重组质粒构建图文
重组质粒的构建
重组质粒的构建重组质粒的构建是基因工程的核心步骤之一，其目的是将目的基因插入到质粒载体中，以实现目的基因的稳定表达和克隆化。
以下是重组质粒构建的主要步骤：1.目的基因获取首先需要获取目的基因。
目的基因可以从基因文库、PCR、基因组测序等方法中获取。
根据需要选择合适的方法，将目的基因克隆到质粒载体中。
2.载体质粒选择选择适合的质粒载体是重组质粒构建的关键步骤之一。
根据目的基因的特点和表达要求，选择适合的质粒载体。
常见的质粒载体有pET、pUC、pBluescript等。
3.限制性酶切限制性酶切是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过限制性酶切，将目的基因和质粒载体分别切开，露出粘性末端，以便于连接反应。
4.连接反应将切好的目的基因和质粒载体的粘性末端连接在一起，形成重组质粒。
连接反应需要使用T4DNA连接酶或其它连接酶进行催化。
连接反应需要在适宜的温度和pH 条件下进行一定时间，以确保重组质粒的正确构建。
5.转化宿主细胞将连接反应得到的重组质粒转化到宿主细胞中。
常见的宿主细胞有细菌、酵母、昆虫等。
转化方法有多种，如电穿孔法、化学转化法等。
转化后需要在适宜的培养条件下进行培养，以获得大量的重组质粒。
6.克隆筛选克隆筛选是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过克隆筛选，可以确定重组质粒是否正确构建。
常见的克隆筛选方法有蓝白斑筛选、酶切法等。
7.序列验证最后需要对重组质粒进行序列验证，以确保目的基因的正确插入和序列的准确性。
序列验证可以通过Sanger测序等方法进行。
质粒构建从入门到精通
质粒构建从入门到精通今天我们就来说说质粒构建——一名合格「快递员」的养成记。
质粒构建的原理外源 DNA 经 PCR 扩增后，用限制性内切酶分别切割载体和外源DNA 片段，DNA 连接酶将二者进行连接，然后转入宿主细菌，通过筛选鉴定获得重组克隆。
经过一系列的操作，「快递员」质粒就完成了呈递目标片段的工作。
质粒构建流程示意图质粒构建的步骤「快递」目标片段的过程主要有三个步骤：▼▼▼01PCR 扩增「快递」准备，首先要对目标片段进行扩增富集。
PCR 即聚合酶链式反应，它是一种用于扩增复制特定 DNA 片段的常用分子生物学技术。
PCR 的最大特点是能将微量的DNA 大幅扩增，在克隆前获得大量的目标基因片段。
PCR 扩增简要步骤：利用引物设计软件如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在线设计引物并合成后，配制PCR 反应体系：将模板、引物、dNTP、酶、反应缓冲液和 ddH₂O 按比例加入，加好后轻微点离，放入 PCR 仪中扩增目的片段，扩增后通过琼脂糖凝胶检测目的片段大小是否正确。
Tips▼扩增过程中的关键点▼QPCR 扩增中随着拷贝数的增加经常会出现二聚体、非特异性条带（大小不对）的现象。
答案点击下方空白处获得答案A：通过降低模板和引物浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量，提高退火温度，可以提高扩增特异性。
此外引物设计的好坏是关键。
除了按照常规引物设计规则外，构建载体时通常会在引物序列上添加酶切位点和保护碱基。
常规引物设计原则1.引物长度：18-30bp，常用 20-22bp 左右。
2.引物 Tm 值最好在60℃ 左右，两条引物间 Tm 值要保持接近，最好不超过5°C。
3.GC 含量 40%-60%，45-55% 为佳。
4.引物自身不应有连续4 个及以上碱基的互补，避免形成发卡结构。
5.引物之间不应有连续4 个及以上碱基的互补，避免形成引物二聚体。
6.3' 端避免连续碱基的重复，如 GGG 或 CCC 会导致错配的发生。
质粒构建步骤
质粒构建步骤
嘿，你问质粒构建步骤啊？这事儿还挺复杂，不过咱慢慢说。
第一步呢，得先确定你要构建啥样的质粒。
就像你要盖房子，得先有个设计图吧。
想好你要把哪些基因放进去，要让质粒有啥功能。
这可不能瞎整，得有个明确的目标。
第二步，准备材料。
你得有合适的载体质粒，就像盖房子得有块地一样。
还有你要插进去的基因片段，这就好比盖房子的砖头瓦块啥的。
还得有各种酶啊，像剪刀一样把东西剪开再拼起来。
第三步，把基因片段剪下来。
用特定的酶在合适的位置把基因片段从原来的地方切下来。
这就像用剪刀把一块布剪成你想要的形状。
得小心点，可别剪坏了。
第四步，把基因片段插进载体质粒里。
这就像把一块拼图放进一个大拼图里一样。
用另一种酶把载体质粒打开一个口子，然后把基因片段塞进去。
再把口子封上，让它们连在一起。
第五步，验证一下你构建的质粒对不对。
可以用一些方法，比如测序啊，看看基因片段是不是插对地方了，有没有弄错啥的。
要是不对，就得重新来过。
比如说有个科学家想构建一个能让细菌发光的质粒。
他先想好要把哪个发光基因插进去，找好了载体质粒和各种酶。
然后小心翼翼地把发光基因剪下来，插进载体质粒里。
最后验证的时候发现插对了，可高兴了。
把这个质粒放到细菌里，细菌就真的发光了。
所以说啊，质粒构建可不是件容易的事，得一步一步来，细心又耐心。
咋样，现在知道质粒构建的步骤了吧？。
重组质粒的构建解析
【器材】
水浴锅、灭菌Tip头、0.5mlPCR管、加样枪
【试剂】
Buffer、限制酶1、限制酶2、重组质粒、灭菌水
【实验步骤】
第一次使用本试剂盒时，请将RNase A1混浊液全部加入到SolutionⅠ中，均匀混合后4℃保存。实验操作前请将Solution Ⅲ置于4℃（或冰上）预冷后使用。
1.大肠杆菌的培养。
从平板培养基上挑选单菌落接种至1～4 ml的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养。
注）培养液不宜过量，培养液过量时，会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。
5.当电泳后片段需回收时，选用大孔胶，当电泳只起检测作用时，选用小孔胶。
6.若电泳产物需要回收，则需换新的缓冲液。
7.本实验室有两种常用Marker,分别为DL2,000 DNA Marker和λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker。Agarose电泳图像示意图如下:
4.PCR
【器材】
6.目的片段与载体连接及转化...........................................................8
7.菌种保藏…………………………………………………………...9
8.双酶切反应..10
实验流程——质粒构建
基因提取——1、2、3
PCR反应扩增目的基因——4、3
【试剂】
琼脂糖（Agarose），TAE电泳缓冲液，EB，Marker
【实验步骤】
1.称取1g琼脂糖（Agarose）粉末于锥形瓶中，加入100mlTAE。保鲜膜封口，扎孔。
2.在微波炉中加热，沸腾两次，直到看不出油滴，形成均一的溶液。
3.倒入污染区的锥形瓶中，待冷却至60℃时加2ulEB，混匀。
质粒构建
