催产素体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化

2011年11月第31卷第11期基础医学与临床Basic ＆Clinical Medicine November 2011Vol．31No．11收稿日期：2011－05－06修回日期：2011－09－23*通信作者（corresponding author ）：zhanglei@hebmu．edu．cn文章编号：1001-6325（2011）11-1273-05研究论文催产素体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化王海萍1，张雷2*，王浩宇1，吕洋1，陈炜2，邵素霞2（1．河北北方学院组织学与胚胎学教研室，张家口075000；2．河北医科大学组织学与胚胎学教研室，石家庄050017）摘要：目的探索催产素（OT ）体外诱导骨髓间充质干细胞（MSCs ）向心肌细胞分化的可行性。

方法取SD 大鼠四肢骨骨髓，分离培养MSCs ，应用OT 定向诱导，相差显微镜观察细胞形态学变化，应用免疫细胞化学、激光扫描共聚焦显微镜技术检测结蛋白，α-横纹肌肌动蛋白、心肌特异性肌钙蛋白T 的表达；以半定量RT-PCR 方法在诱导后7、21和28d 检测细胞心肌早期转录因子GATA-4和心肌特异性肌凝蛋白重链α-MHC 的表达。

结果体外分离培养的细胞生长稳定，增殖较快，主要为纺锤形和成纤维细胞状。

诱导后1周，细胞以梭形、柱状为主，部分细胞有分支，核卵圆形、居中，类似心肌细胞形态，排列方向渐趋一致。

诱导后4周，细胞形态变长、增大，多呈杆状，紧密平行排列生长。

分化后细胞结蛋白、α-横纹肌肌动蛋白和肌钙蛋白T 均呈现阳性表达。

激光共聚焦扫描显微镜观察：可见细胞质内结蛋白的表达呈红色，肌钙蛋白T 的表达呈绿色，当两者同时被观察时可见其共表达的部位变成黄色。

RT-PCR 结果显示，GATA-4于诱导后7d 弱表达，21d 表达增强，28d 表达减弱。

α-MHC 在诱导后7d 不表达，21d 弱表达，28d 表达明显。

结论骨髓间充质干细胞在OT 诱导下可定向分化为心肌样细胞。

关键词：骨髓间充质干细胞；催产素；心肌细胞；细胞分化；大鼠中图分类号：R 331.31文献标志码：AOxytocin induces rat bone marrow mesenchymal stem cells differentiateinto cardiomyocyte-like cells in vitroWANG Hai-ping 1，ZHANG Lei 2*，WANG Hao-yu 1，L Yang 1，CHEN Wei 2，SHAO Su-xia 2（1.Dept．of Histology and Embryology ，Hebei North University ，Zhangjiakou 075000；2.Dept．of Histology and Embryology ，Hebei Medical University ，Shijiazhuang 050017，China ）Abstract ：Objective To investigate the feasibility of inducing rat bone marrow mesenchymal stem cells （MSCs ）differentiating into cardiomyocytes by oxytocin （OT ）．MethodsSD rat MSCs were isolated from rat bone marrowand cultured ，then induced by OT for 72h．The laser scanning confocal microscope （LSCM ）was used to detect the expression of desmin ，α-sarcomeric actin and C-TnT．GATA-4and α-MHC expression were detected by RT-PCR．ResultsThe cultured cells grew stablely and proliferated faster ，mainly appeared to be fusiform and fibro-blastic morphology．After induced by OT for one week ，most cells became spindle-like and pillar-form with oval nu-clei in the center of cells and similar to cardiomyocytes．The direction of the cell arraying was identical gradually．After four weeks ，a majority of cells enlarged ，lengthened ，showed stick-like shape and paralleled closely．MSCs in-duced by OT could be identified by the positive staining for desmin ，α-sarcomeric actin and C-TnT．Laser scanning confocal microscopy indicated that desmin （α-sarcomeric actin ）appeared in red ，cTnT was green．When they were基础医学与临床Basic＆Clinical Medicine2011.31（11）both been showed，it changed to yellow．RT-PCR assessment showed that the differentiated cells began to express GATA-4from day7to day28of differentiation and began to expressα-MHC from day21to day28of differentia-tion．Conclusions MSCs can differentiate into cardiomyocytes in vitro after being induced by OT．Key words：marrow mesenchymal stem cells；Oxytocin；cardiomyocytes；differentiation；rat目前通过将各种干细胞来源的心肌细胞植入损伤的心肌以修复梗死的心肌组织，改善心脏功能，已成为治疗心肌梗死、预防心衰的一种替代疗法［1－2］。

骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）在适宜的心脏微环境中可以自发的分化为心肌细胞，是目前认为较有希望成为梗死心肌细胞替代治疗的干细胞。

催产素（oxytocin，OT）主要表达在下丘脑，是一种小分子肽，用于调节生殖功能。

近几年来，OT作为一种细胞生长和分化的诱导剂，其作用被人们重新认识。

Paquin［3］等人发现单独的OT可在第8天诱导出心搏细胞，表达心肌特异蛋白ANP和β-MHC，提示OT在心肌细胞分化和发育中的新作用。

本实验应用OT对MSCs做体外诱导，并从形态学、蛋白表达和基因表达等方面鉴定诱导分化的有效性，旨在探索体外MSCs诱导分化为心肌细胞的方法和条件，为MSCs体外扩增后移植治疗心肌梗死开辟新思路。

1材料与方法1.1实验动物和试剂健康SD大鼠（合格证号：908134），3周龄，体质量15 25g，雌雄不限，由河北医科大学动物实验中心提供。

IMDM培养基（Hyclone公司），胎牛血清（兰州民海公司），结蛋白（博士德公司），肌钙蛋白T（NeoMark公司），α-横纹肌肌动蛋白、OT（Sigma 公司）。

FITC标记的二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），CY3标记的三抗、Trizol试剂（Gibco BRL公司），α-MHC及GATA-4、β-actin引物（北京赛百盛基因生物公司）。

1.2方法1.2.1MSCs分离培养：用10%水合氯醛麻醉SD大鼠，75%乙醇浸泡5min，无菌条件下取四肢长骨，放入含有D-Hanks液/双抗（青霉素100U/mL，链霉素100mg/L）液中冲洗2次。

显露骨髓腔，用含10%胎牛血清的IMDM培养液将骨髓腔中的骨髓冲出后，经无菌滤膜过滤接种于培养瓶里，取出1滴细胞悬液加入10μL0.04%台盼蓝混匀，用血细胞计数板计数活细胞，调整细胞浓度为1ˑ1011/mL，置于37ħ、5% CO2的培养箱中培养。

24h后换液，此后每3天换液1次，贴壁细胞达90%汇合时用0.5%胰蛋白酶和0.04%EDTA（1ʒ1）消化，以1ʒ2接种传代。

1.2.2MSCs的诱导及继续培养：第2代细胞生长48h后加入OT，浓度为1ˑ10－7μmol/L，3d后去除诱导培养基，加入不含OT的培养基继续培养4周。

对照组在培养的过程中不加OT。

1.2.3MSCs诱导分化的免疫细胞化学检测：将诱导培养4周的细胞进行细胞爬片，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定，PBS冲洗，3%过氧化氢-甲醇室温10min，枸橼酸盐缓冲液微波炉修复40min，正常山羊血清室温下封闭10min，分别加结蛋白、α-横纹肌肌动蛋白、肌钙蛋白T单克隆抗体，4ħ过夜（加PBS作空白对照）；PBS冲洗，加生物素标记的二抗，室温孵育60min；PBS冲洗，链酶卵白素-过氧化物酶，室温孵60min；PBS冲洗，二氨基联苯胺（DAB）液显色，苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察，阳性结果为细胞质呈棕黄色。

1.2.4MSCs诱导分化的免疫荧光检测：将诱导培养4周的细胞进行爬片，4%多聚甲醛固定，3%过氧化氢-甲醇室温10min，枸橼酸盐缓冲液微波炉修复，正常山羊血清封闭，加结蛋白单克隆抗体，4ħ过夜，PBS冲洗，加生物素标记的二抗室温孵育60min，PBS冲洗，加CY3标记的三抗室温孵育60min，PBS冲洗，加肌钙蛋白T单克隆抗体4ħ过夜，PBS冲洗，加FITC标记的二抗室温孵育60min，PBS冲洗，甘油封片，Leica TCS-ST2激光扫描共聚焦显微镜观察。

1.2.5心肌样细胞转化率的计算：倒置相差显微镜高倍视野下（ˑ100），每孔随机取3个视野，分别计数每个视野内的细胞数（N）和阳性细胞数（Ni）。

计算大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的转化率（心肌样细胞的转化率=Ni/Nˑ100%）。