染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀（chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种将DNA和相应的转录因子组装到染色质上的一项技术，可用于彻底研究基因表达调节机制。
1. 什么是染色质免疫共沉淀？染色质免疫共沉淀（ChIP）是一种将DNA和相应的转录因子组装到染色质上的实验方法，用于研究染色质的结构和功能，进而理解基因的表达如何受调控。
它是一种特别有效的去解析染色质和基因表达调节之间的联系的方法，被用于通过生物信息学等方法，研究基因表达调节的蛋白质组织关系。
2. 染色质免疫共沉淀的原理染色质免疫共沉淀的技术根据抗体结合模式可以分为单克隆抗体和聚合物抗体两种，单克隆抗体结合定向抗原，可以较好地用于基因组定点分析，它通过固定DNA模板和抗原抗体相互作用将它们结合到一起，再行沉淀，从而获取DNA模板及其相互作用位点。
聚合物抗体可以扩大辨识特异性，能够克服单克隆抗体的特异性限制，可应用于普适性抗原，可以用于核组学分析，利用共沉淀的方法结合PCR的扩增效应，将小量的DNA模板复制成更多的DNA碱基，以能够清晰地获得与染色质有关的重要信息。
3. 染色质免疫共沉淀的步骤染色质免疫共沉淀的步骤主要有：细胞培养分离、肽激活细胞和抗体免疫沉淀、PCR扩增、核酸电泳分析、数据分析。
首先，要进行细胞培养，用适当的分离方法分离出细胞，接着，激活肽将细胞激活，以提高活细胞中的蛋白质和DNA的表达、组装以及相互作用；然后，添加抗体，抗体结合模板和相应的转录因子，这样可以将抗体和DNA-转录因子复合物结合在一起，继而进行沉淀；接着，将沉淀物进行PCR 扩增，从而将少量的模板复制成多份；接着，使用DNA电泳分析来检测分析结果；最后，利用生物信息学对实验测得的数据进行分析，探索调节染色质和基因表达的蛋白质组织关系及其机制。
以上就是染色质免疫共沉淀的实验步骤。
4. 染色质免疫共沉淀的应用染色质免疫共沉淀在生物学研究方面具有重要的应用价值，在基因组学、核组学、基因表达分析、生物信息学、代谢组学、表观遗传学等方面有着广泛的应用，可用于研究染色质结构，探索基因组变异，鉴定并且定位生物体内转录因子等，是一项重要的新技术。
染色质免疫共沉淀测序技术
染色质免疫共沉淀测序技术
染色质免疫共沉淀测序技术（ChIP-seq）是一种用于研究基因组中蛋白质与DNA相互作用的高通量测序技术。
该技术可以帮助我们了解基因表达、转录调控、染色质结构和功能等方面的信息。
在ChIP-seq技术中，首先需要将某种特定的蛋白质与DNA结合，然后使用抗体将这种蛋白质与DNA复合物捕获下来。
接着，将复合物中的DNA分离出来，并进行高通量测序。
最后，通过对测序结果的分析，可以确定蛋白质与DNA结合的位置和数量，从而了解染色质结构和功能的相关信息。
ChIP-seq技术的应用非常广泛。
例如，可以用于研究转录因子与DNA结合的位置和数量，从而了解基因的转录调控机制。
此外，还可以用于研究组蛋白修饰与基因表达的关系，以及研究染色质结构和功能的变化与疾病的关系等。
虽然ChIP-seq技术具有很多优点，但也存在一些局限性。
例如，该技术需要使用抗体来捕获蛋白质与DNA复合物，因此需要选择合适的抗体，并且可能存在抗体特异性和交叉反应的问题。
此外，该技术也存在一定的误差和假阳性率，需要进行严格的数据分析和验证。
总的来说，ChIP-seq技术是一种非常有用的高通量测序技术，可以帮助我们了解基因组中蛋白质与DNA相互作用的信息，从而深入研
究基因表达、转录调控、染色质结构和功能等方面的问题。
随着技术的不断发展和完善，相信ChIP-seq技术将在生命科学研究中发挥越来越重要的作用。
ChIP实验精讲(做科研的必看)
ChIP实验精讲(做科研的必看)染色质免疫共沉淀（ChIP）概述ChIP：chromatinimmunoprecipitation assay，染色质免疫沉淀技术。
研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法原理在活细胞状态下固定“蛋白质-DNA”复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
ChIP应用1、检测体内反式因子与DNA的动态作用，研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系；2、CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-ChIP 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；3、CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；4、RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
