菌称为革兰氏阳性细菌(G+)；反之，若细菌能被酒精脱色，而被复红或番红复染成红色, 则称之为革兰氏阴性细菌(G-)。
被普遍采用的经Hucker氏改良的革兰氏染色法, 其操作步骤为：制片→初染→媒染→脱色→复染→干燥→观察。
影响革兰氏染色结果正确性的关键环节是用脱色剂乙醇处理, 为了保证革兰氏染色结果的正确性, 必须控制乙醇脱色时间, 尽量采用规范的染色方法。
3. 放线菌、酵母菌和霉菌显微标本片的制作分别可采用哪些方法？各有什么特点？答：放线菌与细菌的单染色一样，可用石炭酸复红或吕氏美兰等染料着色后，在显微镜下观察其形态。
但为了观察放线菌在自然生长状态下的形态特征, 可应用各种培养、制片和观察方法, 其中印片法、插片法和玻璃纸法是三种常用的方法。
最新整理革兰氏染色法的过程及原理备课讲稿
革兰氏染色法的过程及原理一，过程1 ．涂片将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。
固定时通过火焰l 一2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2 ．染色( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。
( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。
( 5 ）镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
二，原理革兰氏染色法（Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G＋表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G 一表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色，不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。
此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
青霉素作用机制干扰细菌细胞壁的合成。
青霉素你的结果与细胞壁的成分粘肽结构中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍你粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。
革兰氏染色法的原理和步骤
革兰氏染色法的原理和步骤革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，它可以将细菌区分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
这种染色方法是由丹麦微生物学家Christian Gram于1884年首次提出的。
革兰氏染色法的原理是利用细菌细胞壁的特性来区分不同类型的细菌。
细菌细胞壁的主要成分是多聚糖和肽聚糖，革兰氏氏染色法通过不同的处理步骤，使得细菌细胞壁的特性在染色过程中显现出来。
革兰氏染色法的步骤如下：1. 准备细菌涂片：首先，从培养基中取一小块细菌培养物，涂抹在玻璃片上，形成细菌涂片。
2. 固定：将细菌涂片在空气中晾干，然后用火焰快速烘烤，使细菌固定在玻璃片上。
3. 染色：将固定的细菌涂片放入革兰染色液中浸泡几分钟。
革兰染色液主要由紫晶染料和碘酒组成。
紫晶染料可以渗透进入细菌细胞壁，而碘酒可以固定染色物质。
浸泡时间过长会导致革兰氏阳性菌染色过度。
4. 洗涤：用蒸馏水冲洗细菌涂片，以去除多余的染色剂。
5. 差染：将细菌涂片放入酒精-醋酸溶液中浸泡几秒钟，然后用蒸馏水冲洗。
这一步是为了除去革兰氏阴性菌表面的染色剂。
6. 洗涤：再次用蒸馏水冲洗细菌涂片。
7. 对比染色：将细菌涂片放入苏木精染色液中浸泡几分钟。
苏木精染色液会将革兰氏阴性菌染成红色。
8. 洗涤：用蒸馏水冲洗细菌涂片。
9. 干燥：将细菌涂片放入通风处晾干。
通过上述步骤，革兰氏染色法可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌在染色后呈紫色，而革兰氏阴性菌在染色后呈红色。
革兰氏染色法的原理基于细菌细胞壁的差异。
细菌细胞壁是由多聚糖和肽聚糖组成的。
