Western印迹
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
western blot技术
百泰派克生物科技
western blot技术
蛋白印迹（Western Blot，WB）也称免疫印迹，是一种基于抗体的蛋白质分析技术。
利用抗体-抗原的特异性相互作用可以在复杂的蛋白质混合物中识别感兴趣蛋白
（目标蛋白质），以实现感兴趣蛋白的定性和半定量分析，在蛋白质表达水平、抗
体活性、蛋白质相互作用以及蛋白质翻译后修饰分析中广泛应用。
WB主要包括以下步骤：
（1）样品分离：利用SDS-PAGE分离蛋白混合物；
（2）转膜：将蛋白条带从凝胶转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。
固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的蛋白质生物学活性不变。
转移后的
NC膜就称为一个印迹（blot）；
（3）标记鉴定：用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。
用一抗处理过的NC膜再用二抗处理，二抗是指一抗
的抗体。
通常，第二抗体带有特殊标记，当与合适的底物结合时，会产生可检测的荧光信号，信号强度与膜上的目标蛋白的丰度相关。
通过以上步骤，可以捕获与一抗相互结合的感兴趣蛋白，用于判断感兴趣蛋白的存在与否以及一抗与感兴趣蛋白的相互作用分析；此外，还可根据荧光信号强度对目标蛋白进行半定量鉴定，用于蛋白质白表达水平分析。
百泰派克生物科技基于蛋白印迹WB以及Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC提供蛋白质分析服务技术包裹，包括蛋白质定性定量
鉴定、蛋白质相互作用分析以及蛋白质翻译后修饰分析等，还可根据需求提供其他定制化检测方案，欢迎免费咨询。
WB实验步骤详解
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
简述western印迹的基本过程
简述western印迹的基本过程Western印迹是一种常用的分子生物学技术，它可以检测蛋白质的存在、分子量和相对丰度。
Western印迹技术主要包括以下几个步骤：样品制备、电泳分离、转膜、阻断、一抗和二抗探针探测等。
一、样品制备Western印迹技术需要使用样品来进行分析，通常我们需要从细胞或组织中提取蛋白质。
提取方法可以根据不同的实验目的进行选择，例如RIPA缓冲液法、SDS-PAGE法等。
提取后的蛋白质需要经过浓缩和纯化处理，以便于后续的电泳分离。
二、电泳分离将制备好的样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。
根据蛋白质大小不同选择不同浓度的凝胶，通常使用10%或12%聚丙烯酰胺凝胶。
在电泳过程中，蛋白质会被拉伸成条状并向阳极移动。
三、转膜将电泳分离后的蛋白质转移到聚乙烯膜上。
转膜的目的是将凝胶上分离出来的蛋白质迁移到一个新的固体载体上，以便于后续的探测。
通常使用半湿式或干式转膜法。
四、阻断在转膜后，需要对聚乙烯膜进行阻断处理，以避免非特异性结合和减少假阳性结果。
通常使用5%的非脂类奶粉或3%的BSA进行阻断处理。
五、一抗在阻断处理后，加入第一抗体进行特异性结合。
第一抗体可以是单克隆或多克隆抗体，具有高度特异性和亲和力。
将第一抗体加入后，在室温下或4℃下孵育数小时甚至过夜。
六、二抗探针探测加入与第一抗体来源不同物种的二抗（例如羊或马）与荧光素等探针进行反应，通过荧光素发射信号检测目标蛋白质的存在、分子量和相对丰度。
Western印迹技术中最常用的二抗是HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗。
七、成像和分析Western印迹技术的结果可以通过化学发光、荧光或放射性等多种方法进行检测。
Western印迹技术的结果通常以数字图像的形式保存下来，可以使用专业软件进行分析和定量。
综上所述，Western印迹技术是一种常用的分子生物学技术，通过样品制备、电泳分离、转膜、阻断、一抗和二抗探针探测等步骤，可以检测蛋白质的存在、分子量和相对丰度。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
实验6、7 Western印迹
六．发光鉴定
• • • 一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。 1．HRP-ECL发光法： 将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反 贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸 贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所 见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后 放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫 描。 2．AP-NBT/BICP显色法： 每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个 EP管中，每张 3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍 加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体 （如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现 时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。