试验流程一、交联染色质免疫沉淀技术1. 细胞甲醛交联和收集注意事项：①需要优化甲醛使蛋白质和DNA交联的时间。
②交联的时间很关键。
交联的时间一般为2-30 分钟。
③交联过度会降低抗原的可结合性和超声的效率，也会被遮盖抗原的表位。
④甘氨酸可抑制甲醛的作用，终止交联反应。
1.1 取1直径10cm培养皿的细胞。
加入甲醛至终浓度为0.75%（V/V），使蛋白和DNA 交联。
1.2 室温下，轻摇10 分钟。
1.3 加入甘氨酸至终浓度为125 mM，室温下放置5 分钟，以终止交联。
1.4 吸去培养基，用冰冷PBS 洗细胞2 次。
1.5 使用细胞刮刀，加入5ml 冰冷PBS，刮下细胞，收集至一个50 ml 离心管中。
1.6 再用 3 ml 冰冷PBS 洗培养皿2次，至50ml 离心管中。
1.7 4℃，1000 g，离心5分钟收集细胞。
1.8 吸弃上清，用SDSLysis Buffer重悬沉淀（每1 X 107 个细胞加800 μl）。
02 CHIP染色质免疫共沉淀实验方法简介
Ago----argonaute蛋白
谢 谢！
概述 原理 方法 比较 举例
Saleh A, Alvarez-Venegas R, Avramova Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 2008;3(6):1018-1025.
概述
原理 染色质免疫沉淀实验(CHIP)
方法 比较
举例 ➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要 工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋 白与特异DNA 片段的结合情况，还可以 用来研究组蛋白与基因表达的关系。
概述
原理 CHIP原理
方法
比较 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物
举例
将其随机切断为一定长度范围内的染色质
概述
原理 应用举例
方法
比较
举例
Mantovani F, Tocco F, Girardini J, et al. The prolyl isomerase Pin1 orchestrates p53 acetylation and dissociation from the apoptosis inhibitor iASPP. Nat Struct Mol Biol. 2007 Oct;14(10):912-920.
方法
比较
举例
条 超声波破碎条件的选择
件 选
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
照 设
阳性对照：如组蛋白抗体
置 阴性对照：阴性引物
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是一种广泛应用于生物学研究的技术，它可以用来检测蛋白质与染色质之间的相互作用。
该技术能够帮助研究人员确定蛋白质在基因表达中的作用，以及探究细胞的调节机制。
本文将详细介绍染色质免疫共沉淀技术的原理、步骤、优缺点和应用。
一、原理染色质免疫共沉淀技术是基于抗体特异性识别蛋白质的原理。
在该技术中，首先将抗体与磁珠或琼脂糖等载体结合，形成免疫复合物。
接着，将该免疫复合物加入到含有细胞或组织的裂解液中，使其与目标蛋白结合。
随后，使用磁力或离心等手段将免疫复合物与与其结合的蛋白、核酸等分离出来。
最后，利用PCR、微阵列芯片等技术对分离出来的蛋白、核酸等进行检测和分析。
二、步骤染色质免疫共沉淀技术的步骤主要包括：1. 细胞或组织的裂解：将细胞或组织加入到含有蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、盐和缓冲液等的裂解液中，使其破裂并释放出蛋白、DNA等。
2. 免疫复合物的制备：将抗体与磁珠或琼脂糖等载体结合，形成免疫复合物。
3. 免疫复合物与目标蛋白的结合：将免疫复合物加入到裂解液中，与目标蛋白结合。
4. 免疫复合物的分离：使用磁力或离心等手段将免疫复合物与与其结合的蛋白、核酸等分离出来。
5. 分析：利用PCR、微阵列芯片等技术对分离出来的蛋白、核酸等进行检测和分析。
三、优缺点染色质免疫共沉淀技术具有以下优点：1. 高特异性：该技术可以通过抗体特异性识别蛋白质，具有高特异性。
2. 高灵敏度：该技术可以检测到极低浓度的蛋白质。
3. 可重复性：该技术具有较高的可重复性，可以用于多次实验。
4. 可广泛应用：该技术可以应用于不同种类的细胞和组织。
然而，染色质免疫共沉淀技术也存在以下缺点：1. 受抗体质量限制：抗体的质量、特异性和亲和力等因素会影响该技术的结果。
2. 受组织分解程度限制：组织分解不彻底会导致目标蛋白无法完全释放，从而影响该技术的结果。
3. 受背景干扰影响：免疫复合物的制备和分离过程中，可能会出现背景干扰，影响结果的准确性。
