荧光免疫技术 精品
免疫荧光技术PPT课件
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
免疫荧光技术课件PPT课件
蛋白质相互作用研究
总结词
免疫荧光技术可用于研究蛋白质之间的 相互作用，揭示生命活动的分子机制。
VS
详细描述
利用两种不同颜色的荧光标记抗体分别与 两种蛋白质结合，通过荧光共振能量转移 等技术，可以观察到两种蛋白质在空间上 的接近程度，从而推断它们之间的相互作 用。
药物筛选与开发
总结词
免疫荧光技术可用于药物筛选和开发过程中，评估药物对细胞或组织的影响。
多模态成像融合
将免疫荧光技术与光声成像、光学相干成像等其他成像技 术融合，实现多模态、多维度的生物分子成像，将有助于 更全面地了解生物样本的结构和功能。
临床应用转化
加强免疫荧光技术的临床应用研究，将其应用于疾病的早 期诊断、疗效评估和预后判断等领域，提高临床诊疗水平。
THANKS
感谢观看
研究和发展新的抗体和荧光标记技术，提高免疫荧光技术的灵敏度 和特异性，降低假阳性结果。
多标记检测
实现多标记免疫荧光技术，能够在同一样品上同时检测多种目标分 子，提高实验的信息量。
05
免疫荧光技术的应用实例
细胞内抗原定位
总结词
通过免疫荧光技术，可以精确定位细胞内的抗原，有助于研究细胞结构和功能。
详细描述
抗体
结合方式
荧光物质通过化学键与抗体结合，形 成荧光抗体，这种荧光抗体可以特异 性地结合抗原，形成抗原-抗体-荧光 抗体的复合物。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异性地结合抗原，形成抗原-抗 体复合物。
荧光信号的激发与检测
激发方式
荧光信号的激发通常采用特定波 长的光，如紫外光或蓝紫光，这 些光能够激发荧光物质发出可见
光。
检测设备
检测设备通常采用荧光显微镜， 能够检测到荧光信号并对其进行
关于荧光免疫技术详细介绍
关于荧光免疫技术详细介绍荧光免疫技术是一种基于抗体-抗原反应原理的分析方法，利用荧光染料标记的抗体或抗原与靶标结合后，通过测量荧光信号的强度来检测和定量分析靶标物质。
荧光免疫技术的原理主要包括标记物准备、信号检测和结果分析三个方面。
首先，需要将抗体或抗原与荧光染料标记结合，一般通过共价键合、生物素-链霉亲和素体系或其他化学反应进行标记。
标记物的选择应该满足荧光发射波长范围广、发射光强、稳定性好等要求。
然后，标记物与待检测样品中的靶标物质结合，形成抗原-抗体复合物。
最后，通过荧光检测仪器，测量荧光信号的强度，并将其转化为定量结果。
荧光免疫技术具有以下优势：首先，荧光信号强度大，可以实现高灵敏度的检测。
其次，荧光染料具有多样化的波长特性，可以实现多通道的同时测量。
此外，荧光免疫技术还具有选择性高、重复性好、灵敏度高、分析速度快、自动化程度高的特点。
荧光免疫技术在医学、生物学和环境监测等领域有广泛的应用。
在医学上，荧光免疫技术可以用于疾病的早期诊断和预防，如肿瘤标记物检测、感染病原体的检测和体液中特定蛋白质的定量等。
在生物学研究中，荧光免疫技术可以用于检测细胞和分子的定位、定量和相互作用等。
在环境监测中，荧光免疫技术可以用于检测污染物、重金属和有害物质等。
衡量荧光免疫技术的指标主要包括检测灵敏度、检测限、特异性、线性范围、准确性和重现性等。
检测灵敏度是指该技术能够检测到的最低浓度，一般以荧光信号的强度来表示。
检测限是指能够可靠地检测到的最低浓度，一般是指信号与噪声之间的差异。
特异性是指该技术与其他分子之间的交叉反应能力。
线性范围是指该技术在一定浓度范围内与浓度之间的线性关系。
准确性是指该技术的结果与真实值之间的接近程度。
重现性是指该技术在相同条件下的重复实验结果的一致度。
在实际应用中，荧光免疫技术还可以与其他技术相结合，如酶标记技术、化学发光技术等，以扩大分析范围和提高灵敏度。
同时，随着荧光探针和检测仪器的不断发展，荧光免疫技术将会不断创新和完善，为医学和生物科学研究提供更多的选择和便利。
医学免疫学荧光免疫技术资料
荧光(yíngguāng)抗体
• 荧光抗体(kàngtǐ)染色技术中常用的标记荧光物质
异硫氰酸荧光素 （FITC）
最大吸收 (xīshōu)波长
495nm
最大发射波长 525nm，黄绿色
四乙基罗丹明 （RB200）
570nm
595nm，红色
四甲基异硫氰酸罗丹明 （TRITC）
550nm
的荧光 • 非特异性荧光 • 背景荧光 • 洗涤不彻底，荧光抗体非特异性吸附
第九页，共18页。
荧光(yíngguāng)抗体染色法
• 技术类型 • 直接法 • 间接(jiàn jiē)法 • 补体结合法 • 双标记法
第十页，共18页。
• 原理(yuánlǐ)
直接(zhíjiē)法
荧光 荧光抗体
待测标本
第三页，共18页。
基质(jī zhì)片
• 将标本固定在玻片上而形成，含有已知或待测抗原 • 根据标本来源不同可分为 • 组织印片、组织切片(qiē piàn)、细胞涂片、细菌涂片 • 制备好的基质片应尽快染色或置－20℃保存
第四页，共18页。
荧光(yíngguāng)抗体
• 用化学的方法将荧光物质共价连接在抗体上而形成 • 荧光的基本知识 • 自然界某些物质能从外界吸收(xīshōu)能量（光能、化学能），
基本概念
• 抗原抗体反应具有高度特异性
• 荧光物质的检测具有灵敏性和直观性
• 荧光免疫技术是将两者有机的结合起来
• 将荧光物质与抗原（抗体）连接(liánjiē)，形成荧光标记物
• 再与相应的抗体（抗原）发生反应，检测反应体系中的荧光 强弱及存在部位用于物质的定性、定量、定位检测
• 按技术原理及用途分为
免疫荧光技术（immunofluorescencetechnique）又称荧光抗体技术