四、注意事项
• 内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表 达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验 误差，保证实验结果的准确性。 在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的 同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校 正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个 Western Blot显色或者发光体系是否正常。 常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋 白含量不会发生改变的蛋白作内参。 1. 为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳 性对照（最好有标准品（比如β-actin， GAPDH）或阳性血清）；阴性 对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加一抗，用PBS 代替）；无关对照（用无关抗体） 2. 一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。 3. 实验设计时所釆用的抗原批次要一样，尽量的避免人为的带来个体差异。特别在做裂解液时更要注意所釆用的操 作条件，尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。 4. 凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意P 和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。 5. 电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气 泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。 6. 封闭时一般在室温下2h就够了，但是要注意如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用 BSA效果更好。 7. 加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的 匹配。 8. 在显色发光时要特别注意二抗所对应的显色方法，特别是在发光时要注意发光时间和显影时间的控制，以看得清 楚目的条带为标准。
蛋白质——Western印迹杂交技术
Western印迹杂交技术一、原理SDS-PAGE电泳分离不同相对分子量的蛋白质并转移至尼龙膜等固相载体上，以载体上的蛋白质作为抗原，与一抗特异性结合，再与标记的二抗反应，经显色或显影检测特异性蛋白质。
二、操作1、蛋白质样本制备根据样本不同来源、种类、性质以及蛋白质的分布，采用不同的裂解方法，加入适宜的蛋白酶抑制剂，在低温条件下操作，以减少提取蛋白质过程中造成的降解。
2、SDS-PAGE将适量含有SDS的缓冲液加入蛋白质，高温变性，SDS将与蛋白质充分结合，形成SDS-蛋白质复合物(使蛋白质分子带负电荷，且远超蛋白质分子原有电荷，以消除蛋白质极性区别，使蛋白质分子只按分子量大小分离)。
Western印迹技术多采用不连续的SDS-PAGE电泳。
凝胶分为积层胶和分离胶，积层胶的浓度为5%，主要用于蛋白质的浓缩和集中。
而分离胶浓度常为6%~15%。
分离的靶蛋白越大所需要的分离胶浓度越低。
Staking gel ：积层胶Separating gel ：分离胶Sample ：样本Well ：加样孔Direction of migration ：分离方向3、转膜Western印迹的固相支持物包括硝酸纤维素膜和聚偏氟乙烯膜。
转膜缓冲液由缓冲系统和甲醇组成，有时也可加入少量SDS以提高转移效率。
4、封闭此过程主要降低非特异性结合优化背景。
常用的封闭剂有脱脂奶粉，牛血清白蛋白等。
(与Southern 印迹杂交和Northern 印迹杂交中预杂交的目的相同)5、靶蛋白与抗体结合一抗与蛋白质结合二抗与一抗结合二抗多为酶，催化底物显色。
6、显色三、临床应用Western Blot 方法是目前最为敏感和特异的HIV检测方法，也是我国对HIV感染的确证实验。
Western印迹法原理、操作步骤及应用
Western印迹法的原理及应用一、原理免疫印迹法（Western印迹法）是将经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或放射性核素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
典型的印迹实验包括三个步骤：①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性、非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。
免疫印迹法克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
二、材料Western印迹法所需材料包括SDS-PAGE试剂，硝酸纤维素薄膜，匀浆缓冲液，转膜缓冲液，膜染色液，显色液，酶标二抗及其底物等。
三、操作步骤（一）样品制备培养细胞及组织样品加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5～1分钟。
