检测抗—HIV双抗夹心法与间接ELISA法比较
艾滋病抗体检测方法
艾滋病抗体检测方法
艾滋病抗体检测方法是通过检测人体血液中是否存在艾滋病病毒（HIV）的抗体来确定是否感染了艾滋病病毒。
常见的艾滋病抗体检测方法包括：
1. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：此测试是最常用的艾滋病抗体检测方法之一。
它可以检测人体血液中是否存在艾滋病病毒抗体。
2. 免疫荧光抗体法（IFA）：这是另一种检测艾滋病病毒抗体的方法。
它使用荧光标记的抗体来检测人体中的抗体。
3. 同时酶联免疫吸附试验（EIA）和免疫印迹分析（Western Blot）：EIA是首先进行的筛选测试，然后使用Western Blot进行确认。
Western Blot可以检测特定的蛋白质，以确定是否感染了艾滋病病毒。
4. 快速抗体检测（Rapid Test）：这是一种简单、快速的方法，可以在医疗机构外部进行。
这种测试通常使用血液、唾液或尿液作为样本，并且可以在30分钟内得到结果。
如果初步抗体检测结果为阳性，通常需要进行进一步确认测试，如多次重复抗体检测、核酸检测或抗原测定。
医生或专业机构应该进行解读结果并给出确诊。
HIV抗体检测的标准操作程序（ELISA法和快速法）
HIV测定（ELISA法）标准操作规程1、检验目的应用双抗原夹心酶联免疫法原理（ELISA）定性检测人血清、血浆标本中的HIV（1+2）型抗体的测定，用于HIV感染的辅助诊断，抗HIV药物治疗的效果的监测。
2、原理采用夹心ELISA方法检测血清或血浆标本中人类免疫缺陷病毒HIV（1+2）型抗体，预包被高纯度基因重组HIV（1+2）型抗原，可与标本中的抗-HIV抗体反应，加入HRP标记HIV （1+2）型抗体抗原结合，形成抗原－抗体－酶标抗原复合物，然后加入TMB底物产生显色反应。
通过酶标仪检测吸光度（OD值），根据OD值判断HIV抗体的存在与否。
3、性能参数灵敏度高（0.5ng/ml）4、标本要求（1）标本类型：血清，血浆。
（2）标本采集：见标本采集手册（3）标本储存和运输：室温放置不超过8小时，2-8℃不超过72小时，-20℃可长期保存，应避免反复冻融（4）标本拒收状态：细菌污染，严重溶血或脂血标本不能作测定。
本文来自检验地带网5、容器和添加剂类型6、试剂（1）试剂名称：人类免疫缺陷病毒HIV(1+2)型抗体诊断试剂盒。
（2）试剂生产厂家：上海科华生物工程股份有限公司（3）包装规格：96T/Kit（4）试剂盒组成：①、HIV酶标板；②、HIV酶标试剂；③、HIV（1+2）型阳性及阴性对照血清；④、显色剂A液和B液；⑤、此外还有浓缩洗涤液、终止液、自封袋、封板膜、说明书等。
7、仪器设备：酶标仪：ZS板式，北京普朗生物技术有限公司，每年由计量单位进行一次校准。
洗板机：DNM-9620型，北京普朗生物技术有限公司，每年由国家计量单位进行一次校准。
移液器：上海求精，每年由国家计量单位进行一次校准。
8、校准程序9、操作步骤①、配液：将50ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释至1000ml备用。
②、编号：将样品对应微孔按序编号，每板设阴性对照2孔、阳性对照3孔，空白对照2孔。
③、加样：分别在相应孔加入待检标本、阴性、阳性对照100μl，用封板膜封板后置37℃温育60min。
ELISA实验中各种方法原理及优缺点比较
wash BSA
wash wash TMB
ELISA 实验中各种方法原理及优缺点比较
ELISE 实验是指酶联免疫吸附试验（enzyme linked
immunosorbent assay)指在固定相上进行免疫酶技术，其依据有1：蛋白质可以吸附到固定相上而不改变其活性，2：抗原或抗体与酶交联以后仍可保持其活性及酶的催化活性，3：交联后的酶可以与反应底物进行反应，并催化其分解，产生有色物质。
根据有色物质的多少，即颜色的深浅，通过酶标仪测定其颜色与标准物质颜色的差异，根据酶测曲线得出其浓度。
ELISE 实验基本类型有直接法、间接法、抗体夹心法、竞争法、抑制法。
现将各种方法原理及优缺点总结如下：
一：直接法
直接法利用抗原结合在固定相上面，用酶联抗体直接与抗原结合，而后分解底物。
二：间接法
间接法利用抗原与固定相结合后，用一抗与抗原结合，再用二抗V 区和一抗S 区结合。
酶联抗体位于二抗上。
由于一抗V 区具有稳定性，S 区具有可变性，所以在与不同抗原结合时，V 区变化
而S 区不变，故间接法可以测定
三：双抗夹心法
利用抗体锚定在固定相上，抗原与其结合后，抗原的另外一个表位与酶联抗体结合，催化底物分解，故双抗夹心法适用于某些大
TMB
wash wash
wash
分子的具有至少双表位的抗原
四：竞争法
竞争法是指针对抗原上同一抗原表位，分别用抗体与酶联抗体先后与其结合，抗体占据表位后，
故催化底物反应的能力相应下降。
子或只有一个抗原表位或重复抗原表位的抗原。
wash wash
TMB。
elisa双抗体夹心法原理
elisa双抗体夹心法原理Elisa双抗体夹心法原理引言：Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定分子。
其中，双抗体夹心法是Elisa的一种常见应用，它通过特定抗体的结合来检测目标分子的存在。
本文将详细介绍Elisa双抗体夹心法的原理和应用。
一、Elisa双抗体夹心法的原理Elisa双抗体夹心法是一种间接的免疫测定方法，它利用两种不同的抗体来夹持目标分子，从而实现对目标分子的检测和定量分析。
1. 抗原涂覆：首先，在试验板上涂覆含有目标分子的抗原。
这个抗原可以是蛋白质、多肽、病毒、细菌等。
涂覆后，将试验板放置在适当的条件下，使抗原与试验板表面结合。
2. 阻断：为了避免非特异性结合，需要在试验板上进行阻断步骤。
通常使用一种无关的蛋白质（如牛血清蛋白）来阻断未被抗原结合的表面。
3. 第一次抗体结合：将含有特异性抗体的溶液加入试验板中，使其与目标分子结合。
这种特异性抗体通常是由动物免疫产生的，可以识别并结合目标分子。