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，含有大量的多聚糖和肽聚糖，而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，含有较少的多聚糖和肽聚糖。
在染色过程中，革兰染色液中的紫晶染料可以渗透进入细菌细胞壁，并与细菌细胞内的多聚糖和肽聚糖结合，使革兰氏阳性菌呈紫色。
而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，紫晶染料不能渗透进去，因此在差染过程中被苏木精染色液染成红色。
革兰氏染色法详细步骤
革兰氏染色法详细步骤革兰氏染色法革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，用于鉴别细菌的类型，也是临床和实验室细菌学检查的重要手段。
以下是革兰氏染色法的详细步骤：1. 涂片：取一张洁净的载玻片，用移液器或毛细管将菌液滴在载玻片上，涂布均匀。
涂片时，应先滴少量菌液，涂布均匀后再滴加剩余菌液。
涂片时需注意不要将菌液涂成条状或块状，以免影响染色效果。
2. 固定：涂片完成后，将载玻片置于酒精灯火焰上方，用镊子夹住，用外焰固定约30秒至1分钟。
固定时需注意不要将玻片烧焦，以免影响染色效果。
3. 初染：用移液器或毛细管取少量结晶紫溶液，滴加在涂片菌膜上，染色3分钟至5分钟。
结晶紫是一种碱性染料，能够与细菌中的核糖核酸结合，使其呈现紫色。
4. 媒染：用移液器或毛细管取少量沙黄溶液，滴加在初染后的菌膜上，染色1分钟至2分钟。
沙黄是一种酸性染料，能够使革兰氏阳性菌被染成红色，革兰氏阴性菌被染成绿色。
5. 脱色：用移液器或毛细管取少量95%乙醇溶液，滴加在媒染后的菌膜上，轻轻摇动玻片，使菌膜上的染料脱色。
脱色时需注意不要将菌膜洗脱或出现折痕。
6. 复染：用移液器或毛细管取少量番红溶液，滴加在脱色后的菌膜上，染色3分钟至5分钟。
番红是一种碱性染料，能够使革兰氏阳性菌被染成红色，革兰氏阴性菌被染成蓝色。
7. 镜检：染色完成后，用吸水纸吸干菌膜上的染料，盖上盖玻片，显微镜下观察细菌的革兰氏染色结果。
革兰氏阳性菌呈现红色或紫色，革兰氏阴性菌呈现蓝色或绿色。
以上是革兰氏染色法的详细步骤。
操作时需注意安全，避免酒精灯等高温物品烫伤。
同时需注意每一步操作的准确性和一致性，以保证染色结果的准确性和可比性。
革兰氏染色的机理及步骤
革兰氏染色的机理及步骤
革兰氏染色法是一种根据细胞内细菌细胞壁的结构特征来辨别和鉴定
细菌的一种常用技术。
该技术最初是由德国科学家哈尔·革兰 (Hans Christian Gram)于1884年提出的，故称为“革兰氏染色”，也称为“革
兰氏分解染色”。
一、去颗粒步骤
1、将标本涂在热型固定片上，然后用容积为100毫升的细菌液，在
塑料滤膜上均匀涂抹；
2、把固定片置于热水浴中，把表面上的涂片分散成微小的颗粒，然
后用蒸汽烘烤，使其溶解，就是所谓的“去颗粒”步骤；
3、在一定的时间（一般是3-5分钟）内，把标本从热水中取出，放
入水槽中，用温水洗去多余的染色剂和固定液。
二、染色步骤
1、把每张固定片均匀地涂上革兰氏染料，一般为淡蓝色的彩色染料；
2、将染色后的固定片置于热水浴中，使其溶解，形成颗粒；
3、先把标本从热水中取出，放入水槽中，然后再放入5%（或更低）
的硫酸银溶液中，这时，染色料会依据细菌细胞的结构特征不同或较快或
较慢地被硫酸银离解，而细菌细胞也会被银离解；
4、当硫酸银完全离解掉时，将固定片取出。
革兰氏染色步骤和原理
革兰氏染色步骤和原理革兰氏染色是微生物检测和分类中最常用的染色方法之一、它是由丹麦细菌学家洛尔德·克里斯廷·革兰于1884年发明的。
革兰氏染色通过染色的方式将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌，从而有助于快速诊断和鉴定细菌。
1.取一块无菌玻璃片，将其浸泡在80%酒精中，用火鉴或酒精灯将其加热烘干。
3.用无菌棉签取适量菌液，涂抹在玻璃片上，并尽量保持均匀。
4.用火鉴或酒精灯加热玻璃片，使细菌在玻璃片上固定。
5.将固定的玻璃片浸泡在革兰碘液中，浸泡2分钟，使细菌固定。
6.将玻璃片从革兰碘液中取出，用蒸馏水冲洗干净。
7.将玻璃片放在洗涤盘中，滴入革兰染色剂，染色剂液体覆盖玻璃片。
8.把玻璃片放在盛有革兰染色剂的洗涤盘上，静置30秒钟。
9.将玻璃片从革兰染色剂中取出，用蒸馏水冲洗干净。
10.用酒精清洗涤盘中的染色剂，直到洗涤盘中的染色剂变为浅紫色。
11.用蒸馏水冲洗玻璃片，直到从玻璃片上冲洗下的清水不在有颜色。