细菌诱导表达的原核细胞，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞。
然后4℃，13 000g离心15分钟，取上清液作为样品。
（二）SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前对蛋白质进行分离、纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，可与蛋白质结合，使蛋白质变性并带上大量负电荷。
SDS-PAGE是最常用的凝胶电泳技术。
它通常采用不连续电泳系统，即用上层胶（成层胶）和下层胶（分离胶）两种不同浓度的凝胶灌制凝胶板。
SDS-PAGE通过其电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。
抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
westernblot原理
westernblot原理
Western Blot（西方印迹法）是一种鉴定蛋白质的细胞生物学实验技术。
它利用电泳
技术将感兴趣的蛋白质从细胞内及外的复杂的混合物环境中分离出来，然后在一特殊条件
下将其用抗体、特异性反应连接物或其他特定标记检测方法检测出来。
Western blot技术的基本原理与免疫学原理一致，即检测抗原的特异性抗体的特性。
例如，当抗原蛋白质混合物中存在特异性的抗原性基因片段时，检测抗原蛋白质的抗体将
特异性地结合到抗原基因片段上，而检测抗原蛋白质混合物中不存在的或者很少存在的其
他抗原性基因片段，则不会被特异性抗体结合，而是被特定标记检测方法检测出来。
Western blot实验技术步骤包括：1）将抗原性蛋白质混合物经过抗体特异性抗原基
因片段的凝集形成蛋白质复合体；2）利用电泳技术将能够形成蛋白质复合体的蛋白质物
质从细胞内和外的复杂环境中分离出来；3）在一定条件下用抗体或其他特定标记检测方
法将这些分离出来的蛋白质物质检测出来，根据检测结果判断各个抗原之间的关系。
Western blot实验技术的优点在于它能够快速、简单的检测抗原性蛋白质的特异性，它也可以检测在细胞内外复杂环境中出现的相对较少的蛋白质物质，尽管抗体的能力有限，受到环境的影响，但仍可以达到较高的检测精度。
由于西方印迹法可分离复杂混合物中不
同的蛋白质，因此它是生物学实验研究中必不可少的一部分，广泛应用于细胞学、分子生
物学和分子遗传学等领域。
westorn印迹
western印迹也称Western免疫印迹（WesternBlot或WesternBlotting），是指将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移至到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，然后用抗体通过免疫学反应检测目的蛋白，分析基因的表达程度。
与之相对应，用标记的核酸探针杂交检测固定在固相载体上的DNA样品的方法称为Sorthern印迹杂交；检测RNA的方法称为Northern印迹杂交。
编辑本段一、原理固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
编辑本段二、分类western显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
编辑本段三、试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O 去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
Western印迹法
Western 印迹法Western印迹法又称为免疫印迹（immunoblot）。
是用特异性抗体鉴定已被分离并转移到一种膜上的蛋白质混合物中的特殊抗原的方法。
即针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测的方法。
Western Blot 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上（固相载体以非共价键吸附蛋白质，并能保持其类型和生物学活性的不变）。
二、基本原理当蛋白质经高分辨率的SDS-PAGE电泳后，可被分离成许多不同的蛋白质区带，由于蛋白质的各个组分被固定于凝胶的网状结构中，可以将电泳后的蛋白带经电转移技术，转移到固相的硝酸纤维素膜上，再和特异性的抗体结合，经直接或间接抗原-抗体反应显示特异性的阳性条带。
Western印迹法分三个阶段进行第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移。
将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位。
将印有蛋白条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体（一抗）和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色，阳性反应的条带清晰可辨。
三、操作步骤一）配制SDS-PAG 灌胶:分离胶浓缩胶二）上样蛋白质样品的制备直接用电泳加样缓冲液裂解细胞制备细胞蛋白质提取液三）SDS-PAGESDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关。
在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系。