PCR（多聚酶链式反应）一、实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。
基本原理及过程如下：PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。
1、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2、退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。
3、延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。
二、按下列组份配制PCR 反应液TaKaRa LA Taq（5 U/μl）0.5 μl10×LA PCR Buffer II（Mg2+ Plus） 5 μldNTP Mixture（各2.5 mM）8 μl模板DNA（λDNA）* 2.5 ng引物1（10 μM） 2 μl引物2（10 μM） 2 μl灭菌蒸馏水up to 50 μl*【50 μl PCR反应体系中模板DNA 推荐使用量】人基因组DNA 0.1 μg～1 μg大肠杆菌基因组DNA 10 ng～100 ngλDNA 0.5 ng～5 ng质粒DNA 0.1 ng～10 ng三、PCR 反应条件。
以λDNA 为模板，扩增 1 kbp、35 kbp 的DNA片段的PCR 反应条件如下：【1 kbp】95℃ 5 min.95℃30 sec.55℃30 sec. 35 Cycles72℃ 1 min.72℃10 min.【35 kbp】94℃ 5 min.98℃10 sec.68℃15 min. 35 Cycles72℃10 min.常用循环：95℃ 5 min.95℃45 sec.55℃45 sec. 35 Cycles72℃ 2 min.72℃10 min.四、可能出现的问题与解决方案：1、假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。
质粒构建全过程
6 对载体进行切胶（110V，25-30min）回收后测浓度（nanodrop）
7 目的基因与载体的连接（一般20ul体系），16℃，1h（于PCR上保持）
8 对连接产物进行转化涂板（260rpm，转化42℃必须精准，全部涂板）
质粒构建全过程：
1 选择合适的模板进行PCR（一般50ul体系），P出目的基因
2 PCR产物进行回收（5ul用于跑胶鉴定（110V，25-30min），45ul用PCR产物回收试剂盒进行回收）
3 对回收后的PCR产物进行浓度测定（nanodrop）
4 同时对目的基因和载体进行酶切（37℃，3h，一般酶切1ug）
9 次日晚挑克隆，小试管摇过夜
10 对克隆出的菌液进行小抽
11 对小抽出的质粒进行酶切鉴定（一般酶切1ug质粒）
12 如有阳性结果，则送测序
13 测序正确后，可进行中扩增保存备用
重组质粒的构建
重组质粒的构建实验流程—质粒构建实验操作一、LB培养基配置LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。
其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。
【试剂】胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar）【实验步骤】1、LB固体培养基配方（配置100ml培养基）胰蛋白胨（Tryptone） 1g酵母提取物（Yeast Extract）0.5gNaCl 1g琼脂（Agar）1.5g单蒸水100ml蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。
2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。
3、包扎用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
4、灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。
灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。
5、LB固体培养基倒板○1配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。
○2抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
○3倒板：一般10ml倒1个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10—15min。
○4保存:将培养皿倒置放于4℃保存，一个月内使用。
二、质粒的提取（protocol）1、大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。
【注：培养液不宜过量，过量时会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。
】2、5ml菌液倒入5ml离心管中，10,000xg，1min离心，弃上清。
构建重组质粒基本方法解析
构建重组质粒基本方法1. cDNA编码区片段的PCR扩增50ul 区模版15引物13引物1dNTP 110 ^buffer 5Taq 1Milliq H2O 402. PCR产物纯化1、加5倍体积的PB2、将Spin柱放于2ml收集管上3、加样液，14Krpm，离心1min4、弃去排出液5、加0.75ml PE, 14Krpm,离心1min6、弃去排出液,14Krpm,离心1min7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中8、往Spin柱的膜中央加入50卩l的EB（或milliq H 2O,静置2min, 14Krpm，离心1min3. 双酶切载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul , 37E，酶切n小时）：PCR产物20ul载体10ul10x buffer 3ul10x buffer 3ul100xBSA0.3ul100xBSA0.3ul酶11ul酶11ul酶21ul酶21ulMilliQ H2O14.7ul MilliQ H2O 4.7ul4 •双酶切后的载体用试剂盒割胶回收1. 割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100卩l的体积）2. 50C，恒温10min,等到胶完全被溶解3. 将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中4. 加样液，14Krpm，离心1min5. 弃去排出液6. 加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min7. 弃去排出液,14Krpm,离心1min8. 将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中9. 往Spin柱的膜中央加入50卩l的EB（或milliq H 2O,静置2min, 14Krpm，离心1min5. 连接上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16C连接过夜。
