基因工程中的酶
生物基因工程酶知识点总结
生物基因工程酶知识点总结酶是生物体内的一类特殊蛋白质，它能够在生物体内催化化学反应，而不参与其中。
酶在生物基因工程中起着重要的作用，可以用于基因重组、DNA合成、蛋白质表达等方面。
本文将介绍一些关于生物基因工程酶的知识点。
一、酶的分类 1. 氧化还原酶：如过氧化氢酶、过氧化物酶等，能够参与氧化还原反应。
2. 水解酶：如淀粉酶、脂肪酶等，能够将底物分解成较小的分子。
3. 缩合酶：如DNA连接酶、RNA聚合酶等，能够将小分子合并成较大的分子。
4. 转移酶：如转移酶、糖基转移酶等，能够将官能团转移到其他底物上。
5. 氨基酸酶：如氨基转移酶、脱氨酶等，能够催化氨基酸间的转移反应。
二、酶的活性调节 1. 温度：酶的活性随温度的变化而变化，通常在适宜的温度范围内活性最高。
2. pH值：不同的酶对pH值有不同的适应范围，酶的活性随pH值的变化而变化。
3. 金属离子：某些酶的活性需要特定的金属离子的参与，如锌、铁、铜等。
4. 辅因子：有些酶需要辅因子的参与才能发挥活性，如维生素B12等。
5. 底物浓度：酶的活性随底物浓度的增加而增加，但达到一定浓度后活性趋于饱和。
三、酶在基因重组中的应用 1. 切割酶：如限制性内切酶，能够识别特定的DNA序列并切割DNA链，为基因重组提供切点。
2. 连接酶：如DNA连接酶，能够将DNA片段连接成完整的DNA分子，用于合成重组DNA。
3. 标记酶：如绿色荧光蛋白，能够将目标基因与标记序列融合，以便在转基因研究中进行检测。
四、酶在蛋白质表达中的应用 1. DNA聚合酶：能够在体外合成DNA分子，用于合成目的蛋白质的基因。
2. RNA聚合酶：能够将DNA转录成mRNA，为蛋白质合成提供模板。
3. 翻译酶：如核糖体，能够将mRNA翻译成蛋白质。
五、酶在药物研发中的应用 1. 酶的抑制剂：可以通过抑制特定酶的活性来治疗疾病，如抗癌药物中的酪氨酸激酶抑制剂。
2. 酶的活化剂：可以通过激活特定酶的活性来治疗疾病，如生物合成抗生素中的β-内酰胺酶活化剂。
基因工程常用的工具酶
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识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构
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第三节 DNA聚合酶
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DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
❖作用特点
能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催 化核苷酸的聚合
❖作用条件
➢ 脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d
HindΙ、 HindⅡ、 Hind Ⅲ
不同限制修饰系统
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三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列
识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
5‘ HO 3‘ HO
T4-PNP
5‘ p 3‘ HO
OH 3‘ OH 5‘
Mg2+ pppATP（g-32P-ATP）
OH 3‘
5‘ HO
BAP / CIP
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
基因工程中的酶
基因工程中的酶在基因工程中提到不同种的酶，有限制性核酸内切酶，DNA酶，DNA连接酶，DNA聚合酶，RNA聚合酶，反转录酶，解旋酶等。
现区分如下：DNA酶：是水解DNA的酶，将DNA分子水解为脱氧核苷酸。
是切断相邻两个核苷酸之间磷酸二酯键的酶。
DNA连接酶：是连接DNA片段之间的磷酸二酯键的酶。
其在基因工程中的作用是把具有粘性末端的两个DNA片段连接起来。
DNA聚合酶：是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键的酶。
主要在DNA的复制中起作用。
DNA连接酶与DNA聚合酶间的区别：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间催化形成磷酸二酯键。
DNA聚合酶是以一条DNA为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个切口连接起来。
因此DNA连接酶不需要模板。
可见，DNA酶、DNA连接酶、DNA聚合酶的共同之处是都作用于磷酸二酯键。
DNA聚合酶主要连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起做用；DNA连接酶主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用.在基因工程中起作用，同时DNA连接酶在DNA复制中也起作用，比如岗琦片段的连接！几种酶的比较：限制性核酸内切酶（以下简称限制酶）：限制酶主要存在于微生物（细菌、霉菌等）中。
一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。
发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。
