过氧化物酶封闭液(H2O2法)
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)说明书
TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(显色法)产品编号 产品名称包装 C1098TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(显色法)50次产品简介：碧云天生产的显色法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。
对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB 显色等步骤，即可在普通光学显微镜下观察到凋亡细胞。
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA 内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA 。
细胞凋亡时抽提DNA 进行电泳检测，可以发现180-200bp 的DNA ladder 。
基因组DNA 断裂时，暴露的3'-OH 可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后在HRP 的催化下通过DAB 显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。
本试剂盒有如下优点。
(1) 高灵敏度：背景染色极低，阳性染色强，可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA 断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。
(2) 特异性好：TUNEL 检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。
(3) 快速：仅需约2-3个小时即可完成。
(4) 应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。
(5) 实测效果好：参考图1。
图1. 本试剂盒的检测效果图。
A. HeLa 细胞未处理或用DNase I 室温孵育10分钟后的检测效果图。
免疫组化,免疫检测
免疫组化,免疫检测北京华越洋生物-----------------------------------------------DMDC玻片硅化剂(2%) 100ml 免疫组化40% 室温,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由二甲二氯硅烷(DMDC)组成。
玻片硅化试剂盒(APES法) 3×100ml 免疫组化40% 4℃,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由APES、洗涤液、DEPC水组成。
玻片硅化试剂盒(APES法) 3×500ml 免疫组化40% 4℃,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由APES、洗涤液、DEPC水组成。
PBS-Triton去污剂100ml 免疫组化40% 室温,12个月去污主要由PBS、Triton-100组成。
Sorensen磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH5.3-8.04)500ml 免疫组化40% 4℃,6个月组织化学常用缓冲液主要由磷酸二氢盐(钠/钾)和磷酸氢二盐(钠/钾)溶液组成,按不同比例混合后获得对用PH值。
pH值可选5.3，5.6，5.91，6.24，6.47，6.64，6.81，6.98，7.17，7.73，8.04。
Sorensen磷酸缓冲液(1×,pH6.2) 500ml 免疫组化40% 4℃,6个月少量细胞趋化实验主要由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钙组成,终浓度17mM。
Sorensen磷酸缓冲液(10×,pH6.2) 500ml 免疫组化40% 4℃,6个月少量细胞趋化实验主要由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钙组成,终浓度170mM。
TBS缓冲液(0.02mol/L,pH8.2) 500ml 免疫组化40% 室温,6个月免疫金银染色缓冲液主要由Tris、氯化钠组成。
TBS缓冲液(0.05mol/L,pH7.4) 500ml 免疫组化40% 室温,6个月免疫金银染色缓冲液主要由Tris、氯化钠、叠氮钠、BSA组成。
氧化还原酶过氧化物酶过氧化物酶 (2)
同最适pH。 ③ 不同部位，pH也有差异。 ④ 酶的提取或分离方法对最适pH也有影响。 ⑤ 测定酶活力时，采用的底物和缓冲液对酶最适
pH有影响。 ⑥ 用同工酶，PPO具有一个最适pH外，尚有第
二个最适pH。
4 温度对多酚氧化酶活力的影响
（速Байду номын сангаас蔬菜）
POD的测定方法：
方法：将已热处理的原料中抽取样品，横切，随 即放入愈创木酚或联苯胺溶液中，然后取出 ，在切面上滴0.3%H2O2，数分钟后，用愈 创木酚处理的样品变为褐色，联苯胺变为深 蓝色，说明过氧化氢酶未被破坏，热处理时 间不够，如果均不变色，则表示热处理效果 良好。
3过氧化物酶最适pH和最适温度
问题：经热烫的罐装或冷冻蔬菜在保藏期 间产生的不良风味的原因？
5 影响过氧化物酶热失活的因素
5.1. 不同来源的POD具有不同的耐热性。
一般来说，植物的过氧化物酶活力越高，它的耐 热性也越高。 比如马铃薯和花菜匀浆中的过氧化物酶在 95℃加热10min就完全而不可逆地失活。 而 甘 蓝 中 的 过 氧 化 物 酶 在 120℃ 加 热 10min仍然有0.3%活力保存下来。
SO2+ H2O 2→H2O+SO3 0.1-0.15%的焦亚硫酸盐能防止豌豆产生不
良风味
6.2.2 氰化物、叠氰化物和氟复合物：能与血红素 结合，为可逆抑制。
6.2.3 表面活性化合物：如单甘脂，卵磷脂等，显 著失活。
6.2.4 高分子物质：
如果胶在pH5.5时，使POD显著失活；pH 低，使POD完全失活。果胶的存在还能使POD 最适pH从5.5移动至8.0，大多数果胶pH在酸性 范围。这在食品加工中很重要。
