黄曲霉毒素检测
黄曲霉毒素测定
产品号:#8030
测试前请仔细阅读本说明
Veratox○R
黄曲霉毒素定量测试盒
在2—8℃冷藏—不要冻结
黄曲霉毒素
黄曲霉毒素是一种剧毒且致癌的物质，它是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌A的某些菌株产生的。黄曲霉毒素有四种类型：B1，B2，G1和G2。黄曲霉毒素B1是毒性最大且最常有的。最容易产生黄曲霉毒素污染的物质是谷物、花生、棉子、高梁和大多数的树果。
动物食入过量黄曲霉毒素的影响从慢性健康直到死亡，已经证明黄曲霉毒素能引起肝损坏或癌症、降低奶和蛋的产出、免疫抑制和干扰再生效率。
美国食品药物管理局已经规定了食品和饲料中最大黄曲霉毒素限量。因此，准确测定黄曲霉毒素的含量，对于监测可能发生黄曲霉毒素污染的食品和饲料的质量来说，是非常重要的。测试程序包括仔细的采样、化学提取、卫生学评价和定量分析。
预期范围
本产品适用于如谷物、谷物粉、谷麦粉、谷物、大豆混合物、棉籽、棉籽粉、高梁、花生、爆花玉米、稻米、麦子、大豆粉和混合饲料等中黄曲霉毒素的定量检测。
预期用户
本测试盒可供质量控制人员和其它需了解可能受到黄曲霉毒素污染的食物和饲料的人员使用。由于技术很重要，所以操作者应接受Neogen代表培训，或由已接受过Neogen培训的人进行培训。
方法原理
本测试盒的测试原理是一种竞争性的直接酶联免疫吸附剂剂测试方法（ELISA），可准确检测出样品中ppb级的黄曲霉毒素。样品和标准控制液中游离的黄曲霉毒素与轭合物中的黄曲霉毒素竞争抗体结合位臵。清洗后，加入底物，底物与轭合物反应出现兰色，兰色越深表明黄曲霉毒素越少。将其臵于微型孔阅读器中可读出透光度，以控制标准液的透光度作标准曲线，将样品的透光度与标准曲线比较计算出样品中黄曲霉毒素的准确浓度。
黄曲霉毒素的检测
1 • B族：蓝色荧光
12
2
• G族：黄绿色荧光
ACCD PPT
黄曲霉毒素的种类及性质
生长温度
➢ 最低6-8℃，最高达44-46℃，32℃时黄曲霉 毒素B1的产量最高。
黄曲霉毒素的种类及性质
化学结构
➢ 结构类似，目前发现约20余种，已分离鉴定出12种： B1,B2,G1,G2,M1,M2,P1,Q,H1,GM,B2a和毒醇.
无关杂质
固相载体（凝胶）
③洗脱，将结合在抗体上的待测物冲洗下来 进入仪器检测
方法详解
操作中可能出现的问题及注意点
➢ 对照品溶液的配制 ➢ 取样 ：混匀，严格按要求取样，要有代表性 ➢ 提取 ：方式可比较后选择 ➢ 滤过 :普通滤纸有吸附，可采用玻璃纤维滤纸或离心
方法详解
操作中可能出现的问题及注意点
➢ 净化和富集
✓ 采用免疫亲和柱，柱子是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗 体固化在水不溶性的载体上然后装柱而成
✓ 原理：抗原、抗体反应， ✓ 注意点：澄清、含醇量、pH、流速、脱水
其它注意事项：亲和柱储存、使用温度，接头、容器 洗涤
方法详解
黄曲霉毒素标液
supelco
黄曲霉毒素的衍生化
衍生原因 ➢ B1、G1荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化 药典附录收载的两种衍生方法
历年中国药典标准收载状况
黄曲霉素检测法
食品中黄曲霉毒素的测定
—免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法
1 范围
本标准规定了免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度
法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。
本标准适用于玉米、花生及其制品（花生酱、花生仁、花生米）、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。
样品中黄曲霉毒素的检出限：免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法为1mg/kg；免疫亲和层析净化—荧光光度法测定酱油样品中黄曲霉毒素检出限为2.5mg/kg。
2 免疫亲和层析净化高效液相色谱法
2.1 方法提要
试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水或吐温/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。
2.2 试剂和溶液
除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。
2.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯
2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水
2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水
2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水