12.用滴状水用于玻璃片上，除去上面的残余水分。
13.用显微镜观察玻璃片上的细菌，根据染色后细菌的颜色和形状，判断细菌是否革兰阳性或革兰阴性。
革兰阳性菌的细胞壁主要由多层厚厚的胞壁肽聚糖复合物组成，细胞壁对革兰染色剂有高度的亲和力，因此在染色后能保持染色剂的颜色，呈现紫色或深紫色。
革兰阴性菌的细胞壁则相对较薄，同时细胞壁外还有一层脂质结构，染色剂难以渗透进入细胞壁内部，因此在酒精处理过程中，会溶解掉染色剂，导致细胞失去染色，最后用对比性染色（如用红色染料）重新染色，呈现红色。
通过上述步骤和原理，我们可以将细菌分为革兰阳性和革兰阴性两类，辅助进行细菌鉴定和分类。
革兰氏染色的速度快、操作简单，因此在临床医学和实验室中得到广泛应用。
革兰氏染色的操作流程及操作技术要点
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革兰氏染色步骤和原理
革兰氏染色步骤和原理第一步：准备好白色的玻璃板和酒精革兰氏染色是一种常用的细菌检测方法，可以快速检测出细菌的形态、分布和数量。
该方法是由丹麦微生物学家革兰氏于1884年发明的，经过多年的临床实践和改良，现在已成为临床医学和微生物学领域中的重要检测手段之一。
1.样品制备：首先要准备好待检测的细菌样品，通常需要从血液、尿液、痰液、分泌物或其他体液中获得。
为了确保样品的洁净和完整性，最好将样品进行稀释，减少样品的干扰，同时也便于操作。
2.染色处理：将制好的样品涂在载玻片上，使其干燥，然后用甲醇进行固定处理，使细胞蛋白质凝固，并烘干。
随后将载玻片以45度角倾斜，加入革兰染色液，静置约1分钟，然后用水冲洗2-3秒钟。
再加入碘酒，静置1分钟，然后再用水冲洗2-3秒钟。
洗涤后可以在载玻片上滴一两滴乙醇，退色1-2秒钟，再用水冲洗，并用滤纸吸干表面水分。
3.洗涤：将载玻片表面涂上感兴趣的菌株的染色处理，静置一定时间后，用盐水等进行洗涤，去除载玻片表面无关物质，使细胞染色更加清晰。
4.显微镜观察：用油镜片把载玻片放到显微镜上，通过放大镜片观察载玻片上的细菌。
革兰氏染色能够使革兰氏阳性的细菌形成紫色，而革兰氏阴性的细菌则形成粉色。
革兰氏染色的原理基于细菌细胞壁化学成分的差异性。
革兰氏阳性菌细胞壁厚，主要由多层厚壁多聚糖和蛋白质组成，其细胞壁中还含有少量脂质和磷酸化甘露醇，能够吸附革兰染色液，形成紫色颗粒。
而革兰氏阴性菌细胞壁相对较薄，主要由一层厚度较小的胞外膜和较厚的革兰氏染色物质组成，故染色后革兰氏阴性菌呈粉色。
革兰氏染色方法简单、便捷、易于操作，能够快速鉴别出不同类型的细菌，是一种常用的细菌检测方法。
这种染色方法对细菌的形态、数量和分布都能进行精确的检测和分析，对于临床医学和微生物学领域的细菌研究和治疗具有重要意义。
(最新整理)革兰氏染色试验步骤
革兰氏染色基本原理方法及临床意义
革兰氏染色基本原理方法及临床意义
一、克氏染色的基本原理
克氏染色是一种用于诊断细菌感染和病原体感染的常用实验技术。
它
以微生物为胞杆载体，利用特定染料将微生物细胞的结构特征染色清晰，
以显示其细胞壁结构和其它细胞外特征，用于对细菌的形态、器官的识别
及病原体的诊断等研究。
克氏染色的基本原理是：利用细菌的原生物和膜中各种物质，与染料
共同形成染料络合物，使细菌的形状和外观形成染色图像，再根据克氏染
色结果，可以得到细菌的形态特征，以及细菌的核糖体酶活性等一些信息，以便进行细菌快速鉴定。
二、克氏染色的方法
1、克氏染色的染料
克氏染色的染料主要有羟基酚紅染料（Hucker’s No.1）、硝酸霉素
染料（Shröder’s No.2）、甲基红染料（Kessler’s No.3）、磺胺染料（Gram’s No.4）、3,3’-二氯联苯染料（Vancouver’s No.5）等。
2、克氏染色的步骤
（1）准备样品：将待检查的液体样品，用细菌棒挖取细菌，再用普
通细菌培养基中培养，细菌萌发、悬浮在培养基表面，等待染色。
（2）染色：将羟基酚紅染料、硝酸霉素染料混合溶于水中，在培养
基中加入染料溶液，等待细菌形成染料络合物。
革兰染色法的具体步骤 -回复
革兰染色法的具体步骤-回复革兰染色法是一种常用的细菌染色方法，可以将细菌分为革兰阳性和革兰阴性两类。
这种染色方法是丹酚-碘染色法的一种改进，通过不同颜色的染料与细菌细胞壁的化学性质不同而实现。
以下是革兰染色法的具体步骤：步骤一：准备细菌标本首先，从培养基或病人的临床样本中选择一种纯种细菌，并将其接种到富营养的液体培养基中，使其增殖和生长。
当菌液达到稀释阶段时，取出适量细菌液制备标本。
