SDS-PAGE蛋白电泳检测标准操作规程(非还原&还原)
SDS-PAGE操作方法
SDS-PAGE操作方法
SDS-PAGE教程
1 SDS-PAGE原理
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4 g去污剂结合。当分子量在15 KDa 到200 KDa之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：log MW = K –bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE [Laemmli法]
这种方法帖出来，大家是不是感觉非常的陌生呢？其实这种发方法很普遍，现在大部分的实验室都是用Laemmli法跑电泳的。如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Laemmli于1970年发表在nature 上的一篇文章中的方法，这篇文章很特别,不仅被引用的次数较多，而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题，而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已，所以阐述如何操作的文字只有那么一小段（但相当经典），这是SDS-PAGE（不连续系统）的首次成功应用。现在我们在实验室进行的SDS-PAGE 试剂的配方仍然是沿用了它的数据,许多论文在描述其SDS-PAGE时引用Laemmli方法，目前常用的具有浓缩胶和分离胶的不连续SDS-PAGE的基础的确来自Laemmli方法，但也略有差别例如一些缓冲液的具体组成。你也许会恍然大悟：原来我们用的就是Laemmli！
SDS-PAGE--非还原性(non-reduced)和还原性等
1. ＳＤＳ主要的作用有４:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠.所以不能断开二硫键.
ＤＴＴ：还原剂，可以断开二硫键.有些蛋白天然活性结构是二聚体或三聚体，如果加入β－巯基乙醇，它会还原多聚蛋白之间和内部的二硫键，这样，电泳的样品将会被完全还原成单体形式，不加的样品中则会保持聚体的形式，这时候样品在凝胶中的位置就会处于其2倍或3倍分子量的位置了.
2。 SDS-PAGE有非还原性（non-reduced）SDS—PAGE和还原性（reduced）SDS—PAGE之分，均是变性条件下的电泳。还原与非还原的区别是在样品处理时加或不加还原剂（如DTT或2-巯基乙醇等）.
非变性（non—denaturing）PAGE又称为天然（native)PAGE,操作的基本过程与SDS-PAGE相似，唯一不同的是在实验过程中尽可能保持蛋白质的天然完整性,包括避免使用任何还原剂、缓冲液中避免使用变性剂（如SDS）、样品的预处理以及电泳过程应在低温下进行等。
3。我现在经过多方面咨询,问了几个海龟和公司的技术顾问，已经搞明白了，就是这个抗体针对的位点含有二硫键，所以所有的western试剂中都不能含有还原剂（如DTT，巯基乙醇等，包括裂解液和上样缓冲液,有些裂解液如果是买公司的，可能公司会加入还原剂）。因为还原剂会打开二硫键而变成巯基。所以抗体就不识别了。
蛋白的样品处理方法有3种：还原SDS处理，带有烷基化作用的SDS处理，非还原SDS处理.
还原SDS处理：是常规的SDS—PAGE，在上样缓冲液中加入还原剂，DTT等，打开二硫键,SDS打开非共价键，所以使蛋白还原变性为椭圆形单体。
SDS-PAGE原理(下)凝胶电泳原理,蛋白质测定方法
SDS-PAGE蛋白电泳上样缓冲液
增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的 甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。 上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔 中扩散出来到电泳缓冲液中。 指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。
电泳槽
SDS-PAGE蛋白电泳上样缓冲液
蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE lБайду номын сангаасading buffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的 SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。
本产品分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的 链内二硫键和链间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，在电泳凝胶 上显现多个蛋白条带，选购和使用时请务必注明，仔细区分。
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）
测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红 色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在 595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白 质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡， 完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建 立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍， 可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用 的微量蛋白质快速测定方法。