4. 第一次洗涤：为了去除未结合的第一次抗体，需要进行洗涤步骤。
洗涤可以去除非特异性结合物，提高检测的特异性。
5. 第二次抗体结合：将与酶结合的第二次抗体加入试验板中，使其与第一次抗体结合。
这种第二次抗体通常是与酶（如辣根过氧化物酶）结合的抗体，可以通过酶的催化作用来放大信号。
6. 第二次洗涤：为了去除未结合的第二次抗体，需要进行洗涤步骤。
洗涤可以去除非特异性结合物，提高检测的特异性。
7. 底物添加：将含有底物的溶液加入试验板中，底物与酶的催化作用产生可测量的信号。
常用的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）等。
8. 反应停止：通过加入反应停止剂，停止底物的反应，并产生一个可测量的信号。
反应停止剂通常是酸性溶液，可以改变底物的颜色。
9. 信号检测：使用光谱仪或酶标仪等设备，测量底物反应产生的信号强度。
信号的强度与目标分子的浓度成正比，可以通过标准曲线来定量分析目标分子的浓度。
elisa包被原理
elisa包被原理ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常见的免疫检测方法，广泛用于疾病诊断、生物化学分析、药物筛选等领域。
该技术通过利用酶的高灵敏度和特异性，在试管中检测目标分子的存在，并通过比色或发光等方法来定量分析。
ELISA检测方法一般有直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA等多种形式。
本文将着重介绍夹心ELISA的原理和实验步骤。
一、原理：夹心ELISA （Sandwich ELISA）是一种双抗夹心法，其基本原理是利用两种不同特异性的抗体对目标分子进行夹心检测，其中一种抗体固定在所选的检测板上，另一种抗体标记着特定的酶。
在检测过程中，目标分子会与板上的固定抗体结合，接着与标记抗体结合，并将其特定的酶活性带到检测体系中，最终通过加入底物来产生测定信号。
夹心ELISA的信号强度与检测物的浓度成正比，经过计算后可以获得目标分子的定量信息。
具体来说，夹心ELISA步骤包括以下几个方面：1. 准备试剂和试验板：- 准备特异性的固定抗体，并将其分别涂覆在微孔板表面；- 将剩余的微孔板孔涂覆阻断剂，以避免非特异性的蛋白质粘附在板表面。
2. 样品加入：- 加入待检测的样品或标准样品，并在适当条件下使其与固定抗体结合。
3. 标记抗体加入：- 加入与待检测物品特异性的标记抗体，其酶标记通常为马过氧化物酶（HRP）。
4. 洗涤：- 通过洗涤步骤去除未结合的物质和蛋白质等杂质，以保证检测结果准确可靠。
5. 底物反应：- 加入适当的底物和缓冲溶液，并使用酶标仪检测获得的信号强度。
6. 计算分析：- 根据已知样品的浓度建立标准曲线，并利用标准曲线获得待检测样品的浓度。
二、实验步骤：1. 准备试剂和微孔板：- 预热酶标板至室温，并在孔板中分别涂覆所选特异性抗体，处理空孔作为阴性对照；- 已经涂覆抗体的孔板需要在4℃下保存，以保持活性。
- 制备所需的缓冲溶液、洗涤缓冲液和底物溶液。
酶联免疫吸附试验(双抗夹心法)原理
酶联免疫吸附试验（ELISA），又称酶联免疫吸附测定法，是目前广泛用于生物化学和免疫学领域的一种重要实验方法。
该技术结合了免疫学和生物化学的原理，能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，对临床诊断、生物医学研究以及生物制药等领域有着广泛的应用。
在本文中，我们将深入探讨酶联免疫吸附试验的原理、方法和应用。
一、酶联免疫吸附试验原理酶联免疫吸附试验的原理主要是利用酶标记抗体、抗原和底物的相互作用来检测特定物质的存在。
在双抗夹心法中，试验基本步骤如下：1. 用待测抗原溶液在固相酶标记抗体包被的微孔板上，充分接触和结合。
2. 经洗涤后，底物溶液被加入，并与酶标记抗体包被的复合物结合。
3. 底物受酶催化分解后，生成有色产物，通过比色法测定其光密度，间接测定抗原的含量。
在实验过程中，我们不能忽视的是标本处理、试剂选用、仪器操作等一系列实验细节，这些都对实验结果的准确性和重复性有着重要的影响。
二、酶联免疫吸附试验的方法不同类型的酶联免疫吸附试验方法包括间接法、夹心法、竞争法和直接法等。
在这次我们重点讨论的是双抗夹心法。
该方法通过将待测抗原与固相酶标记抗体和液相抗体结合，从而提高了对待测抗原的灵敏度和特异性。
这种方法在免疫学研究、传染病诊断和药物检测等方面具有重要的应用价值。
除了双抗夹心法，间接法通过检测待测抗体也是常用的酶联免疫吸附试验方法。
在实验设计中，根据不同的研究目的和样本特性，我们可以选择不同的方法来进行实验设计和操作。
三、酶联免疫吸附试验的应用酶联免疫吸附试验在临床诊断、疫苗研制、传染病监测、生物药品开发等领域有着广泛的应用。
它能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，为疾病诊断和药物研发提供了重要的技术支持。
在临床诊断中，酶联免疫吸附试验被广泛应用于传染病的早期诊断和鉴定。
HIV抗体检测、甲型肝炎抗原检测等都是通过酶联免疫吸附试验来完成的。
酶联免疫吸附试验还被应用于药物和疫苗的开发和监控过程中，能够全面地评价新药和疫苗的免疫原性和保护效果。
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种实验室常用的检测方法，广泛应用于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。
与其他基于抗体的检测方法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相支持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和非特异性相互作用的分离，并可通过最终有色产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。