简化的免疫组化步骤
免疫组化
注意：全程不能干片。
1. 石蜡切片，二甲苯、梯度酒精脱蜡至水。
2. 3% H2O2去离子水室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶活性（有人也不消除，刚开始做，建议使用）。
PBS冲洗，5min×3 次。
根据需要选择抗原修复方式及强度。
热修复、酶修复或不修复。
3. 热修复抗原：将切片浸入到EDTA 修复液中，微波炉加热到沸腾后断电（不可持续沸腾），间隔10-15min 再修复1-2 次，冷却至室温。
4. 用PBS过度，擦干周围PBS，滴加5% BSA 封闭液37℃孵育30min，甩干，勿洗。
5. 滴加适当稀释的一抗（稀释参考说明书），37℃孵育2 小时或4℃过夜（过夜效果会更好一些）。
PBS 冲洗，5min×3 次。
6. 擦干周围PBS，滴加生物素标记山羊抗大鼠IgG（二抗），37℃孵育30min。
PBS 冲洗，5min×3 次。
7. 滴加SABC，37℃孵育30min。
PBS 冲洗，5min×3 次。
8. 显色：光镜下控制反应时间。
显色剂可选DAB。
自来水背面充分冲洗。
9. 苏木素复染，染色时间为0.5-2min。
梯度酒精脱水，二甲苯透明。
10. 选用中性树胶封片。
过氧化物酶(微量法)试剂盒使用说明
过氧化物酶（微量法）试剂盒使用说明货号:BC0095规格:100T/96S产品内容：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体×1瓶，4℃保存；用时每瓶加入3mL 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存一周。
试剂三：液体3mL×1瓶，4℃保存。
产品简介：POD（EC 1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
POD 催化H 2O 2氧化特定底物，在470nm 有特征光吸收。
试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水操作步骤：一、粗酶液提取：1、细菌、细胞或组织样品的制备收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3秒，间隔10秒。
重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
二、POD 测定操作表1、分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至470nm，蒸馏水调零。
2、测定前将试剂一、二和三在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）放置10min 以上。
3、样本测定表试剂名称测定孔（μL）样本10蒸馏水60试剂一120试剂二30试剂三30在微量石英比色皿或96孔板中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录470nm下30s时的吸光值A1和1min30s后的吸光值A2。
计算ΔA=A2-A1。
注意：若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三和蒸馏水按比例配成混合液，在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）放置10min以上，测定时加入240μL混合液和10μL样本测定。
过氧化物酶染色液(联苯胺法)
南京森贝伽生物科技有限公司 网址：/第1页 仅供科研版本号：171024过氧化物酶染色液(联苯胺法)【产品组成】【保存条件】4℃,避光 ,6个月【产品概述】过氧化物酶(Peroxidase ，简称POX 或MPO)是由微生物或植物所产生的一类能催化很多反应的以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶氧化还原酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
过氧化物酶染色液(联苯胺法)是ICSH 推荐采用的POX 染色液，其原理是细胞内的过氧化物酶能将无色的3,3-二氨基联苯胺(DAB)的氢原子传递给过氧化氢，使前者催化成有色染料沉积在细胞质中的POX 所在部位。
该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片过氧化物酶染色,POX 活性部位呈棕黄色。
【使用方法】1、血液、骨髓或细胞涂片滴加预冷的BFA 固定液，4℃固定30～60s ，稍水洗。
2、滴加配制好的POX 孵育液，室温(20～25℃)避光孵育10～15min ，水洗2min 。
3、滴加WG 染色液，孵育30～60s 。
4、直接滴加等量WGbuffer ，染色10～15min 。
5、水洗、晾干、镜检。
【染色结果】粒细胞系除早期原粒细胞阴性外，分化好的原粒细胞以下阶段细胞随细胞成熟而阳性反应增强，衰老中性粒细胞反应程度减弱单核细胞系弱阳性，淋巴细胞系为阴性。
浆细胞及巨核细胞均为阴性。
嗜酸性粒细胞和Auer 小体呈强阳性反应。
阳性反应强度的判断：【临床意义】1、急性粒细胞白血病晚期的原粒细胞呈阳性，颗粒较少且大。
2、急性单核白血病细胞呈阴性或弱阳性，颗粒小且稀疏。
3、单核急性白血病呈阴性或弱阳性。
4、急性早幼粒白血病呈强阳性，某些早幼粒细胞呈阳性，恶性组织细胞呈阴性。
5、急性淋巴细胞白血病呈阴性。
【注意事项】1、血液或骨髓涂片应新鲜，薄厚适宜，及时固定，否则会影响酶的活性。
2、POX孵育液易失效或降低阳性强度，即配即用，不宜久置。
gsh-px检测原理
gsh-px检测原理
GSH-Px（谷胱甘肽过氧化物酶）是一种重要的抗氧化酶，它在
细胞内起着保护细胞免受氧化损伤的作用。
GSH-Px检测原理涉及到
谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢（H2O2）之间的反应。
GSH-Px能够将GSH和H2O2催化反应，将H2O2还原成水，并同时氧化GSH为氧化
谷胱甘肽（GSSG）。
这个反应是细胞内抗氧化防御系统中非常重要
的一环。
在实际的检测中，一般会利用底物和辅酶来检测GSH-Px的活性。