SDS-PAGE蛋白电泳检测标准操作规程（非还原还原）
SDS-PAGE蛋白电泳检测标准操作规程（非还原还原）
GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICE
SDS-PAGE蛋白电泳检测标准操作规程（还原&非还原）编号：SDS-PAGE蛋白电泳检测
起草人：部门审核：QA审核：替代：□新订：□日期：日期：日期：修订号：0
批准：年月日生效日期：年月日
文件分发部门：
GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICE
SDS-PAGE蛋白电泳检测编号：
SDS-PAGE蛋白电泳检测
一目的
保证产品电泳电泳分子量和纯度检测按规范进行和检定结果的准确可靠。
二范围
用于规范电泳电泳分子量和纯度的测定。
三责任
质量控制部人员。
四内容
1试剂与水：
所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
2 溶液的配制
2.1A液：1.5MTris·HCl pH8.8
称取90.75gTris碱(分析纯)加适量的超纯水（约400ml）溶解,用6M盐酸调pH值至8.8,加超纯水定容至500 ml。贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。
6M盐酸（调pH用）：浓盐酸50ml，加50ml纯化水，混匀。
2.2、B液: 0.5MTris·HCl pH6.8
称取60.5gTris碱(分析纯)加适量的超纯水（约400ml）溶解,用
6M盐酸调pH值至6.8,加超纯水定容至1000 ml。贴上标贴，室温储存。
2.3C液: 30%丙烯酰胺-0.8%N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶液
称取300g丙烯酰胺(分析纯),8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解(一般500ml，因为丙烯酰胺具有溶胀性的特点),再定容至1000 ml,用滤纸过滤。贴上标贴，避光4℃保存。
SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE电泳
实验材料
所用试剂均需分析纯。
1.1 超纯水
电阻率应不低于13
1.2 A液（0.3 %十二烷基磺酸钠，SDS; 3.0Mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸 Tris-Hcl,PH8.45）
称取18.15gTris加适量超纯水溶解，用盐酸调PH值至8.8，加超纯水定容至100ml。
1.3 B液（30%丙烯酰胺/N，N’-甲叉丙烯酰胺）
称取29g丙烯酰胺1.0gN，N’-甲叉丙烯酰胺，加超纯水溶解至100ml，待其完全溶解后用滤纸过滤。避光保存。
1.4 C液（10%十二烷基磺酸钠，SDS）
称取1g十二烷基磺酸钠，加超纯水溶解至10ml ，室温保存。
1.5 D液（四甲基已二胺）
1.6 E液（10%过硫酸铵）
称取100mg过硫酸铵，加超纯水溶解至1ml。
1.7 F液（1.0Mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-Hcl,PH6.8）
称取12.1gTris加适量超纯水溶解，用盐酸调PH值至6.8，加超纯水定容至100ml。
1.8 电极缓冲
称取3.02gTris，18.8gGlycine,1.0gSDS加适量的超纯水溶解，用盐
酸调PH值至8.3，加超纯水定容至1000ml。
1.9 样品缓冲液（2 X SDS）
称取0.12g Tris(PH6.8),0.4g SDS,0.01g溴酚蓝，1ml 甘油，加超纯水溶解定容至10ml（用于非还原SDS-PAGE。如用于还原SDS-PAGE，则再加0.5Mβ-巯基乙醇）
1.10 蛋白质标准，待检样品的分子量应包括在使用的分子量标准范围之内。
SDS-PAGE电泳注意事项
SDS-PAGE电泳的操作规程
一、样品处理
取适量体积的样品溶液（样品含约为0.5-5ug），加入5×样品缓冲液，用振荡器混匀，于95℃水浴中煮5分钟，并于离心机中12000r/min离心5分钟待上样用，煮完后室温冷却。非还原不用煮。
二、配制凝胶溶液和灌胶
A、预先计算好所需浓度胶的体积及配胶所需要的各种试剂的体积，按这些数据依次加
入试剂并混匀，然后灌入预先装好并且用双蒸水试漏过的板层中（先是分离胶），
在胶的上面加一小层水饱和的异丁醇，置于平整的桌面让其自然凝固。
B、待分离胶凝固后（以胶与异丁醇界面有折射为准），到掉上层的异丁醇，用双蒸水
冲洗三次并用吸水纸吸干。然后灌入预定浓度的、按步骤A配制的浓缩胶，插入加
样梳（注意赶走气泡），平置于水平桌面，自然凝固。
C、待凝固后，放置1小时使胶充分交联凝固。
三、电泳
1、拔掉梳子，用双蒸水冲洗加样孔，去除杂质及未凝固的胶溶液，然后装好电泳装置，
加入电泳缓冲液（如阴阳极缓冲液不同，需要分别加入相应的缓冲液，另外，阴阳极电泳缓冲液不要混在一起）
2、用20ul的微量加样枪上样。
3、电泳开始时，恒压模式下用80V的电压电泳，待指示剂溴酚蓝进入分离胶时，把
电压提高到130-150V左右，直到溴酚蓝快走出分离胶时，终止电泳，切断电源，拆下凝胶分别切下上、下角标记胶的方向及区别是哪一块胶。