连接体系如下：载体2ulPCR片段6ul10xT4 buffer 1ulT4 DNA ligase 1ul6.转化取上述连接液5卩l转化到预先制备的DH a化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42C 热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37C摇床45min,离心5000rpm, 1-5min （不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul ）。
重组质粒的构建
重组质粒构建生物学——屠仁军(新浪) 一、载体与外源片段（PCR产物）的双酶切为了保证做连接反应时有足够的外源DNA片段，应该加入1ug的DNA进行酶切反应；两种酶分别加1ul，10×buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。
（因此要跑胶分析DNA以及载体的浓度，取1-2ul，电泳检测其含量。
1ul体积太少，可以将其稀释在9ul水中，再加loading buffer。
6ul 15000bp的marker，2500bp条带的亮度约是100ng DNA。
可对比marker的亮度算出酶切回收的DNA的浓度，以便于确定连接反应时的用量。
Image J软件可以做灰度分析。
）双酶切反应结束后，使用PCR cleanup试剂盒回收DNA与载体。
回收完之后用同样的方法分析其浓度。
（也可以用分光光度计直接测量DNA的浓度，但是，一般酶切反应之后其浓度会比较小，取1ul 稀释100倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。
）二、连接反应载体100ng，DNA片段根据大小，1ul buffer，1ul T4连接酶，加水至10ul；16℃连接12-16h。
载体（约0.03pmol）与外源DNA的摩尔比大约1：3-1：10之间，根据载体与DNA片段的长度，可算出需要的量。
因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出0.03pmol的载体的质量意义不大，大约100ng即可。
如果时间比较紧，可以25℃连接15min，之后可取5ul进行转化，剩余5ul于16℃继续连接。
三、质粒转化到感受态大肠杆菌中从-70℃中取出感受态，指尖轻转融化后立即插入冰上，5ul连接产物+100ul感受态大肠杆菌，充分混匀后冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP管。
然后立即插入冰上，静置2min。
（连接产物的量尽量不超过感受态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。
质粒的构建.正式版PPT文档
载体lacZ’与互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码肽与这个 缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使 它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生 蓝色物质。
N端的11-41aa
C端大部分
pUC lacZ’
受体菌lacZ∆
互补的插入失活
pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位
点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合
pBR322的缺点 保留了转移蛋白（mob）的作用位点。
能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别， 如果再有F质粒的参与，就有可能转移！
PBR322的改进
① 删除mob识别位点
（如质粒pBR327、pAT153等）。
pAT153：
从pBR322上切去HaeII片断，既除 去了mob识别位点，又增加质粒的 拷贝数。
受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的 氨基端有缺失（缺失肽），不能形成 4聚体的活性酶，不能分解Xgal
受体菌株：JM系列、TG1、TG2、 XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、 MV1184、DH5a
② -半乳糖苷酶Xgal显色反应：
-半乳糖苷酶能把无色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的 物质5-溴-4-氯靛蓝。
Ampicillin 抗性和 lacZ的 肽互补（蓝白斑）相结合。
保留了转移蛋白（mob）的作用位点。
（2）长度 约2.7kb （3）克隆位点 10个连续的单一限制酶切位
点，位于lacZ’基因的5’端。
pUC18/19
选择标记
Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互补（蓝白 斑）相结合。
筛选方法 噬菌体(或病毒)载体；
lacZ只有在4聚体的状态下才有功能. 穿梭载体 可以在不同的宿主细胞中复制 如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。 （如质粒pBR327、pAT153等）。 其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）；
质粒构建课件
Consensus sequence: GCC GCC A/GCC ATG G
-3,
1, 2, 3, 4
Open reading frames
Product (fusion protein): Target protein + GFP
EcoR I 5’ GA ATT C
Insert (ATG XXX …… XXX )
Transformation & Identification
PCR identification: Taq DNA polymerase Digestion identification Sequencing identification: sangong or invitrogen
EcoR I CGGAATTC
BamH I neb/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cleavage_oli gnucleotides.asp
CGGGATCC
Kozak translation initiation site
Initiation of translation in eukaryotes.
pCS2(GFP)
……
/vectordb/
Gene cloning