2.2.5 苯：色谱纯
2.2.6乙腈：色谱纯
2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯
2.2.8氯化钠（NaCl）
2.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4）
黄曲霉的检测方法
黄曲霉的检测方法
黄曲霉是一种常见的真菌，它能够在多种环境中生存并繁殖，包括食物、土壤和空气中。黄曲霉产生的黄曲霉毒素对人体健康有一定的威胁，因此对黄曲霉的检测非常重要。下面将介绍几种常用的黄曲霉检测方法。
1. 气相色谱法：气相色谱法是一种常用的检测黄曲霉毒素的方法。该方法将样品中的黄曲霉毒素提取出来，然后使用气相色谱仪进行分析。由于不同的黄曲霉毒素具有不同的化学性质，所以可以通过检测毒素的特定化合物来确定样品中是否存在黄曲霉毒素。
2. 高效液相色谱法：高效液相色谱法也是一种常用的检测黄曲霉毒素的方法。该方法将样品中的黄曲霉毒素提取出来，然后使用高效液相色谱仪进行分析。与气相色谱法相比，高效液相色谱法对样品的处理过程相对简单，分离效果较好。
3. 免疫学方法：免疫学方法是一种常用的检测黄曲霉的方法。该方法使用特异性抗体与样品中的黄曲霉结合，然后通过标记物的信号来检测黄曲霉的存在。常见的免疫学方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光法。免疫学方法具有操作简单、灵敏度高的特点，可以用于大规模的样品检测。
4. PCR法：PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的检测黄曲霉的方法。该方法利用黄曲霉的DNA进行扩增，并通过特定的引物和探针进行检测。PCR法具有高灵敏度、高特异性和高快速性的特点，可以快速检测出样品中的黄曲霉。
5. 传统培养法：传统培养法是一种直接检测黄曲霉的方法。该方法将样品培养在含有特定营养物质的培养基上，然后通过观察菌落形态、颜色和特点来确定是否存在黄曲霉。尽管传统培养法操作相对简单，但其结果需要较长时间才能得到。
玉米中的黄曲霉毒素及检测方法研究
玉米中的黄曲霉毒素及检测方法研究
黄曲霉毒素是玉米等粮食中常见的毒素之一，对人体健康造成严重危害。目前常用的
检测方法有生物法、物理法和化学法等，但存在着时间、精度等方面的限制。因此，本文
将探讨玉米中黄曲霉毒素及检测方法的研究。
一、黄曲霉毒素的形成与危害
黄曲霉是一种属于真菌门、革霉目、曲霉科的真菌，广泛分布于自然环境中的植物、
土壤和粮食中，尤其是在高温、高湿的环境下容易生长。当玉米等粮食被黄曲霉感染后，
黄曲霉会生成一系列的黄曲霉毒素，其中包括黄曲霉素、花生四环素等，这些毒素在人体
内会残留并危害健康。黄曲霉素被认为是一种致癌物质，具有诱导肝癌等多种癌症的危害；花生四环素则可以通过抑制DNA复制等方式干扰细胞分裂和增殖。
1.生物法
生物法检测黄曲霉毒素主要是通过对试样进行培养，并观察生长情况来确定样品是否
受到感染。其优点在于可以检测玉米中的各种毒素，但其缺点在于操作时间较长、精度不
高等。
2.物理法
3.化学法
化学法检测黄曲霉毒素主要是通过表面增强拉曼光谱、高效液相色谱、气相色谱等方法，利用化学分离和分析的原理确定样品中的毒素含量。其优点在于操作简便、精度高，
但其缺点在于对操作人员技术要求较高。
三、结论
玉米中的黄曲霉毒素是人们生活中不可忽视的问题，对其检测方法的研究也面临着更
高的要求。因此，在今后的研究中，应通过生物法、物理法和化学法等多种方法相结合，
提高检测效率、提高检测精度，从而更好地保障人们的健康。
黄曲霉毒素检测方法有什么
黄曲霉毒素检测方法有什么
现如今，人们的生活水平提高了，黄曲霉毒素在我们日常的生活中非常的常见，它是一组化学构造相似的化合物，黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。那么，黄曲霉毒素检测方法有什么？
黄曲霉毒素的检测方法：
1.生物鉴定法其特点是待检样品不需很纯，主要用于定性，共有10种:(1)抑菌试验;(2)对微生物遗传因子影响试验;(3)细菌发光试验;(4)荧光反应;(5)组织培养检测法;(6)鸡胚试验;(7)鸭胚试验;(8)鳟鱼试验;(9)植物试验;(10)饲喂实验动物试验。生物鉴定法是利用AFT能影响微生物、水生动物、家禽等生物体的细胞代谢，来鉴定AFT的存在。其方法专一性差，灵敏度低，一般只作为化学分析法的佐证。
2.化学分析法最常用的为薄层层析法(TLC)，适用于粮食及其制品、调味品等AFB 1 的检测，主要是半定量。利用AFB 1 具有荧光性的特点，提取和浓缩样品中的AFB 1 ，用单向或双向
展开法在薄层上分离后，在365nm紫外光照射下产生蓝紫色荧光，根据在薄层上显示荧光的最低检出量定量，其灵敏度为5μg/kg。由于薄层层析法测定AFB 1 不是很专一，因此样品中其他荧光
物质的干扰造成测定误差。可以用以下方法进行确定:一是用多
种溶剂系统展开，可将AFB 1 、G 1 及各种AFT类似物分开;二是采用层析斑点的化学试验，将样品提取物用甲酸亚硫酰氨或三氟醋酸处理，用衍生化的方法将AFB 1 与其类似物分开;三是层析斑点的物理试验，可根据紫外吸收光谱，红外吸收光谱和荧光屏光谱的差别，将非黄曲霉毒素和AFT分开。