染色体免疫共沉淀介绍
ChIP的一般流程： ChIP的一般流程： 的一般流程
甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎--甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎--加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合 加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合 物相互结合---加入Protein A，结合抗体物相互结合---加入Protein A，结合抗体-靶 蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的 蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的 复合物进行清洗，除去一些非特异性结合--复合物进行清洗，除去一些非特异性结合--洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解 洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解 交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。 交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。
染色体免疫共沉淀的应用
CHIP可以检测体内反式因子与DNA的动态作用 CHIP可以检测体内反式因子与DNA的动态作用 CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围： CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围： CHIP与基因芯片相结合建立的 CHIP-on-chip方法 CHIP与基因芯片相结合建立的 CHIP-on-chip方法 已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选； CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的 CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的 体内结合位点； RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作 RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作 用
染色体免疫共沉淀的应用
采用结合微阵列技术在染色体基因表达调 控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、 心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病 的主要代谢通路的一种非常有效的工具。 表观遗传学的研究 转录因子的结合和条件特异性；用来研究 组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系， 组蛋白修饰蛋白和染色体重建。
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是一种常用的分子生物学技术，也是
研究细胞基因组结构和功能的重要方法。
该技术可以用来鉴定某个转录因
子或其他核蛋白与某个特定DNA序列的结合关系，从而确定这个DNA序列
在基因表达调控中的重要性。
该技术包括以下步骤：（1）交联；（2）裂解；（3）免疫沉淀；（4）洗涤；（5）离解交联；（6）DNA提取。
在这个过程中，首先将细胞进行交联，使得染色质固定在原位。
之后，将染色质进行裂解并进行免疫沉淀，这里是将特定的抗体与目标蛋白质结合，从而使得目标蛋白质与某些DNA序列结合，并保持在染色质中。
然后
对免疫沉淀后的复合物进行洗涤，去除杂质物质，以提高免疫沉淀的特异
性和纯度。
之后，对免疫沉淀后的复合物进行离解交联，使免疫沉淀的蛋
白质与DNA分别被分解为单独的分子。
最后，从免疫沉淀复合物中提取DNA，用于进一步的分析，例如PCR扩增、Southern blotting、测序等。
该技术的优点是可以在整个基因组范围内寻找目标DNA序列的结合蛋白，相对快速、成本低、灵敏度高，并且可以直接从原位染色质富集DNA
序列。
缺点是免疫沉淀的特异性和纯度可能受到影响，需要对实验进行严
谨控制。
CHIP(染色质免疫共沉淀)