是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。
例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。
目前已经发现了200多种限制酶，它们的切点各不相同。
苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
基因工程所需要的酶
基因工程所需要的酶引言基因工程是一项重要的生物技术，它利用酶的特殊功能来改变生物体的遗传信息。
酶在基因工程中起着关键作用，它们能够催化特定的化学反应，使得基因组中的DNA序列发生改变。
本文将介绍基因工程中常用的酶以及它们在不同的应用领域中的作用。
常用酶及其功能1. 限制性内切酶限制性内切酶是一类能够识别DNA序列并在特定位置切割DNA链的酶。
它们广泛应用于基因工程中的DNA重组、克隆和测序等领域。
限制性内切酶根据其识别位点和切割模式被分类为不同类型，如EcoRI、BamHI等。
这些酶可以将DNA分子切割成片段，并产生粘性或平滑末端，为后续操作提供方便。
2. DNA连接酶DNA连接酶是一种能够将两个单链DNA或RNA分子连接成一个完整双链分子的酶。
它们在基因工程中常被用于连接DNA片段，构建重组DNA分子。
T4 DNA连接酶是常用的DNA连接酶之一，它能够将DNA片段连接成环状或线性结构。
3. 核酸聚合酶核酸聚合酶是一类能够催化DNA或RNA的合成的酶。
在基因工程中，核酸聚合酶被广泛应用于PCR（聚合酶链式反应）和基因克隆等领域。
其中，Taq DNA聚合酶是PCR反应中最常用的核酸聚合酶之一，它能够耐高温，并具有高度特异性和高效率。
4. 核酸修复酶核酸修复酶是一类能够修复DNA损伤和错误的酶。
在基因工程中，核酸修复酶被用于修复突变的DNA序列，纠正基因组中的错误。
CRISPR-Cas9系统利用Cas9核酸修复酶来导向性地切割和编辑目标DNA序列。
5. 核苷三磷脂转移ase核苷三磷脂转移ase（NTPase）是一类能够催化核苷三磷酸与核苷二磷酸之间的磷酸酯键转移的酶。
在基因工程中，NTPase被广泛应用于DNA合成和修饰等领域。
DNA聚合酶的活性依赖于NTPase的催化作用。
酶在基因工程中的应用1. DNA重组和克隆在基因工程中，限制性内切酶被广泛应用于DNA重组和克隆。
通过选择适当的限制性内切酶，可以将目标DNA片段与载体DNA连接起来，构建重组DNA分子。
分子生物学第四章--基因工程常用工具酶
同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。
同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。
B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。
粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补— — DNA是分子重组的基础
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同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别 序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平 头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端， 称为同识异切。
第四章 基因工程常用工具酶
1
Manipulating Genes
- Transferring Genes
Restriction Ligation Extract DNA
Transformation
Selection
Culturing
2
重组DNA实验中常见的主要工具酶
3
我们的基本目的是：把外源基因与载体 连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以 下两类工具酶：
23
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，
产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的
DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
24
限制性内切酶的剪切方式
25
Yu Zheng, et al. Using shotgun sequence data to find active restriction enzyme genes. Nucleic Acids Res., 2009, 37: e1. Whole genome shotgun sequence analysis has become the standard method for beginning to determine a genome sequence. The preparation of the shotgun sequence clones is, in fact, a biological experiment. It determines which segments of the genome can be cloned into Escherichia coli and which cannot. By analyzing the complete set of sequences from such an experiment, it is possible to identify genes lethal to E. coli.