丙烯酰胺凝胶对蛋白质的分辨范围丙烯酰胺（%[w/v]）分离范围（kDa）15 15~4512.5 15~6010 18~757.5 30~1205 60~212（四）蛋白质的电转移打开蛋白质转移槽的胶板，依次放入：海绵、两张滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、再两张滤纸、海绵（以上所有的材料都需缓冲液浸湿，凝胶也必须保持湿润），合上转移槽的胶板，放入转移槽中，凝胶在负极一侧，倒入转移缓冲液，电泳。
western印迹法原理和流程
western印迹法原理和流程英文回答：Western blotting: Principle and procedure.Western blotting is a technique used to detect specific proteins in a sample of tissue or cells. It is based on the principle of antigen-antibody recognition.The first step in Western blotting is to separate the proteins in the sample by electrophoresis. This is done by running the sample through a gel, which separates the proteins based on their size and charge.The proteins are then transferred from the gel to a nitrocellulose membrane. This is done by placing the geland the membrane in a buffer solution and then applying an electrical current. The proteins will migrate from the gelto the membrane, where they will bind to the nitrocellulose.The next step is to incubate the membrane with a primary antibody. The primary antibody is specific to the protein that you are interested in detecting. The antibody will bind to the protein on the membrane.The membrane is then washed to remove any unbound antibody.The next step is to incubate the membrane with a secondary antibody. The secondary antibody is specific to the primary antibody. The secondary antibody will bind to the primary antibody, and it will also be labeled with an enzyme.The membrane is then washed again to remove any unbound secondary antibody.The final step is to add a substrate to the membrane. The substrate will react with the enzyme on the secondary antibody, and this will produce a colored product. The colored product can be visualized using a scanner or a chemiluminescence detection system.中文回答：Western 印迹法，原理和流程。
western 印迹名词解释
西方印迹是指西方文化在某个特定时间段内对某一地区、某一裙体或某一事物留下的痕迹或影响。
它可以体现在各个方面，如语言、宗教、思想、艺术、建筑、科技、生活习俗等。
西方印迹不仅仅是西方文化的传播，更是西方文化与其他文化相互融合、交流、影响的结果。
1. 西方印迹的种类西方印迹可以分为政治、经济、文化、宗教等各种类别。
在政治方面，西方印迹可能体现为西方政治体系的传播和影响，如民主制度、议会制度等。
在经济方面，西方印迹可能呈现为资本主义经济体系的传播和影响，如市场经济、私有财产制度等。
在文化方面，西方印迹可能表现为西方文学、艺术、音乐等文化形式的传播和影响。
2. 西方印迹的影响力西方印迹不仅在西方国家本土有着深远的影响力，更在全球范围内产生了巨大的影响。
在现代全球化的背景下，西方印迹更是深入到了世界各个角落。
西方印迹对于其他文化的影响有着显著的特点，它不是一味地强加于人，而是在相互交流、融合的过程中产生的。
在这样的过程中，各种文化都可能受益，形成新的文化形式。
3. 西方印迹的现实意义西方印迹的现实意义是多方面的。
西方印迹的传播和影响有助于丰富世界文化的多样性，让人们能够更好地了解和体验不同的文化。
另西方印迹的交流和融合也有助于促进文化的创新和发展，从而推动人类社会的进步和发展。
4. 如何看待西方印迹在面对西方印迹时，我们应该保持开放的心态。
西方文化作为世界上最具影响力的文化之一，其印迹在全球范围内都有着重要的地位。
我们应该尊重和欣赏西方文化所留下的痕迹，同时也要保持自己文化的独特性和传统，不断推动文化的多元发展。
5. 总结西方印迹作为西方文化在全球范围内的影响和痕迹，具有重要的现实意义。