步骤二：固定细菌取一块干净的玻璃片，用石蜡笔在玻璃片上标记样本编号。
然后，用铅笔在玻片上画出一个直径约为1-2厘米的圆圈。
将一滴细菌标本涂抹在圆圈中心。
步骤三：空气干燥将玻片夹在显微镜钳片中，使其倾斜，以允许空气流过标本。
让细菌样本无菌的空气中自然干燥。
步骤四：热固定将固定好的细菌标本以痛苦的角度，通过自然光或热风排气橱等设备来瞬间加热固定，杀死细菌并将细菌黏附在玻片上。
这个步骤在杀菌的同时也会使细菌的染色更加牢固。
步骤五：染色将玻片浸入革兰染色剂（如革兰碘溶液），并充分涂覆整个细菌样本。
革兰染色剂由紫色结晶紧密保护着，该结晶黏附并渗透到细菌细胞壁中，使其固定在细菌表面。
步骤六：洗涤用蒸馏水轻轻冲洗玻片，直到冲洗出的液体基本无色为止。
这一步骤的目的是去除细菌外面多余的革兰碘溶液。
步骤七：脱色将玻片浸入酒精溶液（乙醇或乙醇/丙酮混合溶液）中，以溶剂中的酒精溶液脱去细菌细胞壁中的蓝色染料。
脱色时间根据实验要求和细菌特性而定，通常为30秒至1分钟。
步骤八：洗涤用蒸馏水轻轻冲洗玻片，直到洗涤出的液体基本无色。
这一步骤的目的是去除过量的酒精溶液。
步骤九：对比染色将玻片浸入对比染色液，如粉红色的红色沥青酸添加溶液。
对比染色剂渗透到细菌细胞壁中，使其显现出和革兰阳性细菌形成鲜艳的假阳性颜色。
保持对比染色液表面液滴在细菌样本上1~2分钟。
步骤十：洗涤用蒸馏水轻轻冲洗玻片，直到洗涤出的液体基本无色。
这一步骤的目的是去除过量的对比染色剂。
革兰氏染色四步法与改良两步法的比较
革兰氏染色四步法与改良两步法的比较摘要】目的比较革兰氏染色经典的四步法与改良的两步法在临床微生物检测上的实验效率与性能结果。
方法对标准菌株质控品为（G-菌和G+菌）、血培养分级报告阳性标本、痰标本的总计120例样本采用革兰氏染色经典的四步法与改良的两步法进行实验比对，其中血培养阳性标本通过两种革兰氏染色方法一致符合，有28个革兰氏阳性细菌和32个革兰氏阴性细菌。
其中痰直接涂片标本通过两种革兰氏染色方法结果有两株细菌在两步法染色判读结果为革兰氏阴性细菌而在四步法染色中结果为革兰氏阳性细菌。
结论经统计学分析差异，P>0.05，表明两种血培养瓶的阳性检出率和阴性检出率在统计学上无显著性差异。
由此得出结论，革兰染色二步法完全可以替代四步法，操作简易、染色快、效果好，大大缩短了标本处理的时间。
【关键词】革兰氏染色四步法两步法【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）34-0009-01材料和方法1 材料1.1 标本来源和采集标准菌株质控品G-菌为大肠埃希氏菌（ATCC29523）、G+菌为金黄色葡萄球菌（ATCC29213），血培养分级报告阳性标本（采用革兰氏染色直接涂片），痰标本，总计120例。
1.2 仪器与试剂显微镜； VITEK2C全自动微生物鉴定药敏分析仪，法国生物梅里埃公司。
BASO革兰氏染色液（经典四步法），上海贝沙公司；改良二步法革兰氏染色液250ml*2瓶/套，无锡飞伊生物科技有限公司。
2 方法2.1 采用经典四步法革兰氏染色液操作步骤（1）涂片：取干净的载玻片在涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
针对液体培养基：用接种环沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜。
针对固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。
（2）干燥：让涂片在空气中自然干燥。
（3）固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定。
革兰氏染色法步骤详解
革兰氏染色法步骤详解革兰氏染色法是微生物学中常用的染色方法之一，用于区分细菌的结构和特征。
本文将深入讨论革兰氏染色法的步骤，并提供对这个方法的观点和理解。
一、引言在微生物学中，革兰氏染色法是一种重要的技术手段，通过染色可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
这个方法的基本理念是利用染料与细菌细胞壁的化学成分相互作用，以实现细菌分类和分析的目的。
二、步骤详解1. 准备细菌标本在进行革兰氏染色前，需要准备细菌培养物或细菌纯培养物作为标本。
可以从实验室中的细菌培养物中选取一个单一的菌落，或者从培养基上划取一小段细菌生长物。
2. 固定细菌标本取一片清洁的玻璃载玻片，利用火焰将其杀菌。