基因工程常用的工具酶
农作物的产量和质量。
医学领域
基因工程被用于治疗遗传性疾 病、癌症、感染性疾病等，以 及制备疫苗和单克隆抗体。
工业领域
基因工程被用于生产高价值的化 学品、生物燃料和生物材料等， 降低生产成本和提高产品质量。
基础研究
基因工程被用于研究基因的结构 和功能、蛋白质的表达和调控等
常见的限制性核酸内切酶包括EcoRI、BamHI、HindIII等。
DNA聚合酶
DNA聚合酶是催化DNA复制过程中 DNA聚合反应的酶。
常见的DNA聚合酶包括Taq酶和T7噬 菌体DNA聚合酶等。
DNA聚合酶具有合成DNA的功能，可以在 模板DNA的指导下，将脱氧单核苷酸逐个加 到引物RNA的3'-OH末端，形成新的互补链 。
，促进生命科学领域的发展。
02 基因工程常用的工具酶概 述
工具酶的定义与分类
定义
工具酶是指用于基因工程操作的一类 酶，能够催化DNA或RNA的切割、连 接、修饰等反应，是基因工程实验中 必不可少的工具。
分类
根据功能的不同，工具酶可以分为限 制性核酸内切酶、DNA聚合酶、反转 录酶、T4核酸连接酶等。
工具酶在生物制药和农业生产中应用广泛，如基因工程的抗体药物、疫
苗、农作物改良等领域，能够提高产品的产量和质量。
工具酶的来源与生产
来源
工具酶主要来源于微生物、植物和动 物等生物体，其中微生物来源的酶是 最常用的。
生产
工具酶的生产通常采用基因工程技术 ，通过克隆和表达酶的基因来获得相 应的酶蛋白，再经过纯化和复性等步 骤得到高活性的工具酶。
VS
转录激活因子
激活特定基因的表达，实现基因治疗。
基因工程操作的各种酶
基因工程操作的各种酶基因工程操作中涉及一系列相互关联的酶促反应。
已经知道有许多重要的核酸酶，如限制性内切核酸酶、外切核酸酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、反转录酶、DNA及RNA的修饰酶等，在基因工程的操作中有着广泛的用途。
1．限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的条件下使每一条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3／―OH基团和5／―P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。
至今发现的限制性内切核酸酶有I型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶，它们各具特性。
基因工程中所说的限制性内切核酸酶都是指Ⅱ型酶。
限制性内切核酸酶把目的基因从只有四种碱基A、T、G、C组成的DNA长链(人类D NA长度为3X109个碱基对)中准确地剪切下来。
每一种限制性内切核酸酶的识别位点是固定的，如EcoRI的识别位点是GAATTC及其互补序列CTTAAG。
1968年，沃纳?阿尔伯博士、丹尼尔?内森斯博士和汉密尔?史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出限制性内切核酸酶。
该酶能够在DNA上寻找到特异的“切点”，认准后将DNA 分子的双链交错地切断。
至今人们已经分离提取出400多种限制性内切核酸酶。
目前，人们可以从复杂的生物有机体基因组中，经过限制性内切核酸酶酶切消化等步骤，分离出目的基因。
因其能够特异地切割DNA分子，人们常形象的将其比作“分子剪刀”。
2．DNA连接酶DNA连接酶能够催化具有3／―OH基团和5／―P基团的DNA片段之间形成磷酸二酯键。
在基因克隆中用来连接目的基因与载体。
3．DNA聚合酶DNA聚合酶可以使单核苷酸通过磷酸二酯键加在寡核苷酸的3／―OH端，在基因克隆中用来补平缺口。
尤其是具有耐热性质的DNA聚合酶的分离极大促进了基因等DNA片段的体外合成与扩增技术的发展。
4．反转录酶反转录酶以RNA为模板合成DNA，即cDNA (complementaryDNA，互补DNA)。
第三章基因工程的酶学基础
哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG’3序列中的C5位上引 入甲基
（3）核酸内切酶的缓冲液性质
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极 端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序 列发生低特异性，即所谓的Star activity现象。
6.II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件
Tris--HCl 50 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
NaCl
0 -150 mM
DTT
1 mM
Volume 20 - 100 μl
T 37 ℃ 1- 1.5 h
0 - 50 mM 低盐酶 100 mM 中盐酶 150 mM 高盐酶
识别序列 切割位点距
TGAN8TGCT AACN6GTGC
距识别序列1kb 处随机性切割
旋转对称序列
识别序列内或附近 特异性切割
GAGCC
CAGCAG
识别序列下游24-26bp处
3.限制性核酸内切酶的命名原则：
第一个字母： 大写，表示所来自的微生物属名的第一个字母 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母 其它字母： 大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号 罗马数字： 表示该菌株发现的限制酶的编号
4．同尾酶（isocaudamer）
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘 性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点 的选择余地更大。
杂种位点（hybrid site）由一对同尾酶分别产生的 粘性末端共价结合形成的位点。
一不能被原来的任何一种同尾酶识别。
基因工程的工具酶
T
T
A
G
C
C
G
怎样切？ • 基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）
例：大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
限制酶
限制酶