4、清洗胶架、玻璃及其他附件。
四、染色、脱色及结果的分析与保存
1、把剥下的胶浸入染色液中，放在脱色摇床上摇1小时。
2、取出凝胶块，用蒸馏水冲洗干净，然后置于脱色液中脱色，摇荡脱色直到底色基本
电泳纯度(非还原型SDS-PAGE)测定标准操作规程
细胞因子电泳纯度（非还原型SDS-PAGE）测定标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。
范围：适用于细胞因子纯度的检测。
目的：检测细胞因子蛋白质纯度。
原理：蛋白质具有不同的电荷和分子量，在经过阴离子去污剂SDS处理后，蛋白质分子上的电荷被中和，在聚丙稀酰胺凝胶电泳时，不同的蛋白质按照其分子量大小进行分布，电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量。由于不连续的PH梯度作用，样品被压缩成一条狭窄区带，采用染色液染色，经扫描仪扫描胶片可及时观察结果。
内容：
1 材料
1．1样品：经二人复核批号无误后检测
1．2试剂
甲醇 CH
3
OH 分析纯
无水乙醇 CH
3CH
2
OH 分析纯
浓盐酸 HCl 分析纯
甘油 C
3H
8
O
3
分析纯
硝酸银 AgNO
3
分析纯
重铬酸钾 K
2Cr
2
O
7
分析纯
正丁醇 C
4H
9
OH 分析纯
甲醛 HCHO 分析纯
丙烯酰胺 CH
2CHCONH
2
分析纯
甲叉双丙烯酰胺（CH
2CHCONH
2
）
2
CH
2
分析纯
过硫酸铵（NH
4）
2
S
2
O
8
分析纯
TEMED（四甲基乙二胺）(CH
3)
2
N(CH
2
)
2
N(CH
3
)
2
分析纯
甘氨酸 C
2H
5
NO
2
分析纯
SDS（十二烷基硫酸钠）C
12H
25
O
4
SNa 分析纯
乙酸 CH
3
COOH 分析纯
碳酸钠 Na
2CO
3
分析纯
溴酚蓝 C
19H
10
Br
4
O
5
S 分析纯
1．3注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。
1．4设备
1．4．1扭力天平上海第二天平仪器厂
1．4．2垂直板状电泳槽北京东方仪器厂
1．4．3恒温恒流电泳仪法玛西亚公司
1．4．4快速电泳槽BIORAD USA
SDS-PAGE电泳的标准操作规程
SDS-PAGE电泳的标准操作规程（编号：039）
1、目的及适用范围
SDS-PAGE电泳的分离原理，是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷，消除了蛋白分子的电荷效应，使蛋白按分子大小分离，主要用于蛋白质分子量的测定、蛋白质混合组分的分离和蛋白质亚基组分的分析等方面。
2、主要仪器
恒压或恒流电源、垂直板、制胶模具
3、试剂及配制方法
试剂配制方法或要求
H2O 电阻率不低于18.2 MΩ.cm
1.5 M Tris-HCl 1.5 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.8
30% Acrylamide 30% 丙烯酰胺溶液（避光保存）
10% SDS 10% SDS溶液
10% APS 10% 过硫酸铵溶液（临用前配制）
TEMED TEMED溶液
1 M Tris-HCl 1 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.8
15.1
g、甘氨酸94 g、SDS 5 g，水稀释至1 L，pH 8.3
5×电极缓冲液 Tris
2×Loading buffer 100 mM Tris-HCl（pH6.8）、4% SDS、0.2% 溴酚蓝、20% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加2% β-巯基乙醇
5×Loading buffer 250 mM Tris-HCl（pH6.8）、10% SDS、0.5% 溴酚蓝、50% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加5% β-巯基乙醇
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
（三）凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白
质的电荷密度，只取决于分子解聚后 SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓 度的选择会直接影响分辨率。
不同分子量范围的蛋白质应选用不 同的凝Fra Baidu bibliotek浓度
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-PAGE
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
一、什么是SDS
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
三、方法 1、分类 （1）根据对样品的处理方式的不同
还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
1、SDS
阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
蛋白质的SDS—PAGE电泳
4 “纹理”现象 样品中的不溶性颗粒引起的
解决办法： ➢增加溶解度 ➢离心除去不溶性颗粒
5 偏斜现象 电极放置不平行或加样位置偏斜 引起
6 带太宽 加样量太多或者加样孔泄露引起
THANK YOU !