常用的方法包括直接测定底物消耗法、间接法和光度法。
其中，直
接测定底物消耗法是通过测定反应体系中底物消耗的速率来判断
GSH-Px的活性，间接法是通过测定GSH的浓度变化来间接测定GSH-Px的活性，而光度法则是通过测定反应体系中H2O2浓度的变化来
判断GSH-Px的活性。
总的来说，GSH-Px检测的原理是基于其催化还原过氧化氢的能力，通过测定反应体系中底物消耗、GSH浓度变化或H2O2浓度变化
来间接或直接地测定GSH-Px的活性。
这些方法可以帮助科研人员和
临床医生评估细胞的抗氧化能力和氧化应激状态，从而为疾病的诊
断和治疗提供重要的参考依据。
过氧化物酶染色液（DAB法）使用说明书
过氧化物酶染色液（DAB法）使用说明书过氧化物酶染色液(DAB法)使用说明书货号：G2370有效期：6个月有效。
产品内容：名称4×10ml4×20ml Storage 试剂(A):BFA固定液10ml20ml4℃避光试剂(B): POX孵育液B1:DAB染色液10ml20ml-20℃避光B2:DAB氧化剂2×100μl4×100μl RT临用前，按B1:B2=1000:1比例混合，即为POX孵育液，即配即用。
试剂(C):WG染色液10ml20ml RT避光试剂(D):WG buffer10ml20ml RT产品说明：过氧化物酶(Peroxidase，简称POX或MPO)是由微生物或植物所产生的一类能催化很多反应的以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶氧化还原酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
过氧化物酶染色液(DAB法)是ICSH推荐采用的POX染色液，其原理是细胞内的过氧化物酶能将无色的DAB的氢原子传递给过氧化氢，使前者催化成有色染料沉积在细胞质中的POX所在部位。
该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片过氧化物酶染色,POX活性部位呈棕黄色。
自备材料：1、载玻片2、显微镜操作步骤(仅供参考)：1、血液、骨髓或细胞涂片滴加预冷的BFA固定液，4℃固定30～60s，稍水洗。
2、滴加配制好的POX孵育液，室温(20～25℃)避光孵育10～15min，水洗2min。
3、滴加WG染色液，孵育30～60s。
4、直接滴加等量WG buffer，染色10～15min。
5、水洗、晾干、镜检。
染色结果：POX活性部位棕黄色细胞核蓝色粒细胞系除早期原粒细胞阴性外，分化好的原粒细胞以下阶段细胞随细胞成熟而阳性反应增强，衰老中性粒细胞反应程度减弱单核细胞系弱阳性，淋巴细胞系为阴性。
浆细胞及巨核细胞均为阴性。
Western blot发光检测中常见的问题及解决方法
Western blot发光检测中常见的问题及解决方法免疫印迹试验（Western blot）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。
其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL，文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。
众所周知，Western blot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。
拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。
在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。
Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。
大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。
ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（lumino，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。
ECL法操作简便，应用现成的试剂盒，按照说明，将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影、定影（或用荧光检测仪检测）。
ECL 法具有灵敏度高，线性范围广等特点。
图1 ECL检测原理图Western blot发光检测受多种因素影响，主要包括：抗原含量，抗体敏感度，底物敏感度，显影和定影效率，等。
现根据检测中几种常见的现象问题进行分析：1.目的蛋白信号弱或无。
在Western blot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。
首先考虑是否转膜不充分/过转，如果是，则要优化转膜条件；其次，在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。
过氧化物酶封闭液(H2O2法)
北京雷根生物技术有限公司
过氧化物酶封闭液(H 2O 2法)
简介：
在免疫组化染色中，如果组织内存在相同的内源酶，应抑制内源性酶活性，不能让其加入底物的反应体系，以免影响标记的效果。
过氧化物酶反应的最佳pH 值是5，但pH=5.0时反应产物常常比较粗糙，因此在免疫组化染色中常使用pH6.0～7.6以延缓反应，使反应产物颗粒变小。
在免疫组化染色前需要抑制内源性过氧化物酶的活性，以便去除非特异性结合反应。
Leagene 过氧化物酶封闭液(H 2O 2法)由低浓度H 2O 2、磷酸盐等组成，能够很好的非特异性结合反应，尤其适用于封闭内源性过氧化物酶的活性。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 切片贴于玻片上，用PBS 轻轻清洗。
2、 将玻片吸干或吹干，入过氧化物酶封闭液，孵育。
3、 无需清洗，直接将玻片吸干或吹干。
4、 在未标记的一抗中孵育。
注意事项：
1、 一经开启，立即使用，防止有效成分挥发。
2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
相关：
编号 名称 IH0111 Storage 过氧化物酶封闭液(H 2O 2法) 100ml RT 使用说明书 1份