一、超声剪切染色质1.用37℃预温的1%PFA固定10-20min，使DNA与蛋白质交联2.终止交联，加入终浓度为0.125M的甘氨酸3.用预冷的PBS洗2次4.用PBS将细胞刮下（5mlPBS+1mMPMSF+1mg/ml抑肽酶）5.4500rpm5min（此阶段细胞沉淀可储存于-80℃）6.弃上清，按200ul/106个细胞加入SDS lysis buffer（现加PMSF&coktail），冰上10min（4℃rotation 30min）7.27G针头注射器吹打3遍，若有气泡离心8.超声：不可有气泡，超两次后放到冰上9.离心：4℃，12000rpm，20min，上清转移到15ml离心管二、Ab沉淀目的染色质1.用dilution buffer稀释至1ml2.取50ul Input（也可取少量做lgG阴性对照，RNaseⅡ阴性对照）备注：取450ul做lgGcontrol，剩余500ul3.剩下的加一抗（5ul/ml），4℃rotate过夜4.向样品中加入50ul ProteinA+Gbeads，4℃rotate2h，之后可在冰上沉淀一会5.离心，1000rpm1min，留上清6.洗珠子，1ml/5min/次，在4℃rotate，再在冰上静置5min，1000rpm1min。
洗涤顺序为：低盐溶液→高盐溶液→LicL（之前在4℃）→TE→TE（室温）三、去除蛋白质1.Elution buffer（1%SDS、0.1MNaHCO3；0.5gSDS，0.42gNaHCO3 in 50ml ddH20）+250uL RT15min rotate →离心1000rpm1min→上清（收集）→+250ulRT 10min →金属65℃5min→上清（收集）2.上清+20ul5M NaClInput+450ul elution buffer+20ul 5M NaCl65℃6-7h或过夜3.10ul0.5MEDTA,20ul1MTris-HCl +2ul 10mg/ml 蛋白酶K（50℃1h）？四、提纯DNA1.加等体积（500ul）Tris-饱和酚，剧烈混匀，14500rpm10min，取上清，加入500ulCHCl3混匀后14500rpm10min，取上清后再加入tRNA60ug （200ug/ml，3ul），加异丙醇500ul，离心14500rpm20min 弃上清2.加70%酒精洗一遍，14500rpm5min，（要去掉上清，先倒掉，倒掉之后离心一下再扔掉液体）将管子倒扣空气晾干。
染色质免疫共沉淀原理
染色质免疫共沉淀原理
染色质免疫共沉淀（ChIP）是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的技术。
该技术利用抗体特异性地结合目标蛋白质，然后通过共沉淀的方式将与该蛋白质结合的DNA分离出来，从而研究蛋白质与DNA的相互作用。
在染色质免疫共沉淀技术中，首先需要对目标蛋白质进行抗体的制备。
然后将细胞或组织样品进行交联，使得蛋白质与DNA之间的相互作用得以保留。
接着，将交联后的样品进行裂解，使得细胞核内的DNA暴露出来。
然后，将抗体与样品混合，使得抗体能够特异性地结合目标蛋白质。
随后，将混合物进行共沉淀，使得与目标蛋白质结合的DNA能够被分离出来。
最后，通过PCR、测序等方法对分离出的DNA进行分析，从而研究蛋白质与DNA的相互作用。
染色质免疫共沉淀技术在生物学研究中有着广泛的应用。
例如，该技术可以用于研究转录因子与DNA的相互作用，从而揭示基因调控的机制。
此外，该技术还可以用于研究组蛋白修饰与DNA的相互作用，从而揭示染色质结构与功能的关系。
此外，该技术还可以用于研究病原微生物与宿主细胞的相互作用，从而揭示病原微生物的致病机制。
染色质免疫共沉淀技术是一种重要的生物学研究技术，可以用于研究蛋白质与DNA的相互作用，从而揭示生物学过程的机制。
染色质免疫共沉淀结果解析
染色质免疫共沉淀结果解析
染色质免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的分子生物学技术，用于检测特定蛋白质与基因组DNA的相互作用。
通过该技术，可以确定某种特定的蛋白质是否与某一特定的DNA序列结合，并能够分析这种结合的模式和位置。
ChIP的实验步骤大致分为以下几步：交联、裂解、抗体免疫沉淀、洗涤和提取。
其中，交联是将细胞中的蛋白质与DNA“固定”在一起，裂解则是将细胞核内的染色质分解成小碎片以便于后续的操作。
抗体免疫沉淀是利用特定的抗体将要检测的蛋白质与DNA结合物质
免疫沉淀出来，洗涤则是将非特异性的蛋白质和DNA从结合物质中洗去，提取则是将免疫沉淀得到的物质提取出来以便于后续的分析。
对于ChIP实验的结果解析，需要进行数据处理和分析。
最常用
的方法是将ChIP所得的DNA片段进行PCR扩增，然后进行基因测序
和比对分析。
通过对比对结果的分析，可以确定特定的蛋白质与DNA 序列的结合情况，并确定它们的相互作用模式和位置。
另外，还可以利用一些计算机软件如MACS和HOMER等进行数据处理和分析，以及
进行统计学分析和可视化展示。