蛋白质的SDS—PAGE电泳
目录
1
发展历史，分类
2
样品处理 PAGE胶
3
电泳原理
4
电泳中的不正常现象
发展历史
1. 1967年由Shapiro建立 2. 1969年由Weber和Osborn进一步
完善 3. 目前已成为分子生物学实验中常用
的一项技术
分类
根据缓冲体系和凝胶孔径的不同： ➢连续电泳 ➢不连续电泳
电泳过程中的不正常现象
1 “微笑”现象 指示剂前言呈现两边向上的曲线形，说明 凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好
2 皱眉现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当明胶 和玻璃板组成的“三明治底部有气泡”或靠近隔片的 凝胶聚合不完全
3 “拖尾”现象 样品溶解不佳引起
解决办法：
➢加样前离心 ➢选择合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液 ➢加增溶试剂 ➢降低凝胶浓度
样品
样品缓冲液应包含以下部分：
➢ SDS（十二烷基磺酸钠） ➢ β—巯基乙醇（BME） ➢ 溴酚蓝 ➢ 丙三醇 ➢ pH =6.8Tris-glycine
sds page凝胶电泳步骤
sds page凝胶电泳步骤
以SDS-PAGE凝胶电泳步骤为标题的文章
SDS-PAGE凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和测量方法，其步骤包括蛋白质样品的制备、样品加载、电泳运行、染色和图像分析等。本文将详细介绍SDS-PAGE凝胶电泳的步骤及相关注意事项。
一、蛋白质样品的制备
准备要分离的蛋白质样品，并将其加入样品缓冲液中，以使蛋白质溶解并保持其天然构象。样品缓冲液通常包含Tris-HCl缓冲液、甘油、SDS和β-巯基乙醇等成分，用于维持样品的pH值和还原环境，使蛋白质完全展开。
二、样品加载
将制备好的蛋白质样品加载到凝胶孔中。通常使用微量吸管或微量注射器将样品缓冲液缓慢地注入凝胶孔中，确保样品完全进入凝胶中。
三、电泳运行
将已加载样品的凝胶板放置在电泳槽中，确保凝胶完全浸泡在电泳缓冲液中。然后将电泳槽连接到电源，并设置合适的电压和电流参数。根据需要，可以选择常规电泳或快速电泳。
在电泳过程中，蛋白质样品会在凝胶中被电场推动，根据其分子大小和电荷不同，被分离成不同的带状条带。较小的蛋白质分子迁移
速度较快，而较大的蛋白质分子迁移速度较慢。
四、染色
电泳结束后，需要对凝胶进行染色以可视化蛋白质带状条带。常用的染色方法有银染色和Coomassie蓝染色。银染色对蛋白质敏感性高，但操作繁琐；而Coomassie蓝染色操作简单，但对蛋白质敏感性相对较低。
五、图像分析
通过使用分析软件或图像扫描仪，将染色后的凝胶图像数字化，并进行分析。可以测量蛋白质带状条带的相对迁移距离和相对强度，进而确定蛋白质的分子大小和相对丰度。
蛋白质sdspage电泳实验报告
蛋白质sdspage电泳实验报告
蛋白质SDS-PAGE电泳实验报告
引言
蛋白质是生物体内重要的分子，对于细胞的结构和功能起着至关重要的作用。因此，研究蛋白质的性质和功能对于理解生物学过程具有重要意义。SDS-PAGE 电泳是一种常用的蛋白质分析技术，通过该技术可以对蛋白质进行定性和定量分析。本实验旨在通过SDS-PAGE电泳技术对不同来源的蛋白质进行分析，以了解其分子量和纯度。
材料与方法
1. 样品制备：从不同来源（如细胞培养液、组织样本等）提取蛋白质样品；
2. 样品处理：加入SDS蛋白变性剂和还原剂，使蛋白质变性和解聚；
3. 准备SDS-PAGE凝胶：制备上、下电泳缓冲液和聚丙烯酰胺凝胶；
4. 样品加载：将处理后的蛋白质样品加载到凝胶孔中；
5. 电泳分离：在电场作用下，蛋白质根据其分子量在凝胶中进行分离；
6. 凝胶染色：用共染色剂染色，观察蛋白质条带。
结果与讨论
通过SDS-PAGE电泳实验，我们成功地分离出了不同来源的蛋白质，并观察到了它们在凝胶上的分布情况。根据蛋白质的迁移速度和分子量标准曲线，我们得到了不同蛋白质的分子量，并计算出了它们的相对含量。通过比较不同来源蛋白质的电泳图谱，我们发现了它们的差异和相似之处，为进一步研究蛋白质的功能和特性提供了重要的参考。
结论