将玻片放在洁净的培养皿中，并滴加一滴蒸馏水。
用平净的无菌棒或无菌铂丝取一小部分细菌标本，涂抹在玻片上。
用火焰消毒无菌棒或无菌铂丝，然后将其放回细菌培养物中。
3. 固定细菌标本将滴有细菌标本的玻片迅速通过火焰，使细菌固定在玻片上。
这一步骤中的火焰杀菌具有重要意义，可以避免后续步骤中的交叉污染问题。
4. 革兰氏染液的使用革兰氏染液通常由蓝色染料结晶紫（crystal violet）、碘化物、脱色剂和红色染料伊苏胺组成。
将预先制备好的革兰氏染液滴在固定的细菌标本上，让其覆盖整个玻片。
5. 染色时间控制整个样本与染色剂接触的时间是关键因素之一，通常控制在1分钟左右。
过长或过短的染色时间都会对结果产生影响，甚至会导致假阳性或假阴性。
6. 去色在染色后，用脱色剂洗去多余的染色剂。
一般来说，用酒精或乙醚轻轻洗涤玻片，直到洗涤剂下流出的颜色不再变深为止。
7. 洗净将玻片放在自来水龙头下冲洗，直到洗涤液中不再有染色剂冲走为止。
这个步骤至关重要，因为过多的染色剂残留可能影响结果的准确性。
8. 透明化将玻片轻轻摇干，然后在显微镜下观察。
可以用透明液（一般为苏木精或环己烷）再次冲洗玻片，使细菌更加透明。
9. 观察细菌将处理过的玻片放在显微镜下观察。
革兰氏染色法的染色步骤
革兰氏染色法的染色步骤革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
这种染色方法以丹宁蓝、碘溶液和洋红为主要染料，通过不同细菌细胞壁的结构差异，使得革兰氏阳性菌呈现紫蓝色，而革兰氏阴性菌呈现红粉色。
本文将详细介绍革兰氏染色法的具体步骤。
材料准备在进行革兰氏染色之前，我们需要准备以下材料：1.丹宁蓝（Crystal Violet）：用于初次染色。
2.Lugol碘溶液（Iodine solution）：用于固定颜料。
3.乙醇（Ethanol）：用于脱色。
4.洋红（Safranin）：用于对比着色。
此外，还需要准备玻璃片、牛津杯、显微镜、吸水纸等实验器材。
染色步骤下面是进行革兰氏染色的具体步骤：1. 制备细菌涂片首先，将待染色的细菌培养物取出一滴，滴在玻璃片上。
然后，用另一块玻璃片将细菌涂开成薄膜。
注意，要避免过度涂抹，以免细胞损坏。
2. 固定颜料接下来，在细菌涂片上滴加丹宁蓝（Crystal Violet），让其覆盖整个细菌涂片。
静置约30秒钟，使颜料渗透到细菌的细胞壁和胞质中。
3. 洗涤使用水或者生理盐水轻轻冲洗细菌涂片，以去除未结合的丹宁蓝。
4. 碘固定滴加Lugol碘溶液（Iodine solution）到细菌涂片上，让其覆盖整个区域。
静置约1分钟，使碘与丹宁蓝形成络合物并沉积在细菌内部。
5. 脱色倾斜玻璃片，并缓慢滴加乙醇（Ethanol）至细菌涂片上，直到滴下的乙醇呈现颜色为止。
这个步骤的目的是脱去革兰氏阴性菌的外膜，使其能够吸收洋红。
6. 冲洗使用水或者生理盐水轻轻冲洗细菌涂片，以去除乙醇和碘。
7. 对比染色滴加洋红（Safranin）到细菌涂片上，让其覆盖整个区域。
静置约1分钟，使洋红渗透到细菌细胞中。
8. 再次冲洗使用水或者生理盐水轻轻冲洗细菌涂片，以去除多余的染料。
9. 干燥与观察将细菌涂片放置在通风处晾干。
待干燥后，可以使用显微镜观察结果。
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Hucker 改良的革兰氏染色法
一、实验目的
1、了解革兰氏染色法的原理及操作方法
2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性
3、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术
4、掌握显微镜（油镜）的使用方法
5、初步认识细菌的形态特征
二、实验原理
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家Christain Gram创立。
细菌先经碱性染料结晶紫染色，而后经碘液媒染，用酒精脱色，革兰氏阳性菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。
革兰氏阴性菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红色。
三、实验器材
1、设备：显微镜（尼康YS100、YS2-H；）