饲料中黄曲霉毒素含量检测实验注意事项
饲料中黄曲霉毒素含量检测实验注意事项
1. 在进行饲料中黄曲霉毒素含量检测实验前，需要确保实验室环境清洁，并进行必要的消毒措施，以防止实验过程中的污染。
2. 提前准备好所有实验所需的试剂和设备，并检查其是否符合规定的要求和标准，确保实验的准确性和可靠性。
3. 在进行实验操作之前，要对样品进行必要的预处理，如研磨、溶解等，以获得准确的测试结果。
4. 在操作过程中，需要严格控制实验条件，如温度、湿度和
pH等，以保证实验的一致性和可重复性。
5. 在进行样品提取和净化时，要注意使用合适的试剂和方法，避免对待测物质造成干扰或破坏。
6. 在进行检测时，要按照检测方法的要求和操作步骤进行操作，确保操作的正确性和一致性。
7. 实验过程中要做好实验记录，包括实验条件、操作步骤、实验结果等，以备后续的数据分析和结果判定。
8. 尽量避免长时间暴露在样品和试剂等可能含有毒性的物质中，确保实验操作的安全性。
9. 实验结束后，要及时清理实验现场和设备，妥善处理实验废弃物，以保持实验室的整洁和环境的安全。
10. 在整个实验过程中，要严格遵守实验室安全规定，如佩戴实验手套、护目镜等个人防护设备，避免发生意外事故。
黄曲霉毒素检测标准方法汇总
流动相的梯度变化表（GBT 5009.23-2006 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定）
标准方法检出限（GBT 23212-2008）
次氯酸钠溶液（消毒用）：
取100g漂白粉，加入500ml水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸钠（Na2CO3·10H2O）溶于500ml温水中，再将两液混合、搅拌、澄清后过滤。此滤液含次氯酸浓度约为25g/L。若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍。所得溶液的浓度约为50g/L。污染的玻璃仪器用10g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。
（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）
AFT B1标准溶液配制
1 仪器校正，测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素f
2 标准溶液配制，配制AFT B1标准溶液，用紫外分光光度计测此溶液最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值，计算AFT B1标准液浓度，后用苯-乙腈混合液调到标准液为10.0ug/ml，并用分光光度计核对浓度。
（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）
稻谷黄曲霉毒素标准
稻谷黄曲霉毒素标准
稻谷黄曲霉毒素标准是指对稻谷中黄曲霉毒素的含量进行限制和规定，以确保稻谷的安全性和卫生质量。黄曲霉毒素是一种致癌物质，长期食用含有黄曲霉毒素的食物会增加患癌症的风险，因此制定严格的稻谷黄曲霉毒素标准非常重要。
一、黄曲霉毒素的危害
黄曲霉毒素是一种由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的有毒化合物，具有强烈的致癌、致畸、致突变作用。长期食用含有黄曲霉毒素的食物会对人体健康造成严重危害，如引起肝癌、胃癌、肠癌等恶性肿瘤，以及导致胎儿畸形、基因突变等。因此，控制稻谷中黄曲霉毒素的含量对于保障人民健康至关重要。
二、稻谷黄曲霉毒素标准的制定
为了控制稻谷中黄曲霉毒素的含量，各国都制定了相应的标准。根据我国国家标准GB 2761-2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》，稻谷中黄曲霉毒素B1的限量为10微克/千克，黄曲霉毒素总量的限量为20微克/千克。这个标准的制定主要基于对人民健康的保护，同时考虑了生产实际和可操作性。
三、稻谷黄曲霉毒素的检测方法
要控制稻谷中黄曲霉毒素的含量，必须对其进行检测。目前，常用的稻谷黄曲霉毒素检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、荧光光谱法、免疫分析法等。其中，高效液相色谱法具有灵敏度高、准确度高、重现性好等优点，被广泛采用。
四、稻谷黄曲霉毒素标准的实施和监督
制定稻谷黄曲霉毒素标准只是第一步，更重要的是实施和监督。政府需要加强对稻谷生产、加工、流通等环节的监管力度，对不符合标准的稻谷进行销毁或深加工处理。同时，对粮食收购和储存环节也要加强管理，防止因潮湿、霉变等原因导致稻谷中产生黄曲霉毒素。此外，还要加强公众对稻谷安全知识的宣传和教育，提高消费者对稻谷安全的认识和警惕性。
黄曲霉素的检测
黄曲霉素的检测
黄曲霉素的检测
000
部分国家检验检疫要求
● 1995年,世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为
15ug/kg.