ELISA 实验通常以细胞培养上清液、血清、血浆以及组织裂解物等为样品。
该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。
根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测方法。
该实验可迅速分析大量平行样品，在基础研究和临床诊断实践中广泛使用。
一、直接ELISA原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
优点：操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。
缺点：实验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高。
二、间接法ELISA原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度；灵活性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗；不直标一抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使用标记抗体更少。
缺点：交叉反应几率升高。
三、双抗夹心法ELISA原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。
ELISA检测方法有哪些
ELISA检测方法有哪些？酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是研究蛋白抗体的重要方法。
它是采用抗原与抗体的特异结合将被测物质与酶标抗体进行直接或间接结合，然后通过标记酶与底物产生颜色反应进行定性和定量分析。
那么，它与其它检测方法的灵敏度ELISA通常分为四种类型：直接法、间接法、竞争法、夹心法等，直接上图：直接法（Direct ELISA）仅需要抗原和酶标一抗，操作简便，可避免交叉反应，然而该方法要求酶标一抗有较高的特异性要求，同时也并非所有的一抗适合标记处理。
直接法在实际运用中并不多见，它并不能对样本中抗体进行定量分析，因为样本中抗体是非酶标抗体，无法进行后续显色，但是该法经过改进就是竞争性ELISA方法，见后文。
间接法（Indirect ELISA）使用了二抗增加信号强度，也使抗体的选择多样化，然而间接法容易产生交叉反应。
间接法只能用于测定抗体，主要用于疾病的诊断，其优点是只需要改变包被抗原，酶标抗体是通用的。
夹心法（Sandwich ELISA）分为双抗体夹心法和双抗原夹心法：双抗体夹心法中抗原被两个抗体——捕捉抗体和检测抗体，结合于不同位点。
捕捉抗体固定于载体上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。
应用于双抗体夹心法检测的抗体需是单抗，而且对同一抗原结合位点不同，如此才能避免交叉反应或两种抗体竞争性结合同一位点。
夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP 等。
由于双抗体夹心法特异性高，在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应（一步法），此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而不形成“夹心复合物”，此时测出的结果将低于实际含量甚至是阴性结果（钩状效应hook ffect）。
因此，如果使用一步法测定样本中抗原含量时要注意测量的线性范围，另外使用高亲和力的单抗也可削弱钩状效应。
elisa方法总结
也可采用“一步法”。如果在急性感染状态下，机体产生抗体IgG的滴度通常不高，不会出现明显的“钩状效应”；但如果为慢性感染，抗体滴度很高，也会存在“钩状效应”造成漏检。
竞争法
抗原中杂质难以去除或抗原的结合特异性不稳定；
HBcAb、HBeAb；
HBcAb的测定，HBcAg直接包被于固相上。HBeAb测定，先将特异抗e抗原的抗体包被于固相上，再将e抗原间接固相化。主要是HBeAg的不稳定所致，如在固相直接包被HBeAg，则会因为HBeAg向HBcAg的易转变性，而导致测定误差。
待测物
方法
说明
备注
抗原
双抗体夹心法
含多个抗原表位的大分子蛋白；
两步法（有两步温育、洗涤）；
一步法钩状效应（Hook effect）假阴性或定量偏低；
HBsAg、甲胎蛋白（α-FP）、前列腺特异抗原（PSA）、CA系列标志、人绒毛膜促性腺激素（HCG）等；
类风湿因子（RF）和补体等的干扰。RF是一种抗变性IgG的自身抗体，能与多种动物的变性IgG的Fc部份结合。如果血清标本中含有RF，在双抗夹心ELISA检测时，其即可作为固相抗体和酶标抗体（均为IgG）之间的桥接抗原，产生假阳性反应。
3、配件管理、协助安装并促成服务协议及应收账款的达成；
4、为区域内销售部和市场部提供支持。
35岁以内，本科及以上学历，生物医学工程,、电子工程、机械设计及自动化、信息技术工程或医学检验专业；
2、医疗器械维修从业资历至少三年及以上经验丰富的业内工程师。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）
竞争法
ELISA的种类及原理
ELISA的种类及原理
ELISA（酶联免疫吸附试验）的种类有直接ELISA、间接ELISA、双抗体夹心ELISA、竞争ELISA、间接竞争ELISA
和间接/夹心ELISA。
直接ELISA的原理是将需要检测的抗原直接固定在微孔板上，然后加入与抗原结合的标记抗体，最后用底物检测标志物对微孔板进行显色，以确定抗原的存在。
间接ELISA的原理是先将需要检测的抗原固定在微孔板上，
然后加入特异性抗体，再加入标记二抗与特异性抗体结合，最后用底物检测标志物对微孔板进行显色，以检测抗原的存在。
双抗体夹心ELISA的原理是用两种具有特异性的抗体来检测
抗原。
首先将捕获抗体固定到微孔板上，加入待检样品，待抗原与捕获抗体结合后，加入检测抗体，最后再加入与检测抗体结合的标记二抗进行检测。