几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点
Pst I
Provindencia stuartii 164
Haemophilus influenzae Rd
4363 pBR322物理图谱
练习题
为了绘制长为3.0kb BamH Ⅰ限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ、 EcoR Ⅰ+Hpa Ⅱ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观 察DNA带型。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoR Ⅰ和Hpa Ⅱ识别位点间的 相对位置，以及它们之间的距离（kb）。
现非特异性的DNA片段的现象。 易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR I*
造成星活性参数 甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基
亚枫，二价阳离子，12%
限制性内切酶的应用
1、重组DNA前的切割 2、构建新质粒 3、构建物理图谱 4、DNA分子杂交 5、制备DNA探针 6、亚克隆以用作序列分析 7、基因定位，DNA同源性研究。
A. 连接的两条链必须分别具有 3′端自由羟基（-OH）和5 ′端磷酸基团（-P），而且只有这两 个基团彼此相邻时才能进行连接反应；
B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与， 通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。
是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。
第二章基因工程中常用的工具酶
第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。
型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。
生物技术课件——基因工程常用工具酶
HO GCA…5’
5’…ACGAATTCGT…3’
T4DNA连接酶 Mg2＋，ATP
3’…TGCTTAAGCA…5
反应系统：ATP，Tris－HCl，MgCl2，DTE（二硫赤藓糖醇），ATP， pH7.5，4～15℃
h
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也可以连接两条平起末端的DNA分子，但反 应速度较慢。
5’…CGAOH
DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。
DNA聚合酶主要有三类：聚合酶Ⅰ(polⅠ)、 聚合酶Ⅱ(polⅡ) ，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其 中聚合酶Ⅰ参与DNA修复，聚合酶Ⅲ参与DNA 复制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。
h
32
DNA聚合酶Ⅰ在DNh A复制过程中的作用 33
DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比较
h
7
2.1.1.2 R-M系统
细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构 成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restrictionmodification system)。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的 限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可 以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则 会被降解。
2 基因工程常用工具酶
h
1
基因工程的重要特点之一是在体外实行DNA分子的切 割和重新连接。因此，工具酶是DNA体外操作必不可 少的工具。
取得编码某种药物的目的基因，大多需要工具酶－限 制性核酸内切酶
将目的基因与载体DNA连接在一起，也需要工具酶－ DNA连接酶。
目前，许多厂商都在生产各种优质工具酶，简化了分
感染
E.coli k
Phageλ（k）
B 限制 λ（不k感）染』
基因工程名词解释
1.工具酶：基因工程的操作，是在分子水平上的操作，依赖一些酶作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作，所以把这些酶称之为“工具酶”。
2.限制性核酸内切酶简称限制酶，是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。
3.平头末端：两条链断开的位置在识别序列的对称中心产生平末端4.粘性末端：两条链上断开的位置是交错的对称地分布在识别序列中心位置两侧，产生粘性末端5.同裂酶：来源不同,识别相同序列的限制酶6.同序同切酶：识别序列和切割位置都相同7.同序异切酶：识别序列相同，切割位点不同8.同尾酶：识别序列不同，但是产生相同的粘性末端的限制酶9.II型限制性内切酶由于反应条件的改变，其限制酶的特异性发生松动，识别和切割序列发生改变，这一特性称为星号活性。
10.DNA连接酶：可使一段DNA的3` 羟基末端和5`磷酸末端形成3`，5`- 磷酸二酯键，把两个DNA 片段连在一起，封闭DNA双链上切口的酶。
11. DNA聚合酶：在引物和模板存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH端，催化核苷酸的聚合作用。
12.∆G 值：是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。
13.平台期：PCR反应过程中，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”。