综上所述，染色质免疫共沉淀技术是一种重要的分子生物学技术，能够帮助我们了解蛋白质与DNA相互作用的模式和位置，从而为后续的基因功能研究和临床诊断提供重要的参考依据。
- 1 -。
chip protocol
染色质免疫沉淀技术染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,简称ChIP)是由 现任生化系主任的尚永丰教授于2000年首先创立的，它是一种检测蛋白质与DNA 间的相互作用的新技术。
在基因转录调控中，转录因子及转录调节因子与染色体DNA （多数是启动子区）之间存在结合作用，由于缺乏（尤其是在活体情况下）检测这种结合作用的技术，尚永丰教授等人结合免疫沉淀和定量PCR 两项实验技术从而产生ChIP 技术。
该技术不仅可以出鉴定某转录因子与启动子的直接和间接结合作用，而且可以半定量测定转录因子与DNA 结合的丰度。
利用ChIP 的衍生技术，可以检测在某一特异启动子上转录因子间的相互作用（RE-ChIP ）,可以检测有RNA 剪接作用的蛋白质与mRNA 的结合作用（RNA Immunoprecipitation ）,还可以筛选某些特异的启动子序列（ChIP on ChIP ）。
ChIP 技术基本原理如下：首先用甲醛固定活细胞，生理状态下结合的蛋白质－DNA 复合物呈交联状态，不会因为细胞裂解、超声和沉淀等步骤被破坏;超声将DNA 打断成一定大小的片断;用目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀该蛋白质－DNA 复合物;复合物65℃解交联，分离纯化DNA;用针对某DNA 片断设计的引物对该DNA 片断进行PCR 分析；如果PCR 扩增出阳性条带，则可说明该蛋白质与DNA 之间存在相互作用。
具体操作步骤如下：① 将细胞（如MCF-7）接种于10cm 培养皿中，用含10%碳素-葡聚糖处理过的胎牛血清的培养液培养3天后，细胞长至95％汇合状态，用200nM 的雌二醇处理适当时间。
② 用室温预热的PBS 洗细胞1－2次，然后用1%的福尔马林（用PBS 配制）37℃处理10 min 。
③ 用冰冷的PBS 清洗细胞两次，然后用细胞刮子移入1mL 冰冷的PBS 中，4℃离心3000rpm ，2min, 弃上清。
染色质免疫共沉淀(ChIP)实验
染色质免疫共沉淀（ChIP）染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。
1实验方法原理：在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
2实验材料、试剂、仪器耗材：细胞样品甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒等离心管、超声仪、电泳仪、离心机等3实验步骤：一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。
2. 37℃孵育10 min。
3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。
450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5 min即可。
4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。
预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。
6. 倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。
这样每100 ul溶液含1×106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。
本次细胞长得约为80%。
即为4×106个细胞。
因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。
染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀（CHIP）实验原理染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。
它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
染色质免疫沉淀实验原理示意图ChIP的一般流程：甲醛处理细胞→收集细胞，超声破碎→加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合→加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀→对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合→洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物→解交联，纯化富集的DNA-片断→PCR分析。