竞争ELISA的原理是在抗原与特异性抗体的竞争下检测抗原。
将捕获抗体固定到微孔板上，加入已知抗原浓度的标准样品和待检样品，再加入特异性抗体与标记抗体竞争结合。
间接竞争ELISA的原理同竞争ELISA类似，但检测抗体不是
标记抗体而是另一种竞争性抗体。
间接/夹心ELISA的原理是将捕获抗体固定在微孔板上，加入
待检样品和检测抗体，再加入标记二抗，最后用底物检测标志物对微孔板进行显色，并检测抗原的存在。
双抗夹心法测抗体原理
双抗夹心法测抗体原理一、引言双抗夹心法是一种常用的测定抗体的方法，其原理基于抗原与抗体的特异性结合。
本文将详细介绍双抗夹心法测定抗体的原理。
二、双抗夹心法概述双抗夹心法是一种间接免疫酶联试验（ELISA）技术。
其基本步骤包括：将特定的抗原涂覆在固相载体表面，加入待检测样品，经过洗涤去除非特异性结合物质后，加入与被检测抗体特异性结合的酶标记二抗，再次经过洗涤去除非特异性结合物质后，加入底物进行反应，并通过光度计等手段测定样品中酶标记物质含量。
三、实验步骤及具体操作1. 抗原涂覆：将特定的抗原溶液均匀涂覆在固相载体表面，并放置在适当条件下孵育一段时间，使得抗原能够牢固地吸附在载体表面。
2. 样品加入：将待检测样品加入到已经涂覆有特定抗原的载体孔中，使得样品中的抗体与载体表面的抗原结合形成夹心复合物。
3. 洗涤：用缓冲液对孔进行洗涤，去除与载体表面结合不紧密的非特异性结合物质。
4. 酶标记二抗加入：加入与被检测抗体特异性结合的酶标记二抗，使其能够与夹心复合物结合形成“双抗夹心”。
5. 再次洗涤：用缓冲液对孔进行洗涤，去除非特异性结合物质。
6. 底物加入：加入底物，使酶标记物质发生反应，并产生可测量的信号。
7. 光度计测定：通过光度计等手段测定样品中酶标记物质含量。
四、原理分析双抗夹心法基于抗原与抗体的特异性结合。
在实验中，将特定的抗原固定在载体表面上，并将待检测样品加入到已经涂覆有特定抗原的载体孔中。
如果样品中含有与该特定抗原相对应的特异性抗体，则该特异性抗体会与载体表面上的特定抗原结合形成夹心复合物。
接着，加入与被检测抗体特异性结合的酶标记二抗，使其能够与夹心复合物结合形成“双抗夹心”。
最后加入底物，使酶标记物质发生反应，并产生可测量的信号。
通过光度计等手段测定样品中酶标记物质含量，就可以确定样品中特异性抗体的含量。
五、优缺点分析双抗夹心法具有以下优点：1. 灵敏度高：通过多次洗涤去除非特异性结合物质，可以提高实验的灵敏度。
ELISA_直接法与间接法的区别
ELISA_直接法与间接法的区别ELISA 可用于测定抗原 , 也可用于测定抗体 . 在这种测定方法中有三个必要的试剂1) 固相的抗菌素原或抗体，即”免疫吸附剂"(immunosorbent);(2) 酶标记的抗原或抗体，称为”结合物"(conjugate);(3) 酶反应的底物 . 根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件, 可设计出各种不类型的检测方法 .ELISA 可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。
主要有以下几种类型 : (直接法也称一步法)1 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法 , 操作步骤如下 :1) 将特异性抗体与固相载体联结 , 形成固相抗体 . 洗涤除去未结合的抗体及杂质 .2) 加受检标本 , 保温反应 .标本中的抗原与固相抗体结合 , 形成固相抗原抗体复合物 .洗涤除去其他未结合物质 .3) 加酶标抗体 , 保温反应 .固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合 . 彻底洗涤未结合的酶标抗体. 此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.4) 加底物显色 . 固相上的酶催化底物成为有色产物 . 通过比色 , 测知标本中抗原的量 . 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体 , 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法 . 如抗体的来源为抗血清 , 包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物. 如应用单克隆抗体 , 一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗 , 分别用于包被固相载体和制备酶结合物 . 这种双位点夹心法具有很高的特异性 , 而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应 , 作一步检测 .在一步法测定中 , 当标本中受检抗原的含量很高时 , 过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合 , 而不再形成 "夹心复合物 ". 类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象 , 此时反应后显色的吸光值 (位于抗原过剩带上 ) 与标准曲线 ( 位于抗体过剩带上 ) 某一抗原浓度的吸光值相同( 参见 1.3.2, 图 1-4), 如按常法测读 , 所得结果将低于实际的含量 , 这种现象被称为钩状效应 (hook effect), 因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落 . 钩状效应严重时 , 反应甚至可不显色而出现假阴性结果 . 因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值 . 用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应.