免疫荧光技术免疫荧光技术（immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。
始创于40年代初，1942年coons等多次报道用异氰酸荧光素标记抗体。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。
主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
一、实验的基本原理免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。
由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。
免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验方法1、直接法这是荧光抗体技术最简单和基本的方法。
滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。
标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。
此法的优点是简单、特异。
但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。
图一、直接免疫荧光法原理示意图2、间接法根据抗球蛋白试验的原理，用荧光素标记抗球蛋白抗体(简称标记抗抗体)的方法。
检测过程分为两步：第一次，将待测抗体(第一抗体)加在含有已知抗原的标本片上作用一定时间，洗去未结合的抗体。
第二，滴加标记抗抗体。
如果第一步中的抗原抗体已发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体(一抗)分子结合，形成抗原-抗体-标记抗抗体复合物，并显示特异荧光。
此法的优点是敏感性高于直接法，而且无需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。
免疫荧光、SDS-PAGE、Western-blot实验技术
小心仔细。
Western Blot常见问题分析
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入APS和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混
合，防止部分胶块聚合不均匀 ➢ 温度合适，受热不均匀导致胶
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD)
15
10-43
12
12-60
10
20-80
8
30-90
操作步骤：采用垂直式电泳槽装置
配制分离胶(12%)（1.0mM的玻璃板）
ddH2O 30%丙烯酰胺贮存胶 1.5M Tris-HCl 10% SDS 10% AP TEMED
3.3ml 4.0ml 2.5ml 0.1ml 0.1ml 4.0μlห้องสมุดไป่ตู้
三、Western blotting
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后 利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的 方法，称为Southern印迹法。
间接法
1.固定 2.通透（选做） 3.封闭（选做） 4.一抗孵育 5.荧光二抗孵育 每步都需要PBS或PBST洗涤3次，每次5分钟。
补体法
利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光
二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分 子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如巯 基乙醇或二硫苏糖醇DTT）并用，通过加热使蛋 白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同 密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用 考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。 因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表
免疫荧光技术(医学相关)
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目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：
异硫氰酸荧光 (fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精 溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。 FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm， 呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其 主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
免疫荧光技术
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技术原理
