沙眼衣原体(CT)核酸定量检测标准操作规程(PCR-荧光探针法)

沙眼衣原体（CT）核酸定量检测标准操作规程（PCR－荧光探针法）

1.目的:规范沙眼衣原体（CT）核酸DNA（PCR－荧光探针法）检测操作流程，保证检测结果的准确性。

2.应用范围：沙眼衣原体（CT）荧光定量检测。

3.职责:

3.1 文件编写：实验室技术员。

3.2 文件审核：实验室主管。

3.3 文件审批：实验室主任。

3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。

4.参考文献：

4.1 中山大学达安基因股份有限公司沙眼衣原体（CT）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书。

4.2 中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册。

5. 内容：

5.1 检测方法：PCR-荧光探针法

5.2 实验原理：用一对沙眼衣原体特异性引物和一条沙眼衣原体特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而检测沙眼衣原体（CT）DNA。主要用于CT感染的辅助诊断及其疗效监测的标准。

5.3 性能参数：

5.3.1 检测下限：5.0×102基因拷贝/ml。

5.3.2 线性范围：5.0×102～5.0×108基因拷贝/ml

5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集

5.4.1 标本类型：泌尿生殖道分泌物等。

5.4.2 标本采集：

5.4.2.1 泌尿生殖道分泌物：

5.4.2.1.1 男性尿道分泌物：用细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无

菌管中，密封送检（采集分泌物前2小时禁小便）。

5.4.2.1.2 女性生殖道分泌物：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用宫颈刷或无菌棉拭子插入宫颈内，停5s后旋动宫颈刷或棉拭子采集宫颈分泌物，将宫颈刷或棉拭子置于无菌管中，密封送检。

5.4.2.1.3 女性尿道分泌物：用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌管中，密封送检。

5.4.3 标本保存：标本采集后保存于2～8℃。

5.4.4 运送条件：标本运送采用冰壶。

5.4.5 标本拒收标准：污染。

5.5 设备和试剂：

5.5.1 设备：DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。

5.5.2 试剂：

5.5.2.1 试剂品牌：中山大学达安基因股份有限公司沙眼衣原体（CT）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

5.5.2.2 试剂批准文号：国药准字3401388。

5.5.2.3 试剂组成：DNA提取液（500μL/管） 2管，PCR反应管（未贴标签）20管，阴性质控品（250μL/管）1管，临界阳性质控品（50μL/管）1管，强阳性质控品（50μL/管）1管。

5.5.2.4 试剂包装规格：单管单人份，20人份/盒。

5.5.2.5 试剂保存和有效期：保存于-20℃；有效期6个月。

5.6 操作过程：

5.6.1 提取DNA：

5.6.1.1 打开恒温水浴槽或加热器，设定温度 100℃。

5.6.1.2 从试剂盒中取出DNA提取液、阴性质控品和阳性质控品，让其在室温下完全融化。

5.6.1.3 泌尿生殖道分泌物棉拭子提取DNA：

5.6.1.3.1 向无菌管中加入1ml灭菌生理盐水，充分振荡混匀，挤干棉拭子，

5.6.1.3.2 吸取全部液体转至1.5ml 离心管中，12,000rpm离心5min，

5.6.1.3.3 去上清，向沉淀中加入50μL DNA提取液，充分混匀，100℃水浴10±1min。

5.6.1.3.4 12,000rpm离心5min，待用。

5.6.1.3.5 排版：根据样本数量编写《PCR实验室DA－7600取试剂、加样、扩增对照图面版表》，注意添加阴性质控，阳性质控。

5.6.1.4 加样：从-20℃冰箱取出CT-PCR反应管若干管转移至加样区，根据上机面板的位置放好后，直接加入处理好的样本DNA和阴性质控品、阳性质控品各5μL，2,500rpm 离心1 min。

5.6.1.5 DA7600的设置及结果分析：参见《达安7600荧光定量PCR仪操作、校准及保养规程》及《基因扩增检测及结果分析规程》。

5.6.1.6 记录实验数据。

5.7 参考值范围：＜5.0×102基因拷贝/ml

5.8 异常结果报告方式及处理流程：