●我国政府对各种食物中黄曲霉毒素的最高允许量见表2.
表2 中国对食品中黄曲霉毒素的最高允许含量
食物名称
最高允许含量/(ug/kg)
玉米,花生,花生油,坚果和干果(核桃,杏仁)
玉米,花生仁制品(按原料折算)
大米,其他食用油(香油,菜籽油,大豆油,葵花油,胡麻油,茶油,麻油,玉米胚芽油,米糠油,棉籽油)
其他粮食(麦类,面粉,薯干),发酵食品(酱油,食用醋,豆豉,腐乳制品),淀粉类制品(糕点,饼干,面包,裱花蛋糕)
牛乳及其制品(消毒牛奶,新鲜生牛乳,全脂牛奶粉,淡炼乳,甜炼乳,奶油),黄油,新鲜猪组织(肝,肾,血,瘦肉)
20(黄曲霉毒素b1)
20(黄曲霉毒素b1)
10(黄曲霉毒素b1)
5黄曲霉毒素b1)
0.5(黄曲霉毒素m1)
●美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量(指b1+b2+g1+g2的总量)不能超过15ug/kg.人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5ug/kg,其他动物饲料中的含量不能300ug/kg.
●而欧盟国家规定更加严格,要求人类生活消费品中的黄曲霉毒素b1的含量不能超过0.05ug/kg.
检验检疫方法
薄层层析法
薄层层析(thin-layer chromatography,tlc)是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术.自1990年,它被列为aoac (association of official agricultural chemists)标准方法,该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能.
黄曲霉毒素检测方法
黄曲霉毒素检测方法
黄曲霉毒素是引起动物和人类食物中毒的常见真菌毒素之一。为了确保食品的安全和质量，需要对食品样品中的黄曲霉毒素进行检测。下面介绍几种常用的黄曲霉毒素检测方法。
1. 高效液相色谱法（HPLC）：HPLC是一种常用的分离、鉴定和测定食品中黄曲霉毒素的方法。该方法使用高效液相色谱仪通过不同的分离柱，将样品中的黄曲霉毒素与其他组分分离开来，并根据其唯一的吸收特性进行检测和定量测定。
2. 气相色谱法（GC）：GC是一种基于样品中物质的挥发性的分离和检测方法，可以用于测定黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2。该方法需要将样品进行预处理，如萃取、净化等，然后通过气相色谱仪进行分离和检测。
3. 免疫测定法：免疫测定法是一种基于抗原与抗体特异性结合的原理进行黄曲霉毒素检测的方法。常见的免疫测定法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射免疫测定法（RIA）。这些方法操作简便、快速，可以实现对大量样品的高通量检测。
4. 质谱法：质谱法是一种可靠的黄曲霉毒素检测方法。质谱法主要包括质量光谱（MS）和质谱联用技术（LC-MS/MS）。这些方法通过样品中黄曲霉毒素的特征峰进行检测和定量，并具有高灵敏度和高选择性的优势。
以上是几种常用的黄曲霉毒素检测方法，每种方法都有其优缺点，选用合适的方法应根据样品特性、设备条件、经济性和检
测需求来决定。为了确保食品的安全，建议将不同的检测方法结合使用，以提高检测的准确性和可靠性。
黄曲霉毒素检测方法国标
黄曲霉毒素检测方法国标
黄曲霉毒素检测方法国标是指按照中国国家标准制定的黄曲霉毒素检测方法。目前，中国国家标准中规定的黄曲霉毒素检测方法主要有两种：液相色谱-质谱联用法和酶联免疫吸附测定法。这两种方法都是目前应用较广泛且效果较好的检测方法。液相色谱-质谱联用法是一种高灵敏度、高选择性的方法，能够同时检测多种黄曲霉毒素，包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2等。该方法通过液相色谱分离，再通过质谱联用技术进行鉴定和定量，具有高精确度和准确性。