假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg 的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物. 但在HBsAg 的检测中应注意亚型问题 ,HBsAg 有adr,adw,ayr,ayw4 个亚型 , 虽然每种亚型均有相同的 a 决定簇的反应性 , 这也是用单抗作夹心法应注意的问题 .双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体，多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现岀假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了 Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。
双抗体夹心法elisa原理
双抗体夹心法elisa原理小伙伴，今天咱们来唠唠这个双抗体夹心法ELISA的原理，可有趣啦。
ELISA呢，就是酶联免疫吸附测定的简称，这双抗体夹心法ELISA就像是一场抗体的“三明治”制作大赛。
你看啊，咱们要检测的那个东西，比如说某种抗原，就像是三明治中间那块美味的肉。
那抗体呢，就是面包片啦。
先来说说这个抗体。
在这个检测里，有两种抗体哦。
第一种抗体是被固定在检测板上的，就像把一片面包稳稳地放在盘子里一样。
这个检测板就像是一个特殊的舞台，抗体就站在上面等着抗原的到来。
这个固定的抗体有个特殊的本领，它能特异性地识别咱们要检测的抗原。
什么叫特异性识别呢？就好比一把钥匙开一把锁，这个抗体就只能和咱们要检测的那种抗原紧紧结合，对其他乱七八糟的东西可没兴趣。
当咱们把含有抗原的样本加到这个有固定抗体的检测板上的时候，就像是把肉放在了面包片上。
抗原就会和固定的抗体来个亲密接触，它们紧紧地抱在一起，这个过程就像是命中注定的相遇一样。
这时候，抗原就被固定在检测板上啦。
接下来呢，第二种抗体就该登场啦。
这第二种抗体也是针对咱们要检测的抗原的，它就像是另一片面包，要把抗原夹在中间。
这个抗体可自由啦，在溶液里游来游去，当它发现检测板上已经被固定住的抗原的时候，就会迅速地结合上去。
这就形成了抗体 - 抗原 - 抗体这样的一个“三明治”结构。
是不是超级酷？但是呢，这还没完事儿哦。
咱们怎么知道这个“三明治”已经做好了呢？这就需要一点小魔法啦，这个第二种抗体上面还连接着一种酶呢。
这个酶就像是一个小信号员，它可以催化一种化学反应。
当我们加入一种特殊的底物的时候，这个酶就开始工作啦。
在酶的催化下，底物会发生变化，这个变化我们是可以看到的。
比如说，会产生颜色变化，就像变魔术一样，从无色变成有色。
颜色的深浅就和抗原的量有关系啦。
如果抗原很多，那形成的“三明治”就多，酶催化底物产生的颜色就深；要是抗原少呢，“三明治”少，颜色就浅。
你看，这个双抗体夹心法ELISA就像是一场精心编排的小剧场。
ELISA双抗夹心法检测抗原业界精制
8℃）干燥的条件下一般可以保存6个月。
技术教育
21
包被
定义：将抗原或者抗体固定在固相载体的过程称为包 被；
物理吸附：两者的疏水基团通过疏水键的作用
抗体或者蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作 为稀释液（即本次实验用的coating buffer）
由于增加了一层抗体，提高了特异性检测的灵敏度， 尤其是改良双抗夹心法；只要获得针对受检抗原的 特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合 物就可以建立此法；
重复性较好；
缺点：
操作复杂，费时费力
技术教育13Leabharlann 基本类型抗体测定法
➢ 间接法检测特异性抗体
抗原测定法
➢ 直接竞争法检测可溶性抗原 ➢ 双抗体夹心法检测可溶性抗原
泡时间不可以随意缩短； 甩去液体后在吸水纸上拍干 重复操作2，3，洗涤次数按要求操作
技术教育
27
显色和比色
显色是ELISA中的最后一步孵育反应，此时，酶催化无色的底物生 成有色的产物；
定量实验中，加入底物后的反应温度和时间应该按规 定力求准确；定性测定的显色时间一般不需要严格控 制和及时判断；
2）待测样品：取100μl待测样品加入酶标板，做复孔； 3）空白对照：取100μl 1×Assay diluent加入酶标板，做复孔；
Standard 原液 ½ ¼
1/8 1/16 1/32
50ul
37℃避光孵育1h
技术教育
34
每组4位同学的加样顺序：
每孔加样100μl
待测抗原 100μl
待测抗原 100μl
洗涤可以清除残留在板孔中没有能够与固相抗原或者 抗体结合的物质
免疫学实验二 ELISA(双抗夹心法)1
15
注意事项：
1. 试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀， 弃去1～2滴垂直滴加；
2. 严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性； 3. 应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。
16
思考题：
1.免疫标记技术有哪些？各有何特点？。 2.ELISA操作过程中应注意哪些问题？
酶 生物素
待检标本
底物
5.加底物显色
亲和素
4.加酶标记的亲和素
3.加生物素标记的特异性抗体 2.加待检标本 1.已知Ab包被固相
7
材料和试剂：
1. HBsAg、包被液。
酶
移
标
液
板
器ห้องสมุดไป่ตู้
2.待检人血清。
3.酶标记的抗HBsAb抗体。
4.HBsAb阳性对照血清、HBsAb阴性对照血清
5.洗涤液：PH7.4 0.01mol/L PBS-吐温20。
17
18
2009级医疗专科复习题
一、名词解释2.5*8,共20分