第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎1、取一平皿长满的细胞（10 cm平皿），加入终浓度为1%的甲醛溶液（在9 ml培养液中加入243 μl 37%甲醛）。
2、37℃培养10 min。
3、终止交联加甘氨酸至终浓度为0.125 M。
450 μl 2.5 M甘氨酸溶液于平皿中。
混匀后，在室温下放置5 min即可。
4、吸尽培养基，用预冷的PBS溶液清洗细胞2次。
5、收集细胞于15ml离心管中（如果细胞贴壁，可以使用细胞刮刀，PBS溶液体积依次为5ml，3ml和3ml）。
预冷后2000 rpm 5 min收集细胞。
免疫沉淀、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀
免疫沉淀是指用抗体把抗原（包括单体、复合物）沉淀下来，是一种抗原纯化、浓集的方法；免疫共沉淀指用抗体把抗原复合物沉淀下来，常用来研究蛋白质的相互作用免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
基本实验步骤（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心 5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。
在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外，最为关键的是裂解液的成份。
双荧光素酶染色质免疫共沉淀PPT
双荧光素酶染色质免疫共
05 沉淀实验注意事项与优化 建议
实验注意事项
确保样本质量
在实验前应确保样本质量，避免使用 过期或污染的试剂和材料。
防止交叉污染
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感谢您的观看
DNA序列。
在双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验中，染色质免疫共沉淀技术用于分 离与目的蛋白相互作用的DNA序列，以便进一步分析目的蛋白的转录调 控作用。
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验的原理
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验是一种用于研究目 的蛋白对基因转录调控影响的实验方法。
输标02入题
该实验通过将荧光素酶标记的目标蛋白与细胞核提取 物中的DNA结合，然后利用染色质免疫共沉淀技术将 目标蛋白与DNA复合物分离出来。
免疫共沉淀
利用特定的抗体与染色质中的目标蛋白质或DNA片段进行特异性结合，实现目 标分子的富集。
荧光检测与分析
荧光检测
利用荧光检测仪器检测荧光信号，获 取目标分子在染色质中的定位和表达 情况。
结果分析
对荧光信号进行分析，解读实验结果， 并进一步探讨基因表达调控机制。
04 双荧光素酶染色质免疫共 沉淀实验结果分析
01
03
通过比较不同条件或处理下目标蛋白与DNA结合的情 况，可以研究目的蛋白对基因转录的调控作用。
04
在分离出的复合物中，荧光素酶标记的目标蛋白能够 催化荧光素酶底物发出荧光，从而对目标蛋白进行检 测和定量分析。
03 双荧光素酶染色质免疫共 沉淀实验步骤
细胞培养与处理
细胞培养
选择适当的细胞系，在适宜的培 养条件下进行培养，确保细胞生 长旺盛。
染色质免疫共沉淀 内参基因
染色质免疫共沉淀内参基因染色质免疫共沉淀（ChIP）是用来研究蛋白质与染色质相互作用的一种实验技术，通过利用特异性抗体来富集与目标蛋白质结合的染色质片段。
然而，在进行ChIP实验时，需要使用内参基因来进行标准化和校正实验结果，以确保实验的准确性和可靠性。
内参基因是指在特定条件下表达稳定、不受外界因素干扰的基因。
在ChIP实验中，内参基因被用来标准化目标基因的富集水平，以消除实验中可能出现的误差。
下面将从内参基因选择、内参基因验证及常用内参基因几个方面来详细探讨。
一、内参基因选择选择适当的内参基因是进行ChIP实验的关键步骤之一。
一个理想的内参基因应具备以下特点：1. 稳定的表达水平：内参基因的表达水平应在不同样品、不同处理条件下保持稳定，不受干扰因素的影响。
这可以通过实时定量PCR （qPCR）或基因芯片技术来评估基因的表达稳定性。
2. 细胞类型特异性：内参基因的表达水平应在所研究的细胞类型中具有一定特异性，并且不受目标蛋白质结合与浓度的影响。
这可以通过在不同细胞类型中进行实时定量PCR检测来评估。
3. 控制组条件下表达水平不变：在ChIP实验中，常常需要对比不同样品或处理条件下的富集水平。
因此，内参基因的表达水平应在不同组别条件下保持相对稳定，以确保实验结果的可比较性。