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实验流程
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免疫荧光技术(immunofluorescence)
技术原理
将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在 细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激 发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或 组织，利用定量技术测定含量，从而可对抗原进行细胞定性和定位分析。
自发荧光：组织和细胞中某些成分受激发时可发出荧光，即自发荧光。
漂白：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失，即漂白现象。
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多激光器系统（多通道激光检测）：
在可见光范围内使用 多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光， 氦氖绿HeNe（G）激光器提供发射波长为543nm的绿光， 氦氖红HeNe（R）激光器发射波长为633nm的红光， 新的405nm的半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线。
关于荧光免疫技术详细介绍
荧光显微镜的基本结构
• 光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 • 滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 • 光路：透射光、落射光 • 聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光
器 • 镜头：消色差镜头
• 隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 • 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选
择性地透过紫外线可见波长 的光域，提供 合适的激发光。 • 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断 激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。
关于荧光免疫技术详细介绍
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教学目的要求：
• 掌握免疫荧光显微镜技术 • 掌握时间分辨荧光免疫技术 • 了解荧光免疫测定的临床应用
1、概述 荧光免疫技术是将抗原抗体
反应的特异性与荧光技术的敏感 性结合起来的一种方法，是免疫 标记技术中发展最早的一种检测 方法。
近年来，随着科学技术的发展，一系列新的 仪器和技术问世，使荧光技术不断完善，已 从原来仅限于检测固定标本，如检测组织切 片或细胞表面的抗原，扩大到进行活细胞分 类检测及多种成分定量检测。荧光技术已被 广泛应用于临床检测和科学研究。
一、抗体要求
二、荧光素要求
三、荧光素标记抗体的方法
四、荧光素标记抗体的纯化
五、荧光抗体的鉴定
六、荧光抗体的保存
第三节 免疫荧光显微技术
• 免疫荧光显微技术的基本原理是：荧光抗 体可与标本切片中组织或细胞表面的抗原 结合，洗涤除去未结合的荧光抗体后，于 荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明 亮的特异荧光，即可对标本中的抗原物质 进行鉴定。
一、标本的制作
荧光显微技术主要是靠观察切片标本上荧 光抗体的染色结果来对抗原进行鉴定和定 位。因此，标本制作的好坏直接影响到检 测结果。
常见的临床标本有：组织、细胞和细菌三大 类，可分别制成切片、印片和涂片。
(完整word版)免疫荧光技术的实验方法及其分类
免疫荧光技术的实验方法及其分类一、免疫标记法及其分类1.荧光免疫法原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3.酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
【精】免疫荧光技术
6.滴加缓冲甘油封片，荧光显微镜检查。
结果观察
细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞 （本实验中为ANA阳性），不发荧光为 阴性。
注意细胞核着染荧光的图像类型：均质 型、周边型、斑点型、核仁型及混合型。
实验讨论
注意事项：抗原片应用前需吹干；待检 血清应保证新鲜。
方法评价：间接免疫荧光技术是检测 ANA最常用的方法。
பைடு நூலகம்
试剂与器材
抗原片（自行制备）、异硫氰酸荧光素 标记的抗人IgG抗体（购买）、 0.01MPBS、待测血清、阳性与阴性对照 血清。
器材：荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒 （内铺浸湿海绵或纱布）、吸管、试管 等。
实验步骤
间接免疫荧光法测ANA 如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。
1.制备小鼠肝印片（方法见实验指导）， 滴加缓冲甘油封片，荧光显微镜检查。
抗原片（自行制备）、异硫氰酸荧光素标记的抗人IgG抗体（购买）、0.