编号 名称
CA0075 青霉素-链霉素混合溶液(100×双抗)
DH0006 苏木素伊红(HE)染色液
TO1013 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA 比色法)。
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
ACK ——照光对照管的吸光度。
AE ——样品管的吸光度。
Vt ——样品液总体积，mL。
V1 ——测定时样品用量，mL。
W——样品鲜重，g。
蛋白质含量单位为mg/g。
过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反响溶液吸光度(A240)随反响时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【试剂】0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液：取A液91.5ml，B液8.5ml,充分混合。
0.1mol/L H2O2以30%的过氧化氢稀释(30*1.1g/34.01)mol/100ml=9.7mol/L,取0.52ml 30%的过氧化氢稀释到50ml.1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，参加2ml 4℃下预冷的pH7.8磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，再用缓冲液冲洗研钵数次定容至25ml，合并冲洗液，混合均匀后置于5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃下保存备用。
2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2顺序参加试剂。
表2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
3.结果计算：以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位〔u〕。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=式中：POD总活性以酶单位每克鲜重表示。
其中△470=ACK-AE 比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
ACK ——照光对照管的吸光度。
AE ——样品管的吸光度。
Vt ——样品液总体积，mL。
V1 ——测定时样品用量，mL。
W——样品鲜重，g。
蛋白质含量单位为mg/g。
所需试剂的配制A液：0.2 mol/L Na2HPO4-12 H2O 71.64g定容至1000mlB液：0.2 mol/L NaH2PO4-2H2O 31.2g定容至1000ml1、超氧化物歧化酶SOD活性测定0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)取A液228.75ml，B液21.25ml定容至1000mL。
过氧化物酶(POX)染色液(化学染色法)
（19）中华人民共和国国家知识产权局（12）发明专利申请（10）申请公布号CN103884563A（43）申请公布日 2014.06.25（21）申请号CN201410142884.4（22）申请日2014.04.10（71）申请人上海太阳生物技术有限公司地址201108 上海市闵行区金都路3419号（72）发明人谢永华;朱美萍;许付;季娜（74）专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司代理人赵青朵（51）Int.CI权利要求说明书说明书幅图（54）发明名称过氧化物酶(POX)染色液(化学染色法)（57）摘要本发明属于医学体外诊断领域，公开了一种过氧化物酶的染色液。
本发明所述染色液包括显色剂、过氧化物、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮和环丙沙星；所述显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺或其酸式盐。
本发明采用1,3-二甲基-2-咪唑烷酮作为显色剂的溶剂，提高了染色液的稳定性和检测灵敏度；采用环丙沙星作为稳定剂，能够使显色剂和过氧化物长期稳定共存于缓冲液中。
本发明染色液增强了染色液的稳定性，降低了背景颜色，可室温放置，多次使用，试剂安全简单，无生物有害性和毒性，且测定时灵敏度较高，广泛适合于临床血细胞内过氧化物酶的染色测定。
法律状态法律状态公告日法律状态信息法律状态2014-06-25公开公开2014-07-16实质审查的生效实质审查的生效2016-08-17授权授权权利要求说明书过氧化物酶(POX)染色液(化学染色法)的权利要求说明书内容是....请下载后查看说明书过氧化物酶(POX)染色液(化学染色法)的说明书内容是....请下载后查看。
蛋白实验技术——免疫组化实验步骤
蛋白实验技术——免疫组化实验步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉。
2. 水浴锅。
（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB，ph6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH调至ph8.0，加水至1000ml。
4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris 碱，用1N的HCl调至ph8.0，加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS（PBS）配制。
8．TBS/PBS PH9.0–9.5，适用于荧光纤维镜标本；ph7.0-7.4适合光学纤维标本。
（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复：在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
免疫组化主要步骤