本实验通过SDS-PAGE电泳技术成功地对不同来源的蛋白质进行了分析，得到了它们的分子量和纯度信息。这为我们深入了解蛋白质的结构和功能提供了重要的数据支持，也为后续的蛋白质研究奠定了基础。通过不断改进实验方法和技术手段，我们相信SDS-PAGE电泳技术将在蛋白质研究领域发挥更加重要的作用。
SDS-PAGE-蛋白电泳分析
SDS－PAGE 蛋白电泳分析
一、目的
掌握SDS-PAGE 电泳原理与方法
二、电泳原理
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。
三、试剂配制
1．30% 丙烯酰胺：将29g 丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml 的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用过滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温(丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。2．1M Tris-Cl: 称取12.191g Tris 碱溶于80ml 蒸馏水中，用浓HCl 调到所需pH 值，定容至100ml。
SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳
SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳
第一部知识准备
一、双向凝胶电泳
蛋白质组分析的先决条件是蛋白质的分离。分离过程一般可以分为2步，首先将蛋白质消化成肽段，通常由蛋白水解酶完成，然后将复杂的混合物分离成简单地形式。这2步没有明确的先后关系，也可先将蛋白质混合体分离成单个的蛋白质或肽段，然后消化分析。双向凝胶电泳是采取的先分离后消化的方法，是目前唯一可以在一块凝胶上同时分离数千乃至数万个蛋白质的方法，是当今蛋白质组学方法的主流。刚刚兴起的非胶系统蛋白质组学是先消化然后直接质谱分析，充分应用生物信息学方法，是蛋白质组学分离方法的一个发展方向。
(一)双向电泳简介
双向电泳技术建立于20世纪70年代，它的基本原理是首先根据蛋白质等电点的不同在pH梯度介质中等电聚焦（isoelectrofocusing,IEF）将其分离，然后按照其分子量大小在垂直或水平方向进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-APGE）进行分离。
目前，根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，可将双向凝胶电泳分为三种系统：载体两性电解质pH梯度-SDS电泳技术（ISO-DALT）、不平衡的pH梯度凝胶电泳（NEPHGE）、固相pH梯度-SDS电泳技术（IPG-DALT）。在ISO-DALT系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶中进行，载体两性电解质在外加电场作用下形成pH梯度。其主要缺点是在碱性区域不稳定（阴极漂移）、重复性不易掌握和上样量低，并且一般不能分离等电点大于8.0的碱性蛋白质；优点是电泳设备要求不高，电泳溶液容易配制，易于展开工作。各种电泳条件经优化后，可达到非常高的分辨率，也可获得好的重复性，利用这一系统可以分辨10000个蛋白质斑点。NEPHGE为非平衡pH梯度电泳，是IPG胶发明之前用于分离碱性蛋白质的一种方法，蛋白质在等电点等电聚焦场中大道平衡前结束电泳，第一向的pH也是依靠载体两性电解质和电场来建立。在IPG-DALT是现在主要和常用的方法，它的优势表现在：pH梯度稳定、梯度分辨率高；无阴极漂移及碱性蛋白质丢失现象；蛋白质上样量大，可以提高低丰度蛋白质成分的分辨效果；样品中盐的干扰少，无边缘效应；pH梯度和分离效果的重复性好。
非变性非还原蛋白凝胶电泳
非变性非还原蛋白凝胶电泳
A: Loading buffer for gel:
From Dr. Chen Q. (6X)
Glycerol 20%
Bromophenol blue small bit (0.1%) 0.2%
Do not boil the samples!