根据以上的特点，常用的内参基因包括GAPDH、ACTB、GUSB等，这些基因的表达水平通常在不同细胞类型和处理条件下比较稳定，且与ChIP实验中的目标基因的结合无关。
二、内参基因验证为确保选择的内参基因在实验条件下满足稳定性和特异性等要求，进行内参基因验证是必要的。
验证内参基因的常用方法有：1. 实时定量PCR：通过实时定量PCR测定一系列候选内参基因的表达水平，根据表达的稳定性和特异性选择最合适的内参基因。
在实验中，可以根据ChIP-qPCR的结果及对应内参基因的表达情况，评估其在ChIP实验中的可靠性。
2. 基因芯片技术：利用基因芯片技术可以同时检测大量基因的表达水平，对于内参基因的选择具有更高的精确性和鉴定能力。
染色质免疫共沉淀技术 终
姓名学号2013224010005 2013224010035 2013224010013 2013225010014 2013224010040染色质免疫沉淀法功能基因组学（Functional genomics）研究内容是人类基因组DNA序列变异性研究、基因组表达调控的研究、陌生生物体的研究和生物信息学的研究等。
目前功能基因组学的研究策略包括以下4个方面：1）建立表达图谱 2）随机突变筛选3）定向诱变 4）生物信息学研究.经典的技术在大量未知基因的研究中具有局限性，目前，一些新技术包括生物芯片、基因敲除(knock out)、转基因（knock in）、RNA干扰（RNAi）以及蛋白质组学研究中的各种技术，在功能基因组学研究中发挥越来越重要的作用。
本文就近几年来功能基因组学染色质免疫共沉淀技术（ChIP）方法的一些进展作简单介绍。
【概念】染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具[1]。
它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。
核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，这些共价修饰与真核基因的表达密切相关。
根据“组蛋白密码”假说，组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能，因此，ChIP也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。
【背景】真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响的，所有信号传递途径的终点都是DNA。
DNA通过核蛋白复合物组成染色质，染色质是基因调控的一个重要作用位点。
转录激活因子和辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制--“组蛋白密码”，其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。
该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。
染色质免疫共沉淀原理
染色质免疫共沉淀原理染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）是一种用于研究染色质中蛋白质-DNA相互作用的重要技术。
通过ChIP技术，研究人员可以确定特定蛋白质与染色质中特定DNA序列的相互作用，从而揭示基因调控、表观遗传学和疾病发生发展等重要生物学问题的答案。
本文将从ChIP的原理、步骤和应用等方面进行详细介绍。
ChIP技术的原理主要基于抗体对特定蛋白质的高度选择性结合。
首先，细胞或组织被交联，使得蛋白质与DNA之间的相互作用得以保持。
然后，细胞或组织被裂解，染色质被剪切成小片段。
接着，使用特异性抗体结合目标蛋白质，形成抗体-蛋白质-染色质复合物。
随后，利用蛋白质A/G磁珠将复合物沉淀下来。
最后，通过逆交联和DNA纯化，得到与目标蛋白质结合的DNA片段。
这些片段可以进一步用于PCR、测序等分子生物学实验。
ChIP技术的步骤主要包括，交联、裂解、免疫共沉淀、逆交联和DNA纯化。
在实际操作中，研究人员需要选择合适的抗体、优化交联条件、确定最佳的裂解酶和免疫沉淀条件等。
此外，为了提高ChIP的特异性和灵敏度，还需要进行合适的对照实验和验证实验。
ChIP技术在生物学研究中有着广泛的应用。
首先，ChIP可以用于研究转录因子与染色质中特定启动子或增强子的结合情况，从而揭示基因的转录调控机制。
其次，ChIP还可以用于研究组蛋白修饰酶与染色质中特定组蛋白修饰的关系，从而揭示表观遗传学调控机制。
此外，ChIP还可以用于研究疾病相关基因的表达调控机制，为疾病的诊断和治疗提供重要信息。
总之，ChIP技术是一种重要的分子生物学技术，可以用于研究染色质中蛋白质-DNA相互作用。
通过ChIP技术，研究人员可以揭示基因调控、表观遗传学和疾病发生发展等重要生物学问题的答案。