14.绝对定量：测定目的基因在样本中的拷贝数（必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线）15.相对定量：测定目的基因在样本中的含量的相对比例，不需要知道其拷贝数16.Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数17.分子杂交：有一定同源性的两条核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基互补退火形成稳定的双链分子的过程。
18. 探针：核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。
基因工程常用的工具酶
基因工程常用的工具酶常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系生物制药0911 刁亚军学号:2009423134引言:在基因工程的研究和发展过程当中，有许多必不可少的因素影响和制约着基因工程的进展。
本篇综述主要讲述的是基因工程常用的一些工具酶，他们包括限制性内切酶，DNA聚合酶，T4噬菌体DNA连接酶，T4多聚核苷酸激酶，碱性磷酸酶，核酸酶。
这些酶在基因工程中发挥着非常重要的作用。
限制性内切酶限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。
根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。
III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。
限制性内切酶的由来一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组限制性核酸内切酶成，第四个字母表示菌株(品系)。
例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。
限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。
别名Endodeoxyribonuclease简称限制酶酶反应限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。
它能识别外源DNA并将其降解。
单位定义在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
基因工程中常用的酶
分类与用途
分类
根据识别序列的长度和切割位点的特性，限制性内切核酸酶 可分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型限制性内切核酸酶识别位点较长， 切割位点不规则；Ⅱ型限制性内切核酸酶识别位点较短，切 割位点规则。
用途
限制性内切核酸酶在基因工程中主要用于DNA的克隆、基因 的定位、突变分析等方面。通过限制性内切核酸酶的切割， 可以将DNA片段分离出来，再进行后续的克隆和转化等操作 。
生物制药
在生物制药中，使用DNA 连接酶将药物基因或疫苗 基因插入到载体中，制备 基因药物或基因疫苗。
03
聚合酶
定义与特性
聚合酶
是一种能够催化DNA复制和修复的酶， 通过聚合核苷酸片段，合成新的DNA 链。
特性
聚合酶具有专一性、高效性和耐受性 等特性，能够在特定的模板指导下， 高效地合成DNA链。
分类与用途
分类
根据来源不同，反转录酶可分为天然反转录酶和重组反转录酶。
用途
在基因工程中，反转录酶主要用于将RNA转录为cDNA，以便进行基因克隆、表达和功能研究。
反转录酶的应用案例
基因克隆
通过反转录酶将mRNA转化为 cDNA，再利用限制性内切酶将其 切割成适当大小的片段，进行基 因克隆和测序。
基因工程中常用的酶
• 限制性内切核酸酶 • DNA连接酶 • 聚合酶 • 反转录酶 • 其他常用酶类
01
限制性内切核酸酶
定义与特性
定义
限制性内切核酸酶是一类能够识 别并切割DNA特定序列的酶，是 基因工程中常用的工具酶之一。
特性
限制性内切核酸酶具有高度的特 异性，能够识别并切割DNA中的 特异序列，切割位点通常是DNA 双链中的特定位点。
限制性内切核酸酶的应用案例
基因工程中常用的酶分类和性质
3’
3‘ A
5’
T4 DNA Ligase
5‘ G G A T C T 3‘ C C T A G A
3’ • 连 接 处 不 再 是 内 切 酶识别序列
5’
• BamH Ⅰ/ Bgl Ⅱ • Sal Ⅰ/ Xho Ⅰ • Spe Ⅰ/ Xba Ⅰ
三、限制酶的识别序列与DNA的切割
（P47） • 1、限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不具有种的特
基因工程中常用的 酶分类和性质
• 一、限制性核酸内切酶 • 二、连接酶 • 三、聚合酶 • 四、修饰酶
第一节 限制性核酸内切酶 (Restriction enzyme)
基因的剪刀
----------------限制性内切酶
• 核酸酶（P41-42)：切割相邻的两个核苷酸残基间的磷
酸二酯键导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶。可分 为核糖核酸酶与脱氧核糖核酸酶。
• 具3’突出未端的粘性未端
5‘ 3‘
5‘ 3‘
GAGCTC CT CGAG
Sac Ⅰ
G A G C T 3’
5’ C
C 5’
3’ T C G A G
3’ 5’
3’ 5’
• KpnⅠ (5’ ··· GGTAC^ C ··· 3’) • PstⅠ (5’ ··· CTGCA^ G ··· 3’) • SacⅠ (5’ ··· GAGCT^ C ··· 3’)
化酶亚基分开
能酶
识别位点 4～6bp 序列
5～7bp
两侧对称或不对称
常为回文
不对称序列
剪切位点 在限制位点
限制位点上游 离限制位点 >1000
24～26bp 处 bp 的非特异位点
基因工程
一、名词解释1、同裂酶(isoschizomer):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割相同的核苷酸靶序列，称为同裂酶。
Hpa Ⅱ和Msp I(C CGG)。
2、同尾酶(isocaudarner):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割的核苷酸靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。
BamH I(G GATCC)和Bgl Ⅱ(A GATCT)。