免疫、抗原、抗原决定基(表位)、异嗜性抗原、白细胞分 化抗原、TD-Ag、 TI-Ag、抗体、免疫球蛋白、单（多）克 隆抗体、补体、经典途径、旁路途径、细胞因子、IL、IFN、 CSF、TNF、MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式识别 受体（PRR）、抗原提呈细胞（ APC）、适应性免疫应答、 免疫耐受、免疫调节、超敏反应、人工主动免疫、人工被动 免疫、计划免疫 注：红色标记为要求掌握英文
该技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。
2
实验原理：
• 免疫酶技术是利用酶标记抗体或抗原，以检测 相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。其原 理是酶与抗体或抗原结合后既不改变抗体或抗 原的特异性及免疫反应性，也不影响酶的催化 效能。当存在相应酶底物时，酶能催化产生有 颜色的产物，颜色的有无及深浅能反映相应的 抗原或抗体是否存在及其量的多少。
双抗夹心ELISA法快速检测人用狂犬病疫苗的效价
双抗夹心ELISA法快速检测人用狂犬病疫苗的效价苏文全;廖辉;商一行;张景海【期刊名称】《药学服务与研究》【年(卷),期】2008(8)6【摘要】目的：用单克隆抗体制备的双抗夹心ELISA法，快速检测人用狂犬病疫苗中的狂犬病毒糖蛋白G的含量，并探讨其替代NIH法的可行性。
方法：将疫苗样品用NIH法检定，同时以国家标准品为参考疫苗，用双抗夹心ELISA法检测。
结果：用双抗夹心ELISA法测得的IgED50为2．60～2．78；用NIH法测得的IgED50为2．55～2．85。
对两种检测方法进行F检验，两种检测方法的灵敏度有显著差异（F=5．76，P〈0．05）；用t检验法对这两种检测方法进行分析，表明两组测定值的差异无统计学意义（t=0．187，P〉0．05）。
结论：双抗夹心ELISA法与NIH法测得的IgED50呈正相关性。
与NIH法相比，双抗夹心ELISA 法具有重复性好、成本低、快速等优点。
用双抗夹心ELISA法取代NIH法测狂犬病疫苗效价是可行的。
【总页数】3页(P443-445)【关键词】狂犬病疫苗;双抗夹心ELISA;NIH法【作者】苏文全;廖辉;商一行;张景海【作者单位】沈阳药科大学生命科学与生物制药学院生物工程教研室;辽宁依生生物制药有限公司质量部【正文语种】中文【中图分类】R927.3【相关文献】1.双抗原夹心ELISA检测抗鳗弧菌抗体效价的研究 [J], 边慧慧;蒋继志;黄健;李珊珊;王秀华2.检测抗—HIV双抗夹心法与间接ELISA法比较 [J], 杨晨曦;赵秀平3.双抗体夹心ELISA与NIH法在狂犬病疫苗抗原检测中的比较 [J], 朱蓉;徐葛林;孙文;秦莉;卢影4.用双抗夹心ELISA法快速检测灭活乙型脑炎疫苗的效价 [J], 苏文全;谭煦;刘海娇;杨栋5.双抗体夹心ELISA法检测狂犬病疫苗抗原活性组分 [J], 王玉琳;封多佳;吕宏亮;李薇;马超;魏至栋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
elisa常用方法
elisa常用方法酶联免疫吸附测定(ELISA)为免疫学中的经典实验。
下面是店铺为您带来的elisa常用方法，希望对大家有所帮助。
elisa常用方法：双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。
夹心法利用两种一抗对目标抗原进行捕获和固定，在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性，该方法的检测灵敏度可提高到pg级的水平。
将已知抗体包被到固相表面，加入待检标本，标本中若含有相应抗原即与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入该抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记抗体，加底物后显色。
若标本中无相应抗原，固相表面即无抗原结合，加入的酶标记抗体则不能结合于固相并被洗涤去除，当加入无色底物后，因无酶催化故不显色。
双抗体夹心法适用于测定2价或2价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
elisa常用方法：间接法间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。
先将待测的蛋白包被在孔板内，然后依次加入一抗、酶标记的二抗和底物显色，通过仪器(例如酶标仪)定量检测抗原。
这种方法操作简单但由于高背景而特异性较差，目前已逐渐被夹心法取代。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标二抗建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。
elisa常用方法：竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。
其原理为标本中的抗体一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。
标本中?体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。
如抗原为高纯度的，可直接包被于固相。
如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。
ELISA测定的常用模式一--测定的常用模式一--双抗体夹心法
ELISA 测定的常用模式一测定的常用模式一------双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原 对于含多个抗原决定簇的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA 模式测定相当简便，现有的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。