酶联免疫吸附测定法是一种简便快速的检测方法，该方法通过将黄曲霉毒素与特异性抗体结合，然后通过酶标记的二抗或底物发生染色反应来检测黄曲霉毒素的存在。该方法速度快、操作简便，适用于快速筛查和初步定量。
需要强调的是，具体的黄曲霉毒素检测方法国标可能会因地区和标准的变化而有所差异，建议使用时查阅当地的相关标准或咨询专业机构进行确定。
食品中黄曲霉毒素检测方法论述
食品中黄曲霉毒素检测方法论述
黄曲霉毒素属于自然条件下黄曲霉菌与寄生曲霉菌所分泌的一类次级代谢类产物，其会严重污染相关的粮食产物与相关食品，如霉变的玉米、水稻与花生等。黄曲霉毒素的毒性极强，且具有高度的致癌性，成为当前最为突出的一种天然性致癌物质，会对人类健康构成严重的威胁。现下，加强对黄曲霉毒素的检测成为食品安全领域十分关注的话题。对此，本文就食品中黄曲霉毒素检测方法展开了系统化的分析与研究。
标签：食品；黄曲霉毒素；检测方法
黄曲霉毒素所染发的污染事件频频发生，促使各个机关部门于广大消费者对食品安全问题愈发重视。对此，诸多国家针对进口的农产品和食品内黄曲霉毒素的含量进行限量设定。欧盟地区强化对食品内黄曲霉毒素含量的管控，在国际上制定出了严格而规范的食品黄曲霉毒素含量限量标准：要求黄曲霉毒素中B1含量要控制到2.0μg/kg内，而黄曲霉毒素的总含量要控制到4.0μg/kg。在我国，也针对黄曲霉毒素中B1含量提出了限量标准（GB2761-2011）：大米与相关食用油黄曲霉毒素中B1含量要控制到10.0μg/kg；玉米、花生与相关制品内黄曲霉毒素中B1含量要控制到20.0μg/kg；发酵食品、豆类、粮食与调味品等内的黄曲霉毒素中B1含量要控制到5.0μg/kg；而婴儿食品、乳制品等内的黄曲霉毒素B1、M1含量要控制到10.0μg/kg内。
1 黄曲霉毒素的基本概述
黄曲霉毒素属于一类由寄生曲霉与黄曲霉等真菌通过聚酮方式而产生的一种次生性的代谢产物。一般来讲，黄曲酶毒素结构主要包括1个氧杂萘邻酮与1个双呋喃环，结合化学结构差异来讲黄曲霉毒素划分为B1、B2、G1与G2[1]。生物体在获取相应的黄曲霉毒素以后，极易被细胞中CYP450等酶系而氧化为代谢性产物，包含黄曲霉毒素P1、Q1、M1、M2、B2a与G2a等。从本质上来讲，黄曲霉毒素属于真菌毒素的一种，其理化性质十分稳定，具有高度的致畸毒性、致突变性、致癌性与强毒性等特点，通过分析，黄曲霉毒素中B1毒性是最大的。通过相关的实验，我们了解到黄曲霉毒素中B1毒性是氰化钾毒性的10倍，是砒霜毒性的68倍。通过研究，黄曲霉毒素属于Ⅰ类致癌物，通常来讲，动物与人类也主要是借助相应的膳食渠道来摄取一定的黄曲霉毒素。等到该毒素进入到人与动物体内，会产生极强亲肝性，极易引发肝脏出血、胆管增生与脂肪变性等，进而引发肝癌。
黄曲霉毒素的检测及防控PPT课件
样品
小样
检测
Whitaker Dicken，1974
取样方式
针对卡车或拖车装载玉米的取样方式: 第一次取样的位点标记为 “O”. 如果需要更多的样品，应在标记为 “X”的位点再次取样
一卡车玉米中有20ppb黄曲霉毒素的污染
从卡车中的取样量 由于分布不均匀 可能检测到的结果范围
4.50 kg
2.25 kg 1.00 kg 0.45 kg
11.6 - 28.4 ppb
8.1 - 31.9 ppb
3.2 - 38.8 ppb 0 - 46.9 ppb
* 95% confidence range
样品制备 sample preparation
目的：将样品充分粉碎、均质化，为下一 步检测做准备 办法：使用高效粉碎机，粉碎最终直径小 于2mm 制样误差约占总误差的10%
组织国内能力验证活动 5
Date: 2006 Analyse: Aflatoxin Analysis in Peanut paste Sponsor: 山东局 Round: Attended Laboratory Number : 89
六 输欧花生黄曲霉毒素的实验室 检测工作
分析程序----净化
净化是指去除提取液中的杂质（如脂肪、 蛋白质、色素等），以避免对黄曲霉毒 素的检测造成干扰。
食品中4种黄曲霉毒素的检测方法及研究进展