Target gene: hBex2 Vector selection Primer design Amplification, digestion & ligation Transformation & Identification
BamH I XXG GAT CC 3’ ……EGFP
Open reading frames
重组表达质粒的构建
重组表达质粒的构建重组表达质粒的构建1．原核表达载体选择质粒载体是重组蛋⽩表达的关键⼯具，其结构如下图。
重组蛋⽩表达，我们⾸先要将基因插⼊到表达载体上，插⼊的位置为多克隆位点。
质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋⽩的表达都是⾄关重要的。
尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋⽩不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。
这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动⼦和融合标签的差异。
蛋⽩表达优化主要⼯作也就是尝试构建不同融合表达标签，使⽤不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。
常⽤的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。
福因德⽣物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。
我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋⽩怎么表达成功，更要考虑蛋⽩怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。
以上为原核表达常⽤的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业⽹站或专业书籍已对此做详尽解释，科研⼯作者可根据具体实验设计⽅案，组合设计以上标签和酶切位点的使⽤。
特别值得注意的是，选⽤和设计蛋⽩酶切位点的时候⾸要考虑的是序列内部有没有蛋⽩酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋⽩酶试剂成本。
⼀般商业化载体，在标签蛋⽩与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。
标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签⾼效翻译起始位点带动插⼊蛋⽩的表达,可溶性标签的⾼效表达更可促进蛋⽩的可溶性表达;同时,⼤部分的蛋⽩内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。
在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引⼊了可与别的蛋⽩相互作⽤的序列或者蛋⽩酶切位点。
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定解析
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4. 掌握利用Cacl2感受态细胞的方法。
5. 学习掌握热击法转化 E.coli的原理和方法。
6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1. 重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
实验四.重组质粒载体的构建
生物技术大实验—实验四
重组质粒载体的构建
• 限制性酶切概述 • DNA片段的回收 • 重组质粒的构建 • 实验仪器设备 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限 制性内切酶本身都会影响限制性内切酶 的活性。大部分限制性内切酶不受RNA 或单链DNA的影响。当微量的污染物进 入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进 一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每 次都要用新的吸管头。如果采用两种限 制性内切酶,必须要注意分别提供各自的 最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则 可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低 盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随 后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内 切酶水解。
也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿 抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙 醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥 并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理 图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶 切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序 列分析、基因组是不可缺少的环节，近年来发展起来的 RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它 的基础上。
4、 观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对 DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时,应 尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300360nm）,以减少紫外光切割DNA。 5、 EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时 都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。 凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理 后才能清洗或丢。 6、 当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将 胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。