3、星号活性(star activity):在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列，降低酶切反应的特异性，这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星号活性。
4、载体(vector)：携带外源基因进入受体细胞并在细胞内繁殖的DNA分子5、不亲和性：是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。
6、多克隆位点( MCS)：载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。
7、电泳(EP):带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称电泳。
8、探针(probe)：经放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的核酸片段。
9、PCR：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
10、平台效应：PCR循环的后期，合成的产物到达0.3－1 pmol的水平，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速率变成平坦曲线，扩增产物不再随循环次数而明显上升。
11、蛋白质变性：是指蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，这种现象称为蛋白质变性。
12、解链温度(Tm)：DNA双链解离一半时的温度Tm值= 4×(G+C)＋2×(A+T)。
基因工程中常用的酶
用途： (1)在载体和cDNA上加互补的同聚物接头 (Homopolymeric tail)
AAAAA
AAAAA TTTTT
TTTTT
(2) 用32P进行3`端同位素标记
五.逆转录酶 (reverse transcriptase)
以RNA为模板的DNA聚合酶，来源于鼠和禽 类的反转录病毒。由两条肽链组成，其中一 条具有5`→3`聚合酶和5` →3` 外切酶活性。 用途： (1)合成双链cDNA,作为插入载体的目的基因； (2)以ssDNA或RNA为模板合成杂交探针。
用途： (1)分析RNA· DNA杂合结构； (2)除去DNA的单链末端，生成平端； (3)切断双链DNA 的发夹结构。
七.核酸酶 Bal 31
具两种活性： (1)双链特异外切酶活性；从dsDNA的3`和5`切除 寡核苷酸或单核苷酸；EGTA(乙二胺四乙酸) 可终止反应 (2)单链特异内切酶活性：专门从单链DNA切除带 有5`末端的单链核苷酸和寡核苷酸(类似于核 酸酶S1的单链特异性核酸内切酶活性) Ca2+ Ca2+
B 5’ P B OH P P P ATP PPi P P P OH P P NAD B B T4 ligase NMN B B B B B E.coli ligase 3’ P P P B B B
连接酶的功能： (1)能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单 链缺口，而不能封闭双链RNA中的单链缺口 (2)能封闭粘性末端退火后出现的缺口； 用途： (1)通过粘端连接DNA分子； (2)连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接 头的连接。
八.核酸外切酶Ⅲ (Exonuclease Ⅲ)
活性： (1) 3`外切酶；
Mg2+
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基因工程中的酶
在基因工程中提到不同种的酶，有限制性核酸内切酶，DNA酶，DNA连接酶，DNA聚合酶，RNA聚合酶，反转录酶，解旋酶等。
现区分如下：
DNA酶：是水解DNA的酶，将DNA分子水解为脱氧核苷酸。
是切断相邻两个核苷酸之间磷酸二酯键的酶。
DNA连接酶：是连接DNA片段之间的磷酸二酯键的酶。
其在基因工程中的作用是把具有粘性末端的两个DNA片段连接起来。
DNA聚合酶：是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键的酶。
主要在DNA的复制中起作用。
DNA连接酶与DNA聚合酶间的区别：
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间催化形成磷酸二酯键。
DNA聚合酶是以一条DNA为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个切口连接起来。
因此DNA连接酶不需要模板。
可见，DNA酶、DNA连接酶、DNA聚合酶的共同之处是都作用于磷酸二酯键。
DNA聚合酶主要连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起做用；DNA连接酶主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用.在基因工程中起作用，同时DNA连接酶在DNA复制中也起作用，比如岗琦片段的连接！
几种酶的比较：
限制性核酸内切酶（以下简称限制酶）：限制酶主要存在于微生物（细菌、霉菌等）中。
一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。
发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。
是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。
例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。
目前已经发现了200多种限制酶，它们的切点各不相同。
苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。
在基因工程中起作用。
DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基
因工程中起作用。
DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。
它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5’- PO4与另一DNA链的3’- OH生成磷酸二酯键。