2、材料：酒精灯、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、载玻片、盖片、擦镜纸、白纸、革兰氏染色液（结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红液）、生理盐水
3、菌种：（1）大肠杆菌；（2）枯草芽孢杆菌
四、实验步骤
1、涂片
取一块洁净载玻片，在载玻片的左、中、右3处各滴加一小滴无菌生理盐水，且均匀分布，用接种环以无菌操作分别从大肠杆菌和枯草芽孢杆菌斜面上挑取少许菌苔于左、右一水滴中，从大肠杆菌斜面和枯草芽孢杆菌斜面上各挑取少许菌苔同置于中间一水滴中，分别混匀并涂成薄膜。
2、干燥
室温自然干燥。
3、固定
涂面朝上，通过火焰2-3次。
4、初染
滴加结晶紫液，以刚好将菌膜覆盖为宜，染色1-2min，水洗。
5、煤染
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
6、脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇通过涂面脱色20-25s，直至流出液无色时，立即水洗。
7、复染
用番红液复染约2min，水洗，晾干或用吸水纸吸干。
8、镜检
镜检时先后用低倍镜、高倍镜和油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
菌体被染成深紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。
9、实验完毕后的处理
先用擦镜纸将油镜头上的油擦去，用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次，再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。
五、注意事项
1、载玻片要洁净无油迹；要用活跃生长期的幼培养物做革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
2、固定操作中，火焰不宜过热，以玻片不烫手为宜。
3、革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。
脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌；脱色时间一般为20-30s。
六、思考题
1、你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些细节？
2、为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？
3、如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎么样呢？
4、你认为要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪一步？为什么？
5、现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。
你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确？
6、你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。
7、进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老菌龄细菌染色时会出现什么问题？
8、革兰氏染色时初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？
9、你认为Hucker 改良的革兰氏染色法中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？
胰蛋白酶比活性的测定
一、实验目的
1、学习考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理及操作方法
2、了解考马斯亮蓝法在蛋白质含量测定中的重要性
3、学习并掌握分光光度计的基本技术和操作方法
4、掌握酶活性单位及比活性的计算方法
二、实验原理
考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax）由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，在595nm 下测定的吸光度值A595nm，与蛋白质浓度成正比，据此可以测定出样品中的蛋白质含量。