释，滴加于抗原片上，放湿盒内，37℃ 滴加稀释的FITC-抗人IgG抗体，置湿盒内，37 ℃孵育30min。
滴加缓冲甘油封片，荧光显微镜检查。 兰州大学基础医学院免疫研究所 梁亚玲
温浴30min。 方法评价：间接免疫荧光技术是检测ANA最常用的方法。
由于鼠肝印片细胞分布布均匀，多有重 叠，冲洗时易丢失。目前临床检测采用 核大、有丝分裂旺盛、核内细胞器较明 显的HEP-2细胞作为基质片。
4.滴加稀释的FITC-抗人IgG抗体，置湿 如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。
如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。
制备小鼠肝印片（方法见实验指导），每张玻片轻印两处，分别用记号笔标记。
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第八章
荧光免疫技术
（二）影响荧光的因素 pH
温度
荧光素的浓度 试剂中杂质 细胞固定剂
第八章
荧光免疫技术
（三） 荧光物质 1. 荧光色素：FITC、RB200、TRITC、PE、ECD、 PeCy5、PeCy7、APC、PI。 2. 镧系螯合物 ：Eu3+ 等。
第八章
荧光免疫技术
表8-1 常用荧光物质的荧光特点
第八章
荧光免疫技术
第八章 荧光免疫技术
第八章
荧光免疫技术
目
1
2 3
录
概述 荧光免疫显微技术 共聚焦显微技术 荧光免疫测定技术 免疫芯片技术
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4 5
第八章
荧光免疫技术
第一节
概述
一、荧光的基本知识
某些物质受到一定波长光的激发后会发射 荧光（fluorescence）。不同的荧光物质具有 不同的发射光谱、激发光谱和荧光寿命。
第八章
荧光免疫技术
二、荧光抗体染色的技术类型
（一）直接法
荧光素标记抗体
F
抗原
F
第八章
荧光免疫技术
（二）间接法
F
抗原
抗体
荧光素标 记抗体 F
第八章
荧光免疫技术
（1）抗原间接定位法
荧光标记的第二抗体 （二抗）
第一抗体（一抗）
组织中的抗原
第八章
荧光免疫技术
（2）抗体间接定位法
荧光标记抗体
抗原
组织中的抗体
换层析法;
(3)去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固
相抗原吸收。
第八章
荧光免疫技术
5. 荧光素标记抗体的鉴定 荧光素与蛋白结合率、抗体效价、抗体特
异性、抗体抗体特异性染色滴度。
6. 荧光记抗体的保存
加入0.1%NaN3或0.01%硫柳汞防腐，避免
反复冻融，-20℃冻存可保存1~2年，真空干燥 后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存。
第八章
荧光免疫技术
（一）荧光技术中有关的概念和参数 荧光：某些物质受到一定波长光的激发后跃 迁到激发态，当其在极短时间内回复至基态 发射出的波长大于激发光波长的光。 发射光谱：指固定激发波长，在不同波长 下记录到的样品所发射的荧光强度。
第八章
荧光免疫技术
激发光谱：指固定检测发射波长，用不同波长的激 发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。 Stokes位移：荧光物质从激发态回到基态过程中， 部分能量丢失，发射光波长比激发光波长长。 荧光效率：荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百 分率。
第八章
荧光免疫技术
（三）双标记法
用两种荧光素分别标记两种不同的特 异性抗体，对同一标本进行荧光染色， 洗涤后在荧光显微镜下用两种不同的激 发光激发，若有两种抗原存在，可显示
测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对固体或