C: SDS-PAGE Stacker Gel
D: SDS Running buffer for 1 liter (10X)pH 8.3
Tris 30 g
Glycine 188 g
SDS 10 g
Bring up to 1 L with dH2O
Dilute to 1x with dH2O when used.
E: PAGE Program
(1)Assemble the gel kit
(2)Pour the separating gel mixture between the plates ( about 2/3 of the way up) and overlay
with water or isobutanol (better than water，异丁醇)(异丙醇也可)
(3)Leave to set and then wash off the water
(4)Pour on the stacking gel mix and insert the comb then leave to set
(5)Transfer to the running apparatus and pour in the running buffer
2010药典-SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（药典附录22）
大多数蛋白质与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带电荷的负电荷远远超过天然蛋白质的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
仪器：恒压或恒流电源，垂直板或圆盘电泳槽和制胶模具。
试剂：（1）水（电阻率不能低于18.2MΩ.cm）。
（2）A液 1.5mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调pH值至8.8，加水稀释至100ml。
（3）B液30%丙烯酰胺-0.8% N,N`-亚甲基双丙烯酰胺溶液（避光保存）。
（4）C液1%十二烷基硫酸钠溶液。
（5）D液10%N,N,N’,N`-四甲基乙二胺溶液。
（6）E液10%过硫酸铵溶液，临用前配置。
（7）F液0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲烷6.05g 加适量水溶解，用盐酸调pH至6.8加水稀释至100ml。
（8）电极缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷3g、甘氨酸14.4g、十二烷基硫酸钠1g，加适量水溶解，用盐酸调节pH至8.3，加水稀释至1000ml。
（9）供试品缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷0.303g，溴酚蓝2mg、十二烷基硫酸钠0.8g，量取盐酸0.189ml、甘油4ml，加水溶解并稀释至10ml，此溶液适用于非还原性SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，如用于还原型的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，则再加β-巯基乙醇2ml。
（10）分子量标准供试品的分子量应包括在使用的分子量标准范围之内。
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GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICE
SDS-PAGE蛋白电泳检测标准操作规程（还原&非还原）编号：
SDS-PAGE蛋白电泳检测
起草人：部门审核：QA审核：替代：□新订：□日期：日期：日期：修订号：0
批准：年月日生效日期：年月日
文件分发部门：
GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICE
SDS-PAGE蛋白电泳检测编号：
SDS-PAGE蛋白电泳检测
一目的
保证产品电泳电泳分子量和纯度检测按规范进行和检定结果的准确可靠。
二范围
用于规范电泳电泳分子量和纯度的测定。
三责任
质量控制部人员。
四内容
1试剂与水：
所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
2 溶液的配制
2.1A液：1.5MTris·HCl pH8.8