食品中4种黄曲霉毒素的检测方法及研究进展
近年来，随着我国经济的不断进步，科学技术水平也在不断的提高。对于多次出现的黄曲霉毒素污染事件，各国家对食品的安全问题更加重视，黄曲霉毒素成为食品安全中着重关注的对象，对进出口食品的标准也进行限量。各国对食品中黄曲霉毒素的检测方法包括常规检测和快速检测，综合比较与评价，同时也对检测方法进行进一步的深入研究。
针对食品中黄曲霉毒素的前处理
对食品中黄曲毒霉素的前处理首先要使用加压流体萃
取技术，也被称为速溶剂萃取技术，是指在压强和温度相对较高的情况下，在一定时间内用少量溶剂对样品里的目标物质进行提取的技术，这一技术操作起来比较简单，溶剂的损耗比较低、提取的效率比较高，但是专业的仪器比较贵，对食品中黄曲霉素的检测还没有被使用。超临界流体的萃取技术，难度比较大、成本高回收率低、提取的纯度比较低，不适用于黄曲毒霉素提取方法。固相萃取技术主要是对样品进行分离和净化，检测的灵敏度比较高，可以分离黄曲毒霉素，操作也比较简单，用于食品中黄曲毒霉素的处理方法。免疫亲和层析技术，操作简单、净化好，但种类少，没有被使用。分子印迹技术实用性强，但成本高，在国内的实验中没有被使用。
黄曲霉毒素的常规检测方法
薄层色谱的方法。黄曲霉毒素检测技术的方法中，薄层色谱的方法是最先检测的方法之一。主要是对检测的样品进行提取，然后进行净化，最后进行富集，要在薄层版上进行分离，最后需要在紫外线的照射下进行检验识别。黄曲霉毒素在紫外线的照射下会出现紫色荧光和绿色荧光，根据显示的荧光强度进行定量。这种黄曲霉毒素的薄层色谱的检测方法是我国标准推荐的方法之一。薄层色谱法的试剂简单，成本比较低，操作起来也比较容易掌握，可以对样品中黄曲毒霉素进行分析，对于量大的样品筛查，薄层色谱法非常的适用。但是此检测方法的操作步骤比较麻烦，灵敏度的反应比较差，实验的人员要对大量的有毒试剂进行接触，因此，薄层色谱法将被逐渐停止运用。
黄曲霉素的检测方法
食品中黄曲霉毒素的检测方法，现状及发展方向
1 食用油中黄曲霉毒素的分析检测方法
目前检测黄曲霉毒素的方法主要有薄层色谱法 (TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、以酶联免疫为基础的免疫分析、免疫亲和分析法如微孔板酶联免疫吸附分析法(EusA)以及生物传感器法等。
1．1薄层色谱法(TLC)
TLC法是传统的检测AFB 最常用方法，是应用最早、最广的分离、分析技术，曾是我国测定食品及饲料中AFB．的国家标准方法之一，其原理是：样品经提取、浓缩、薄层分离后，在365 Bin波长的紫外光照射下，黄曲霉毒素B】、B2产生紫色荧光，G 、G2产生绿色荧光，然后根据其在薄层板上显示的荧光的最低检出量来定量。其优点是：所用的试剂、设备简单，费用低廉，容易掌握，适用大量样品的分离、筛选，一般的实验室均可开展，属于定性和半定量的功能。为了提高薄层层析法的精度，还建立薄层扫描等其他的方法来确定黄曲霉毒素，它是薄层层析法的仪器化，样品的处理和层析条件与薄层层析法相同，只是在标准品的设定和结果判定上有所不同。如卢艳杰等介绍了一种简单、微型、低功率的光度检测器用于定量薄层板上的AFT，该装置简单、便宜可代替薄层扫描仪等其他测定AFT含量的设备，最低检测限可达1 rig，符合欧洲对AFT规定的限量。卢艳杰等介绍了过压薄层色谱法(OPLC)结合光度计，成功地对多种食品中的黄曲霉毒素B】、B2、G】和G2 进行测定，同时该方法还适用于样品的提纯和分离，一次可对十个样品进行分析，做到快速、有效、低耗地定量食品中AFT[引。该法的局限性与不足之处在于薄层色谱法检测AFT的操作步骤多，样品前处理烦琐，并且提取和净化效果不够理想，提取液中杂质较多，因而在展开时影响斑点的荧光度，导致灵敏度下降。灵敏度低、重现差、操作烦琐、时间长且安全性差等缺点，已越来越不适用现代分析的要求。
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黄曲霉毒素分布范围广
黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果（特 别是花生和核桃中）中。日常检验发现在大豆、谷物、 玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制 品中也经常发现黄曲霉毒素（其中以花生和玉米污染 最严重）。
毒性极强
黄曲霉毒素进入人体后主要经消化道吸 收，大部分分布 在肝脏、肾脏。因此主要引 发肝癌、胃癌等，还可以诱发骨癌、肾癌、 直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等。黄曲霉毒素如 不连续摄入，一般不在体内积蓄。一次摄入 后约1周将大部分排出。只有严重霉变的粮食 才可能会含有大量毒素，导致急性毒性。
耐热性强
在一般的烹调加工温度下，黄曲霉毒素被破 坏的很少；即使是 200℃高温加热，也不能 完全正确破坏。一般黄曲霉毒素的裂解温度 为280℃，黄曲霉毒素 B1 的裂解温度为 268℃。
黄曲霉毒素的种类
迄今为止发现的黄曲霉毒素主要有4种：即 B1、B2、C1、G2，其中B1被认为是主要的有 毒物质，有2种这些毒素的代谢产物M1和M2。 其中黄曲霉毒素B1主要存在于农产品，动物饲 料，中药等产品中；黄曲霉毒素M1是动物摄入 黄曲霉毒素B1后在体内经羟基化代谢的产物， 一部分从尿和乳汁排出，一部分存在于动物的 可食部分，如乳、肝、蛋类、肾、血和肌肉中， 其中以乳最为常见。 黄曲霉毒素M1的毒性和致癌性与黄曲霉毒 素B1的基本相似。由于牛乳及其制品是人类、 特别是婴儿的主要食品，所以其危害性更大。
最新国标方法“免疫亲和柱法”较好的解决了上面的不足，该 种方法可以采用配套的荧光仪进行检测，也可以和高效液相色 谱法结合，解决标准物污染和操作过程繁复等问题。同时该种 方法有着较好的权威性和通用性，且为国外多个组织认可，被 列为标准方法，如： 美国公职分析化学家协会（AOAC） 美国农业部联邦谷物检测中心（FGIS） 国际纯粹与应用化 学协会（IUPAC） 美国食品药品行政署（US-FDA） 美国农业部（USDA） 同时在国内被认证的机构： 中国出入境检验检疫局（CIQ）、 中华人民共和国国家标准（GB）
衍生方法
可分为柱前衍生法和柱后衍生法。对黄曲霉 毒素衍生的目的主要是为了增加测定时的荧 光强度，柱前衍生法主要有三氟乙酸和稀盐 酸法，柱后衍生法主要有溴法和碘法。柱后 衍生需增加泵、校后反应器和控温箱等装量。 在实践中以柱前衍生较多，因柱前衍生法容 易推广，且大多采用三氟乙酸衍生，并在衍 生前后分别用氮气或直接吹气挥干。
薄层色谱法（TLC）
其原理是:样品经提取、浓缩、薄层分离后,在 365 nm波长的紫外光照射下,黄曲霉毒素B1、 B2产生紫色荧光,G1、G2产生绿色荧光,然后 根据其在薄层板上显示的荧光的最低检出量 来定量。 优点是:所用的试剂、设备简单,费用低廉,容 易掌握,适用大量样品的分离、筛选,一般的实 验室均可开展,属于定性和半定量的功能。
Baidu Nhomakorabea 高效液相色谱法(HPLC)
以C18柱为固定相,以水+异丙醇+乙腈(80 +12+8) 为流动相,用荧光检测器进行检测,其激发波长365 nm, 发射波长450 nm,以保留时间定性，峰面积定量，这 些基本参数大致相同，但在流动相的选用上却差异较 大。样品用甲醇和水混合液进行萃取,随后进行衍生化 处理,处理后溶解于流动相,进行液相色谱测定。
黄曲霉毒素危害的预防
1、防霉：最好的预防方法是防止粮食等食物 的霉变。黄曲霉菌产毒要求的温度为 12℃~42℃，最适温度为25.7℃~32℃。 2、去毒：黄曲霉毒素耐热，B1的分解温度 为268℃左右 黄曲霉毒素多存在食物的表 面，最简单的方法就是直接丢弃明显生霉、 破损的粮食，不要食用。
目前，测定食品中的黄曲霉毒素的方法有：薄层层析法、液相色谱法、放 射免疫分析法、酶联免疫法、亲和层析法、微柱筛选法、金标试纸法等。 这些方法或多或少都具有如下不足之处： （1）、在操作过程中，需要使用剧毒的黄曲霉毒素M1作为标定标准物， 对操作人员造成巨大的沾 污危险，而且黄曲霉毒素M1标准物质购买十分困难。 （2）、操作过程烦琐、复杂、时间长，劳动强度大。 （3）、仪器设备昂贵、笨重、操作复杂，难以实现现场快速分析。 （4）、灵敏度较差，重复性很难得到满意结果。