免疫组化主要步骤1. 洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。
2. 包埋组织:先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
3. 切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5µm,如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40°C温水中。
4. 捞组织：当组织载玻片置于40°C温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37°C温箱中烘干。
5. 脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.6. 抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
免疫组化 双氧水封闭目的
免疫组化双氧水封闭目的免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种常用的实验技术，用于检测组织切片中特定抗原的存在和分布情况。
在进行免疫组化实验时，为了确保结果的准确性，常常需要进行双氧水封闭处理。
双氧水封闭的主要目的是通过抑制内源性过氧化物酶的活性，减少组织中的内源性过氧化物对抗体的非特异性结合。
具体来说，双氧水可以通过氧化还原反应，将过氧化物酶（如过氧化氢酶）中的过氧化氢转化为氧气和水，从而降低其活性。
这样一来，组织中的内源性过氧化物酶对抗体的非特异性结合就会减少，提高免疫组化结果的特异性和准确性。
双氧水封闭的步骤相对简单，一般可分为以下几个步骤：1. 准备工作：首先，需要将组织切片固定在载玻片上，并进行脱水和去蜡处理，以确保组织切片的完整性和可靠性。
2. 双氧水处理：将含有双氧水的缓冲液倒入装有组织切片的瓶中，使其完全浸没在液体中。
然后，将瓶放入恒温器中，在适当的温度下进行反应。
一般来说，反应时间为10-30分钟，具体时间可以根据实验需要进行调整。
3. 清洗步骤：双氧水反应结束后，需要将组织切片从瓶中取出，并进行充分的清洗。
可以使用含有洗涤剂的缓冲液进行多次洗涤，以去除残留的双氧水和其他杂质。
4. 下一步处理：完成双氧水封闭后，可以进行后续的免疫组化实验步骤。
例如，可以进行抗体的孵育、二级抗体的结合、显色反应等。
需要注意的是，双氧水封闭的具体条件和步骤可能会因实验目的、抗体选择和组织类型等因素而有所不同。
因此，在进行实验前，需要根据具体情况进行优化和调整。
双氧水封闭作为免疫组化实验中的重要步骤，可以有效地降低非特异性结合，提高检测的特异性和准确性。
在进行免疫组化实验时，科研人员应根据具体情况合理选择抗体和优化实验条件，以确保实验结果的可靠性和准确性。
同时，充分了解和掌握双氧水封闭的原理和步骤，对于正确进行免疫组化实验也具有重要意义。
辣根过氧化物酶及其使用介绍
辣根过氧化物酶及其使用介绍酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。
酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。
酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。
酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。
目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。
高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。
在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
(一) 酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。
但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。
目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。
HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。
酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm 的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。
RZ值越小，非酶蛋白就越多。
值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
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过氧化物酶封闭液(H 2O 2法)
简介：
在免疫组化染色中，如果组织内存在相同的内源酶，应抑制内源性酶活性，不能让其加入底物的反应体系，以免影响标记的效果。
过氧化物酶反应的最佳pH 值是5，但pH=5.0时反应产物常常比较粗糙，因此在免疫组化染色中常使用pH6.0～7.6以延缓反应，使反应产物颗粒变小。
在免疫组化染色前需要抑制内源性过氧化物酶的活性，以便去除非特异性结合反应。
Leagene 过氧化物酶封闭液(H 2O 2法)由低浓度H 2O 2、磷酸盐等组成，能够很好的非特异性结合反应，尤其适用于封闭内源性过氧化物酶的活性。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 切片贴于玻片上，用PBS 轻轻清洗。
2、 将玻片吸干或吹干，入过氧化物酶封闭液，孵育。
3、 无需清洗，直接将玻片吸干或吹干。
4、 在未标记的一抗中孵育。
注意事项：
1、 一经开启，立即使用，防止有效成分挥发。
2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
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TO1013 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA 比色法)。