胰蛋白酶能专一地催化碱性氨基酸中-COOH参与形成的肽键水解，同时也能水解碱性氨基酸所参与构成的酯键。
本法采用人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzoyl-L-arginine-ethyl ester，BAEE）为底物，该化合物在253nm波长处紫外吸收强度很低，但在胰蛋白酶作用下，水解生成N-苯甲酰-L-精氨酸（N-benzoyl-L-arginine，BA），该产物A253nm很大。
反应体系中，随着BA的增多，A253nm随之增加，据此建立测定胰蛋白酶活性的方法。
胰蛋白酶活性单位定义为：在本实验室条件下，引起每分钟A253nm增加0.001的酶量，定为1 BAEE单位。
三、实验器材
1、设备：分光光度计（75
2、752N、UVmini-1240）、旋涡混合器（QL-901）、微量移液器（自备1000微升、200微升、10微升）
2、材料：试管、试管架、玻璃比色皿、石英比色皿、记号笔、坐标纸、枪头（10-1000微升）、5mL移液管、吸耳球、擦镜纸、滤纸、洗瓶、烧杯
3、试剂：胰蛋白酶样品、考马斯亮蓝试剂、标准蛋白质溶液、0.05mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲溶液、0.001mol/L HCl溶液、2mmol/L BAEE
四、实验步骤
（一）胰蛋白酶质量浓度的测定
1、标准曲线的绘制
（1）取9支试管，1支作空白，6支作标准曲线，2支留作测胰蛋白酶样品，分别标记为1-9号。
按照表1所示顺序加入各试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合均匀，第8、9管为胰蛋白酶样品的加样量。
表1 考马斯亮蓝法测蛋白质含量程序表
管号
123456789标准蛋白(1.0mg/ml)/ml 00.010.020.040.060.080.100.050.1蒸馏水/ml 0.10.090.080.060.040.020.00.050.0考马斯亮蓝试剂/ml
5.0
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（2）加完各试剂2~5min 后，即可开始用比色皿在752或752N 分光光度计上测定各样品在595nm 处的光吸收值A 595nm ，空白对照为第1号试管。
（3）以标准蛋白含量（mg ）为横坐标，吸光度值A 595nm 为纵坐标，绘制标准曲线。
根据测出的未知样品的A 595值，即可计算出待测胰蛋白酶样品的蛋白质含量，计算胰蛋白酶的蛋白质浓度。
（二）胰蛋白酶比活性的测定
1、取两支试管，分别标号为1、2，按照表2顺序加入各相关试剂。
表2 胰蛋白酶活性测定加样程序试剂/mL
空白组测定组0.05 mol/L ，pH 7.8 Tris-HCl 缓冲溶液
1 g/L 待测胰蛋白酶0.001 mol/L HCl 溶液
2 mmol/L BAEE
总体积
1.5—0.21.53.2
1.50.10.11.53.2
2、以空白组校正A 253nm 值至0，测定组中加入底物液BAEE 后，立即混合均匀，用比色皿在UVmini-1240分光光度计上测定光吸收值A 253nm ，同时记录时间。
3、每间隔1min 读取A 253nm 值一次，至5min 终止读数。
4、计算每分钟平均A 253nm 增加值即△A 253nm 值/min 。
5、按照下列公式计算胰蛋白酶活性单位数及比活性：胰蛋白酶活性单位数/BAEE=
001
.0min
A 253nm
胰蛋白酶比活性/BAE E·mg -1=)
(/g mL mL m 加入酶体积）胰蛋白酶质量浓度（稀释倍数
胰蛋白酶活性单位⨯⨯6、实验完毕后的处理
先把比色皿刷洗干净，倒扣放好；洗刷试管、移液管、烧杯等器皿刷洗干净，放好。
五、注意事项
1、不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。
2、混合操作中，混合震荡不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。
六、思考题
1、相比于Folin 酚法测定蛋白含量，考马斯亮蓝法有哪些优、缺点？
2、用考马斯亮蓝法G-250测定蛋白质含量有何特点，操作过程中应注意什么？
3、稀释的酶溶液是否可以长期使用？说明原因
4、如何保证本实验测定数据的准确性？。