随着技术的不断发展和完善，ChIP技术将在生物学研究中发挥越来越重要的作用。
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组织芯片/微阵列定制技术
实验技术：组织芯片(tissue chip)，也称组织微阵列 (tissue microarrays)，是生物芯片技术的一个重要分支，组织芯片技术是将几十至上千个小组织切片集中于一张载片上形成的缩微组织阵列，具有体积小、信息含量高、高效低耗和可比性强的优点。
该技术问世十余年以来以其大规模、高通量、标准化等优点得到大范围的推广应用。
组织芯片与基因芯片和蛋白质芯片一起构成了生物芯片系列，使人类第一次能够有效利用成百上千份组织标本，在基因组、转录组和蛋白质组三个水平上进行研究，被誉为医学、生物学领域的一次革命。
组织芯片技术可以与其他很多常规技术如免疫组织化学(IHC)、核酸原位杂交 (ISH)、荧光原位杂交(FISH)等方法结合应用，它的应用领域正在不断地拓展。
[晶莱生物]
实验操作流程：
制作组织芯片空心蜡模
利用组织芯片空心蜡模成型模具，一次成型制作组织芯片空心蜡模，具体操作如下：
1、将石蜡放入组织芯片制备系统熔蜡盘内加热熔化，熔蜡盘内放入一片适当大小的硬质光面塑料薄板。
将空心蜡模成型框大口朝下平放于熔蜡盘中的塑料薄板上，调整熔蜡盘内石蜡的量，使熔化石蜡平面高出空心蜡模成型框约2 mm。
2、将无刃阵列管针管口朝下放置于组织芯片制备系统加热板上预热（70 ℃）约10 min，平稳垂直插入上述空心蜡模成型框。
3、平稳移开熔蜡盘，室温冷却石蜡数分钟，熔蜡盘中石蜡呈半凝状态时，下压空心蜡模成型框活动顶板，使其贴近蜡模成型框。
4、用小刀将空心蜡模成型框四周石蜡划离，继续室温冷却石蜡数分钟，熔蜡盘中不再有任何能流动的液体状石蜡。
5、将熔蜡盘放回组织芯片制备仪上加温数秒钟，熔蜡盘底部石蜡开始熔化时迅速整体移除阵列管针、蜡模成型框、蜡模成型框内的蜡模。
6、插入阵列管针针芯，推出并去除进入阵列管针内的石蜡，拔除阵列管针针芯，去除蜡模成型框外部残留的石蜡。
7、使用组织芯片空心蜡模拔模装置，均匀拔除阵列管针，去除蜡模成型框活动顶板以及蜡模成型框周边残留的石蜡。
组织芯片空心蜡模制备完毕。
组织芯片空心蜡模无需从蜡模成型框中取出。
制作组织芯片石蜡块
1、目标组织定位：组织芯片供体蜡块常规病理切片1张，片厚4μm，常规HE染色后进行组织病理诊断阅片，在组织切片的指引下，对相应供体蜡块进行目标组织定位标记。
2、组织芯片蜡芯取材与点样：将蜡块放入适当温度的热水中预热软化片刻，应用组织芯片制备系统的芯片石蜡组织芯取样器钻取目标组织柱。
目标组织柱逐一点样于组织芯片空心蜡模中指定的位置。
用实心单针逐一将目标组织柱轻轻压平，使其处于同一切片平面。
将装满组织芯的蜡模平行移至一块薄铜板上，加热铜板数秒至贴近铜板的蜡模稍加熔化，迅速移除铜板，室温冷却数秒后去除铜板。
3、二次包埋组织芯片石蜡块：芯片组织面朝下，将点好样的组织芯片蜡块连同蜡模成型框放入盛有少量熔化石蜡的熔蜡盘中（熔化石蜡的深度约 4 mm），数秒种后即可肉眼观察到熔化的石蜡浸入到石蜡组织芯与蜡模孔的间隙。
移除熔蜡盘，将塑料石蜡包埋盒放于蜡模成型框上，用小勺舀取熔化的石蜡倒入包埋盒中，室温冷却数分钟，石蜡半凝状态时用小刀划离蜡模成型框周围的石蜡。
石蜡完全凝固后，复加热熔蜡盘移除二次包埋好的组织芯片石
蜡块。
4、去除蜡模成型框以及塑料石蜡包埋盒周边残留石蜡，轮流加热蜡模成型框四周边框，使紧贴其边框内侧的石蜡熔化，取出成型的组织芯片石蜡块。
根据不同的研究目的，将组织芯片石蜡切片铺于净洁的或经过其他特殊处理的载玻片上，继续应用于常规HE染色、免疫组织化学染色以及原位杂交等细胞学或分子生物学检测。
实验注意事项：
客户提供：
1、实验对象为组织样品，取适量（250~500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂，匀浆后抽提总蛋白。
2、实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂抽提总蛋白。
3、实验对象为血清，则直接进入步骤3。
交付标准：
1、芯片检测数据
2、完整的实验操作规程、实验报告（含软件分析结果）以及实验材料
3 优势
1)拥有专业病理诊断医师进行阅片，对原有诊断进行确认，并统一诊断标准。
2)做到切片及供体蜡块双标记，确保组织采样的准确性。
3)采用高品质进口预制备受体蜡块，点阵排列整齐美观，并有多种规格可以选择；进口专用石蜡热稳定性佳，能确保组织芯与受体蜡块结合紧密。
4)拥有专业的病理技术员进行切片，每张切片不漏点、跳点，最终提供组织阵列完整的切片〉15套。
4 内容
1)阅片服务
专业病理诊断医师进行阅片，并同步完成取样点标记，30元/例。
2）组织芯片蜡块制作
3）芯片蜡块切片
4）免疫组化染色
5）免疫组化染色结果判读
5 图例：
1 制备完成的组织芯片蜡块
2 完成切片及HE染色后的组织芯片。