具体测定方法如下：1．首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
2．加入含待测物的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体反应而吸附于固相上。
3．加入酶标记的双抗体之二，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。
4．加入酶底物，温育显色测定(图2—1)。
在该测定模式中，有两步温育和板孔洗涤步骤，如果将上述测定步骤2和3并为一步，即将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。
最初的双抗夹心ELISA 试剂盒，均采用两步法。
后来，人们为了节省时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。
目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HBsAg、。
FP 和hCG 等，基本上都采用一步法。
一步法相比于两步法，虽然操作简单‘但有其固有的缺陷，处理不好，对ELISA 测定结果有严重影响。
在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原(Ag)浓度逐步增加时，将使固相抗体(Ab)与抗原的结合逐步达到饱和[(1)式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体(Ab’)后，a 复合物的形成将直接与在第一步中形成的b 复合物相关[(2)式]，因此，待测抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，而呈S 形变化曲线(图2—2)。
而一步法双抗夹心ELISA 的反应曲线则为钟形曲线(图2—3)。
ELISA的种类及原理
关于 ELISA 的分类众说纷纭，不同文献从原理或操作上都有不同的分类 意见。这里先将 ELISA 分为以下四大类，然后针对每一类进行详细讲解：(1) 直接 ELISA；（2）间接 ELISA；（3）夹心 ELISA；（4）竞争抑制 ELISA。其 它的 ELISA 都隶属于这四类 ELISA 或由这四类 ELISA 组合衍生。
由于二抗一般为多抗，因此一个一抗分子上可以结合多个二抗分子，同 时一个二抗分子上可以标记上多个酶分子，所以当待测抗体为多抗时（可以由 多个一抗分子与抗原结合），信号经过两步放大，最终提高了检测的灵敏度。 另外由于二抗制备比较容易，而且很早就开始商品化，所以操作者无需要将一 抗进行酶标，大大缩减了工作量。在检测抗体的效价、血清的效价以及单克隆 抗体的筛选过程中，间接 ELISA 都是非常重要的实验过程，在临床诊断中， 间接 ELISA 也是检测标志性抗体的重要手段。
3
本手册由中国免疫学实验网( )转自 Proteintech Group.
图 2 间接 ELISA 原理
夹心 ELISA
夹心 ELISA（Sandwich ELISA）总体上可以分为两种：直接夹心 ELISA 和间接夹心 ELISA。
直接夹心 ELISA 直接夹心 ELISA 又分为双抗夹心 ELISA 和双抗原夹
直接 ELISA................................................................................................2 间接 ELISA................................................................................................3 夹心 ELISA................................................................................................4 竞争抑制 ELISA........................................................................................7 ELISA 实验的操作..........................................................................................10 将抗原或抗体吸附到固相载体上 ...........................................................10 封闭 .........................................................................................................12 加入待检样品以及后续试剂 ................................................................... 12 温育 .........................................................................................................12 洗涤去掉游离未结合的反应物 ...............................................................13 加入酶检测底物 ......................................................................................13 结果的判读 .............................................................................................. 13 ELISA 实验常用试剂详解 ..............................................................................13 ELISA 常见问题及分析 ..................................................................................16