液体标本中微量物质定量测定。
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第八章
荧光免疫技术
第二节
荧光免疫显微技术
以荧光显微镜为检测工具，用荧光素标记抗 体或抗抗体，检测组织切片中的细胞抗原或血清 中的抗体，观察特异性荧光，用于样本的定性和 定位检查。
第八章
荧光免疫技术
一、标本的制作
1.抗原在染色、洗涤和封埋过程中应保持抗原的 完整性。 2.标本切片要求薄。 3.常见的临床标本有组织、细胞和细菌三大类， 可制作成涂片、印片或切片。 4.除活细胞外，其他标本片应固定。
荧光物质 荧光 最大发射 最大吸收 光谱（nm） 光谱（nm） 颜色 应用
FITC
RB200 TRITC PE
490~495
570 550 488、532
520~530
595~600 620 575
黄绿色
桔红色 橙红色 红色
FAT、荧光偏振免疫测定流式细胞 术 FITC的衬比染色或双标记FAT
FITC的衬比染色或双标记FAT， 也可单独采用 可与FITC共用488nm激发光双标 记FAT、流式细胞术 流式细胞术 流式细胞术 流式细胞术 DNA染色 双激光管的仪器分析 时间分辨荧光免疫测定
透 待标记的蛋白质装入 标记样品量少、蛋白含量低的抗 析 透析袋后置于FITC 体溶液，标记均匀，非特异性荧 法 的缓冲液中过夜 光染色弱，但荧光素用量较大。
第八章
荧光免疫技术
4. 荧光素标记抗体的纯化
(1)去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤 ;
(2)去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交
荧光效率 = 发射荧光的光量子数（荧光强度） 吸收光的光量子数（激发光强度）
第八章
荧光免疫技术
荧光寿命：指荧光物质被激发后所产生的荧光衰减
到一定程度时所用的时间。
荧光的淬灭：荧光物质在某些理化因素或受到激发
光较长时间的照射作用，会发生发射荧光减弱甚至
消退的现象。 FH –FL 荧光偏振： P= F +F 当P=0时，表明完全不偏振； H L P在-1至+1之间为部分偏振。
第八章
荧光免疫技术
（二）镧系元素标记物的制备 1.镧系元素标记物：铕（Eu3+）、钐（Sm3+）、 铽（Tb3+）、钕（Nd3+）和镝（Dy3+）。 2.标记方法：一步法、二步法。
第八章
荧光免疫技术
三、荧光免疫技术的原理及类型
用荧光物质标记抗体或抗原，让其与相应抗 原或抗体结合后，借荧光检测仪检测抗原抗体 复合物中特异性荧光的存在情况及其存在的部
位和强度，以判断抗原或抗体存在的位置、分
布和含量。
第八章
荧光免疫技术
技术类型 （一）荧光免疫显微技术：用荧光素标记抗体与组 织切片或细胞表面的抗原反应，洗涤除去游离的 荧光抗体后，在荧光显微镜下直接观察特异性荧
光。
（二）荧光免疫测定技术：以荧光物质标记抗体或 抗原，与相应抗原或抗体结合，用荧光检测仪检
ECD PeCy5 PeCy7 PI APC Eu3+螯合物
488 488、532 8、532 488 633 340
620 670 755 620 670 613
桔红色 红色 深红色 橙红色 红色
第八章
荧光免疫技术
TRITC
FITC
第八章
荧光免疫技术
二、荧光抗体的制备
（一）荧光素标记物的制备 1. 抗体的要求：抗体应具有高特异性、高纯度和 高亲和力，经纯化后标记。
2. 荧光素要求：结合后不易解离，而未结合的
易于去除，结合后仍保持较高的荧光效率和 不影响蛋白质原有的生化与免疫性质，荧光 色泽与背景色泽对比鲜明，结合物稳定，安 全无毒，易于保存。
第八章
荧光免疫技术
3. 荧光素标记抗体的方法：见表8-2。
标记方法 方法学评价
搅 待标记的蛋白质在磁 标记体积大、蛋白含量高的抗体 拌 力搅拌下加入FITC ，标记时间短，荧光素用量少， 法 溶液 但影响因素多，易引起非特异性 染色。