酶联免疫吸附法(ELISA)
是抗原(抗体)吸附剂和用酶标记的抗体(抗原) 与标本中的待测物(抗原和抗体)起特异的免疫 学反应，用测定酶活力的方法来增加测定的 敏感度。大致采用两种方式检测黄曲霉毒素， 一种是用双抗体夹心法，另一种是用竞争法。
微柱法
测定黄曲霉毒素，是利用微柱管内的硅镁型 吸附剂吸附黄曲霉毒素并在365 nm紫外光下 显示荧光，其强度与一定浓度的黄曲霉毒素 含量成正比关系，由此可简略定量黄曲霉毒 素。
中国食品中黄曲霉毒素的限量标准
标准
GB2761-81
食品种类
玉米、花生仁、花生油
最大限量
20μg/kg
大米、其他食用油
其他粮食豆类、发酵食品
10μg/kg
5μg/kg
婴儿代乳食品
GB9676-88 牛乳及其制品
不得检出
0.5μg/kg
生物鉴定法
免疫分析法
检测方法
化学分析法
仪器分析法
黄曲霉毒素的检测方法
金标试纸法
金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法,可一 步式检测AFT。一步式AFT快速检测纸法可在5~10 min完成对样 品中AFB1的定性测定,具有简单、快速、灵敏度高等特点,无须仪 器设备配合测定,检测既可在实验室中进行,也可在农场、饲料混 合车间等进行实地测定,对黄曲霉毒素定性检测准确度在85 %以 上,灵敏度为4 ng/mL ,可测出样品中20 ng/g的黄曲霉毒素[10]。 Sun Xiu lan等合成一种对AFB1具有特异性的抗体金标探针,该纳 米金标探针用于免疫色谱法对AFB1分析,完成一个样品分析所需 要的时间少于10 min,比ELISA少6~10 min,在标准品的对照下,最 低检测限可达2.5ng/mL
免疫亲和柱法(IAC-AFLATEST)
为了开发一种简单、快速、灵敏、准确的分析方法,美国VICAM(维康) 公司与哈佛大学、麻省理工学院、约翰－霍普金斯大学、AOAC、FDA、 FGIS、美国农业部等著名大学和政府机构通力合作，发明研制了一系列以 单克隆免疫亲和柱为分离手段，用荧光计、紫外灯作为检测工具的分析方 法。该项技术有一下特点： 1、认证机构广泛，通用性强 2、分析速度快，一个样品只需10－15分钟，其他传统的方法要做到定量 分析需要几小时至几天的时间。 3、灵敏度高，测定范围广泛（0－ 300ppb）,用荧光计可以测定0.1ppb的黄曲霉毒素M1，用HPLC可以检测 出10ppt的黄曲霉毒素M1。 4、采用单克隆免疫技术，可以特效性地将黄曲霉毒素和其他真菌毒素分 离出来，分离效率和回收率高，正确性和可靠性强。 5、仪器轻便容易携带，自动化程度高，操作简单，直接读出测试结果， 对实验操作人员要求不高，可以在小型实验场所使用。 6、不需要剧毒的黄曲霉毒素和其他真菌毒素标准物来标定，所以在整个 实验过程中，绝对安全可靠。
生物鉴定法
利用 AFT 能影响微生物、水生动物及家禽等生物 体的细胞代谢, 来鉴定 AFT 的存在, 其特点是待检 样品不需很纯, 主要用于定性鉴定, 包括: ① 抑菌试 验; ② 对微生物遗传因子影响试验; ③ 细菌发光试 验; ④ 荧光反应; ⑤ 组织培养检测法; ⑥ 鸡胚试验; ⑦ 鸭胚试验; ⑧ 鳟鱼试验; ⑨植物试验; ⑩ 饲喂实验 动物试验。这些方法专一性差, 灵敏度低, 一般只作 为化学分析法的佐证。
黄曲霉素检测
黄曲霉毒素介绍
黄曲霉毒素(aflatoxin，简称为AF)是到目前为止发 现的毒性最大的真菌毒素。 它可通过多种途径污染食品和饲料，直接或间接 进入人类食物链，威胁人类健康和生命安全，对人体 及动物内脏器官尤其是肝脏损害严重，该毒素是黄曲 霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉 变的粮食及粮食制品中。黄曲霉毒素十分耐热，加热 至230℃才能被完全破坏，因此一般烹饪加工也不易 消除。