但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的（T4DNA连接酶除外），而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA 连接酶催化成磷酸二酯键。
1 一般性质：大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。
对胰蛋白酶敏感，可被其水解。
水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD（而不是ATP）反应形成酶- AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。
DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。
因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。
这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。
噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。
此酶的催化过程需要ATP辅助。
T4DNA 连接酶可连接DNA- DNA，DNA- RNA，RNA- RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。
另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。
无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。
2 作用机制：DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。
反应过程可分三步：
（1）NAD+或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的ε─氨基上形成共价的酶-腺苷酸中间物，同时释放出烟酰胺单核苷酸（NMN）或焦磷酸。
（2）将酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰基再转移到DNA的5’-磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸；
（3）这个被激活的5’-磷酰基端可以和DNA的3’- OH端反应合成磷酸二酯键，同时释放出AMP。
DNA连接酶所催化的整个过程是可逆的。
酶-腺苷酸中间物可以与NMN或PPi反应生成NDA或ATP及游离酶；DNA-腺苷酸也可以和NMN及游离酶作用重新生成NAD。
该逆反应过程可以在AMP存在的情况下使共价闭环超螺旋DNA 被连接酶催化，产生有缺口的DNA-腺苷酸，生成松弛的闭环DNA。
在真核生物细胞中也存在DNA连接酶，且有两型，分别称为连接酶Ⅰ和Ⅱ，反应中利用ATP所提供的能量。
DNA连接酶Ⅰ分子量约为200KD，主要存在于生长旺盛细胞中，DNA连接Ⅱ分子量约85KD，主要存在于生长于不活跃的细胞中（resting cell）。
DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起做用。
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。
因此DNA连接酶不需要模板。
编辑本段]DNA聚合酶的发现
在50年代的中期，A. Kornberg和他的同事们就想到DNA的复制必然是一种酶的催化作用，于是决心分离出这种酶并研究其结构和作用机制。
为了达到这个目的，他们分离的蛋白，然后加到体外合成系统中即同位素标记的dNTP、Mg2+及模板DNA，经过大量的工作，于1956年终于发现了DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerase Ⅰ，DNA pol Ⅰ）原来称为Kornberg酶。
以后又相续发现了DNA pol Ⅱ和DNA pol Ⅲ。
开始人们以为DNA pol I是细菌中DNA复制主要的酶类，后来发现DNA pol Ⅰ的突变株照样可以复制，才清楚它并不是主角。
现在已经知道在DNA复制中起主导作用的是DNA pol Ⅲ，至于pol Ⅱ的功能现在还不十分清楚。
DNA聚合酶的共同特点是：
（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3’-OH；（3）合成的方向都是5’→3’（4）除聚合DNA外还有其它功能。
所有原核和真核的DNA聚合酶都具有相同的合成活性，都可以在3’-OH 上加核苷酸使链延伸，其速率为1000 Nt/min。
加什么核苷酸是根据和模板链上的碱基互补的原则而定的。
E.coli的DNA pol Ⅰ涉及DNA损伤修复，在半保留复制中起辅助的作用。
DNA pol Ⅱ在修复损伤中也是有重要的作用。
DNA pol Ⅲ是一种多亚基的蛋白。
在DNA新链的从头合成（de novo）中起复制酶的作用。
RNA聚合酶（又称RNA复制酶、RNA合成酶）的催化活性：RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。
真核生物RNA聚合酶：真核生物的转录机制要复杂得多，有三种细胞核内的RNA聚合酶：RNA聚合酶I转录rRNA，RNA聚合酶II转录mRNA，RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。
在RNA复制和转录中起作用。
反转录酶：RNA指导的DNA聚合酶，具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指导的DNA聚合酶。
在分子生物学技术中，作为重要的工具酶被广泛用于建立基因文库、获得目的基因等工作。
在基因工程中起作用。
解旋酶：是一类解开氢键的酶，由水解ATP来供给能量它们常常依赖于单链的存在，并能识别复制叉的单链结构。
在细菌中类似的解旋酶很多，都具有ATP酶的活性。
大部分的移动方向是5’→3’，但也有3’→5’移到的情况，如n’蛋白在φχ174以正链为模板合成复制形的过程中，就是按3’→5’移动。
在DNA复制中起做用。
DNA限制酶作用于磷酸二酯键
DNA连接酶作用于磷酸二酯键
DNA聚合酶作用于磷酸二酯键
DNA解旋酶作用于氢键。