称取90.75gTris碱(分析纯)加适量的超纯水（约400ml）溶解,用6M盐酸调pH值至8.8,加超纯水定容至500 ml。贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。
6M盐酸（调pH用）：浓盐酸50ml，加50ml纯化水，混匀。
2.2、B液: 0.5MTris·HCl pH6.8
称取60.5gTris碱(分析纯)加适量的超纯水（约400ml）溶解,用6M盐酸调pH值至6.8,加超纯水定容至1000 ml。贴上标贴，室温储存。
2.3C液: 30%丙烯酰胺-0.8%N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶液
称取300g丙烯酰胺(分析纯),8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解(一般500ml，因为丙烯酰胺具有溶胀性的特点),再定容至1000 ml,用滤纸过滤。贴上标贴，避光4℃保存。
2.4D液:1%SDS
称取2gSDS(分析纯),用超纯水溶解至200 ml.贴上标贴，4℃保存。
2.5E液:10%过硫酸铵
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SDS-PAGE蛋白电泳检测编号：
称取10g过硫酸铵(分析纯)，用超纯水溶解至100 ml，以1ml/支分装，贴上标贴，－20℃保存。
2.6 4%碳酸钠溶液：称取20g无水碳酸钠, 加水450ml, 搅拌，使完全溶解，并定容至500ml。贴上标贴，室温储存。此溶液有效期为三个月。
2.7F液:TEMED(市售)
2.8电泳缓冲液(5X)
称取75g Tris碱(分析纯)，360g甘氨酸(分析纯)，25gSDS(分析纯)，加超纯水溶解，调pH至8.3，定容至5L，贴上标贴，室温储存。临用前加超纯水稀释5倍使用。
2.9、样品缓冲液
2.9.1 4X样品缓冲液（还原性）
称Tris3.03g，溴酚蓝20mg，SDS 8g，盐酸1.89ml，甘油40ml，加超纯水溶解定容至100ml，再加20ml巯基乙醇（分析纯）贴上标贴，室温储存。
2.9.2 4X样品缓冲液（非还原性）
称Tris3.03g，溴酚蓝20mg，SDS 8g，盐酸1.89ml，甘油40ml，加超纯水溶解定容至100ml，贴上标贴，室温储存。
2.10 银染试剂（注：银染试剂配制所使用的超纯水均为两次过滤的无热源水）
2.10.1 固定液：量取500ml甲醇(分析纯)，120ml冰醋酸(分析纯)，加超纯水至1000 ml, 贴上标贴，室温储存。
2.10.2 漂洗液：量取乙醇100ml（分析纯），500ml冰醋酸（分析纯），加超纯水至1000ml，室温储存。
2.10.3 辅染液：称取重铬酸钾10g，量取硝酸2ml，加适量水溶解并稀释至200 ml，用前40倍稀释。贴上标贴，室温储存。
2.10.4 银染液：现配现用。称取2.04g硝酸银，加超纯水溶解定容至1000ml。
2.10.5 显影液：称取30g碳酸钠(分析纯)，加超纯水溶解定容至1000ml, 贴上标贴，室温储存。
2.10.6 终止液：10ml冰醋酸，加水稀释至1000ml。
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SDS-PAGE蛋白电泳检测编号：
2.11 考马氏亮蓝染色试剂
2.11.1 考马氏亮蓝染色液：称取1g考马氏亮蓝R-250(分析纯)，200ml甲醇(分析纯)，50ml冰醋酸(分析纯)，加超纯水溶解定容至500ml，搅拌4h，滤纸过滤，贴上标贴，室温储存。（见溶液配制记录）染色液需回收利用，使用周期依染色效果定。
2.11.2 考马氏亮蓝脱色液：量取400ml的甲醇，100ml冰醋酸(分析纯)，加超纯水溶解至1L，贴上标贴，室温储存。
脱色液使用后回收至装有活性炭的瓶中，滤过后可重复利用，使用周期依脱色效果定。
3 器皿与耗品：
所有玻璃器皿为清洁级；tube、tip一次性使用；微波炉盒。
4 仪器设备：
电泳仪电源（200--600V）；电泳槽；灌胶模具；染色具；脱色摇床；微波炉；
凝胶成像仪。
5 环境要求：
相对洁净环境，室温。
6 标准品（or 对照品）：
标准品：市售分子量标准蛋白，按说明书分装后-20℃保存。《标准品分装与使用记录》
6.1 标准品验证
6.1.1 标准品按说明书分装，储存，对标准品进行SDS-PAGE电泳；分装要填写分装记录《电泳标准品制备及检定》。
6.1.2 相对迁移率Rf =蛋白带迁移距离/溴酚兰迁移距离；
6.1.3 用每个蛋白标准分子量的对数(纵坐标)对它的相对迁移率(横坐标)作图,得一条直线,两者线性关系>0.98,方可用作电泳分子量测定。
7操作步骤：
7.1制胶