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
２ １ 间 接 Ｅ ＩＡ 法 两 个 厂 家 的 试 剂 盒 共 检 出 ３ ． ＬＳ ９
份 阳性标本 ， ３ 份标本用双抗夹心法做只有一个 这 ９ 弱阳性 ， Ｏ 其 Ｄ值在 阈值下 １ ％灰 区内（ ｕｏｆ ． ０ Ｃ ｔ ＝０ ｆ １１ ， ３ ）确证试验（ ｗＢ） 法结果全部为阴性 ： 见表 １ 。 Ｅ Ｉ ＬＳ Ａ法中新创 、 比爱假 阳性 率 比较 ： 吉 Ｘ＜
２ 结 果
从 表 １ 出 ， ＩＡ法 不 同试 剂 之 间有 交 叉 现 看 ＥＬＳ
象， 即新创 阳性 的吉比爱可能是阴性 ， 吉比爱 阳性 的
新创可能是 阴性 ， 但都是 假 阳性 ， 阳性率 无差别 假
（ ＞ ．５ ； Ｌ Ｓ Ｐ ０ ０ ）Ｅ ＩＡ法与双抗 夹心法假 阳性 率 比较 存在显著差异（ ＜０ ０ ） Ｐ ．５ 。
十一一。 一十一十 一， ＋十一一一等模 式 共 ２ ６ ， ３ ９ ％， 些不大符合 乙肝病毒感染 ４ 例 占 ．１ 这
一 一
。
实践和科学发展 ， 做出合理满意的解释。
的模式 ， 可视为特殊表现 。这些反应模式各家报道
检 测 抗 一ＨＩ 双抗 夹 心 法 Ｖ 与 间接 Ｅ ＩＡ 法 比较 ＬＳ
泰 安市 红 十字会 中心血 站 （７ ００ 杨晨 曦 ２ １０ ） 赵 秀平
抗． Ｉ １ ） Ｈ Ｖ（ ＋２ 初筛试验 过去多用 间接 Ｅ ＩＡ ＬＳ 法， 近两年 ， 双抗夹心法 ， 逐渐进入各个实验室 ， 特别 在 血 站 系统 应用 较 广 。笔者 就本 实验 室应 用 上述 两
差 别。
表 １ ３ 份确证试验两种 比较表 ９
１１ 标 本 ２ ０ ～２ ０ 年 ６月 以来 ， ． ００ ０ １ 本站无偿献 血者 ３ ９ ６ ， ０７ 人 间接 Ｅ ＩＡ法初筛 ３ ＬＳ ９份阳性标本 （ 厦门新创 ２ 份 ， １ 北京吉 比爱 ２ 份）卫生部临检 中 ４ ， 心发放 的抗 ． Ｖ（ ＋ ） ＨＩ １ ２ 室间质评血清 ２ 份 。 ０ １ ２ 检测试剂 间接 Ｅ ＩＡ法试剂 由厦 门新创科 ． ＬＳ 技 有 限公 司提 供 、 京 吉 比爱 生 物 技 术 有 限公 司 提 北 供， 双抗夹心法试剂由北京金豪制药有限公司提供 ， 确证试验 由泰安市卫生防疫站艾滋病实验室采用蛋 白印迹法（ ） ｗＢ 检测 。 １ ３ 实验方法 本站无偿献血标本及 ２ 份室间质 ． Ｏ 评血清复检 （ ） 一 用北京 吉比爱 Ｅ ＩＡ法检测 ， ＬＳ 复检 （ ） 二 用新 创 ＥＬＳ ＩＡ法 检测 ， 何一 种 试剂 检 测 阳性 任 的标本用 同样的试剂加双孔重试 ， 为阳性再用北 仍 京金豪试剂双抗夹心法再检 ， 同时将 Ｅ ＩＡ阳性标 ＬＳ 本送泰安市卫生 防疫用蛋 白印迹 （ ｑ） ｗ ３法做确证试 验， 所有检测严格按试剂盒说 明进行操作 。 １ ４ 仪器设备 瑞士全 自动样本处理机 Ａ Ｐｕ ； ． Ｔ Ｉ ２ ｓ 瑞 士全 自动酶 免 分 析仪 Ｆ ＡＭＥ； 地 利 高 级 孵 育 酶 奥 标仪 ＨＴ 。 ３
报废率较高。双抗夹心法与确证实验符合 率较 高 ， 具 有更 好 的 准 确 性 ， 适 用 于 抗一 ＨＩ １ ） 初 更 Ｖ（ ＋２ 的 筛。
１ 材料 与 方法
瑶．， ＞０ ０ ， 。 Ｐ ．５ 无差别； ＬＳ Ｅ ＩＡ法与双抗夹心法假 阳性率比较 ：２ ６ ．８ｘ ＞瑶 Ｐ ．１ ） ＝ ２２ ，２ （ ＜００ 有显著
心法与确证实验结果符合率远 高于 Ｅ ＩＡ法 ， 明 ＬＳ 说
维普资讯
泰山卫生 ２０ 年 第 ２ 卷 第 ０２ ６
・
３ ・ ３
Ｅ ＩＡ法存在一定 程度 的假 阳性 ， 液报废较 多。 ＬＳ 血 引 起 Ｅ ＩＡ假 阳性 的原 因不 明 ， 能与 不 同厂 家微 ＬＳ 可 孔包被抗原成份不同、 并且只能检测 ＩＧ、 ｇ 及类风湿 因子及其它相关性逆转录病毒感染所引起的干扰所 致； 而双抗夹心法抗一ＨＩ １ ２ 试剂盒 ， Ｖ（ ＋ ） 采用基 因 工 程抗 原 ｇ４和 ｇ３特异 性抗 原 混合 包 被 酶 联 反应 ｐ。 ｐ 板 ， 使 用 酶 标 二 抗 ， 之 以 酶 标一 ＨＩ 特 异 性 抗 不 代 Ｖ
２２ ０份卫生部临检中心发放 的抗一ＨＩ ． ２ ｖ室间质 评血清 ， ＬＳ Ｅ ＩＡ法 、 双抗夹心法检测结果完 全一致 ， 与确证实验结果符合 率均为 １０ 并 且确证试 验 ０ ％，
阳性标本 ， 初筛实验 Ｅ ＩＡ法 、 ＬＳ 双抗 夹心法 阳性都
很强。 ３ 讨 论
Ｅ ＩＡ法 、 抗 夹 心 法 用 于 抗 一 ＨＩ １ ） ＬＳ 双 Ｖ（ ＋２ 的 初筛 ， 其检 测结 果 与 ＷＢ确 证 结果 比较 ＋ 一 ，＋ 一 ＋ 一 一 ，一 一 ＋ 一 ＋ ，十 一 一
，
一 一
不一 ， 整个乙肝五项指标反应模式约有 ３ ０多种 ， 本 组 材料 有 １ 。尽 管 目前 对 一 些 罕 见 反 应 模 式 无 ８种 法 解 释或解 释 不 令 人 满 意 ， 它是 客 观 事 实 。 当然 但 其 中也有 技术 原 因 。我科 对 罕见 的模 式 经 复检重 现 相同结果 ， 即予报告。这些罕见模式有待今后更多
维普资讯
・
３ ・ ２
泰山卫生 ２０ 年 第 ２ 卷 笫 ５ ０２ ６ 期
二项阳性的有 １８ １０例 ， １ ． ％， 占 ８ ８ 说明本地乙肝传
染 源 也很 普 遍 。 ３ ５ 本 组 材料 检 出一 些罕 见 的反应 模 式 ， 一 ＋ 十 ． 如