我们应该正确看待和处理西方印迹，促进不同文化之间的交流、融合和共生，共同推动人类社会的进步和发展。
在当今社会，西方印迹已经深刻地影响了世界各地不同文化的发展和演变。
从语言到社会制度，从艺术到科技，各个领域都能够看到西方文化的影子。
western印迹法原理和流程
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western印迹实验报告
western印迹实验报告
Western印迹实验报告
Western印迹是一种用于检测蛋白质的实验方法，通过这种方法可以确定蛋白
质在混合物中的存在和浓度。
在这篇报告中，我们将介绍一项关于Western印
迹实验的研究。
首先，我们收集了一些细胞样本，并提取了其中的蛋白质。
接着，我们使用聚
丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将这些蛋白质分离开来。
然后，我们将这些蛋白质转移到一块聚丙烯酰胺膜上，并用特定的抗体将目标蛋白质标记出来。
在Western印迹实验中，我们使用了一种叫做免疫印迹的技术，通过这种技术
可以检测特定的蛋白质。
我们将膜与特定的抗体结合，然后使用一种叫做辣根
过氧化物酶的酶来标记这些抗体。
最后，我们使用化学发光或荧光等方法来检
测这些标记物，从而确定目标蛋白质的存在和浓度。
通过这项实验，我们成功地检测到了我们感兴趣的蛋白质，并确定了它们在样
本中的浓度。
这项研究为我们提供了关于细胞样本中蛋白质的重要信息，有助
于我们更好地理解细胞的功能和生物学过程。
总之，Western印迹实验是一种非常有用的方法，可以帮助科研人员确定蛋白
质的存在和浓度。
通过这项实验，我们可以更深入地了解细胞样本中的蛋白质，为生物学研究提供重要的数据支持。
Western印迹实验的结果对于理解细胞的
功能和疾病机制具有重要意义。
Western印迹法(试剂配制和操作步骤)-1
Western印迹法（试剂配制和操作步骤）-1这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。
Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。
杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L Tris•HClTris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0 约10ml1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98） 12g蒸馏水至 500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4•12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸馏水至 1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
Western免疫印迹 总结版
Western免疫印迹（Western Blot）一.原理：Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
也应用于检测蛋白水平的表达。
二.试剂1.裂解液：碧云天RIPA裂解液（强）主要成分为：50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1%TritonX-100，1% sodiumdeoxycholate，0.1% SDS，以及2mM sodium pyrophosphate，25mM β-glycerophosphate，1mM EDTA，1mM Na3VO4，0.5 ug/ml leupeptin等多种抑制剂。
2.PSMF：中文-苯甲基磺酰氟，有剧毒；在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中；100mmol/L PMSF溶液配制方法：溶解174mg的PMSF于足量的异丙醇中，定容到10ml，分装成小份贮存于-20℃，使用时终浓度一般为1mmol/L。
3.裂解液（含PMSF）的配制：1ml裂解液加100 mM 的PMSF 10 μl（只是比例关系，根据样品量计算出裂解液的实际体积再配制相应的裂解液）。
PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合4.丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N,N’-亚甲双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
westernblot中的marker作用
westernblot中的marker作用
Western blot（西方印迹）是一种用于检测蛋白质的方法。
在Western blot实验中，分子量标记物（Marker）扮演着重要的角色，它是一组已知分子量的蛋白质标准，用于帮助研究者在分析结果时确定待测蛋白的分子量。
Marker通常被加载到Western blot胶体电泳膜的一侧，与待测样品一同进行电泳和转印。
Marker的作用包括：
1. 分子量标定：Marker包含一系列已知分子量的蛋白质，通过与Marker上的带状蛋白质带进行比较，可以精确地确定待测蛋白的分子量。
Marker的分子量通常以千达尔顿（kDa）为单位给出。
2. 验证电泳和转印效果：Marker在电泳和转印的过程中移动到膜上，可以帮助研究者验证这些步骤的效果。
通过检查Marker的带状分布，可以确保电泳和转印过程中没有发生异常。
3. 确定蛋白质迁移距离：通过测量Marker的迁移距离，可以估算待测蛋白质的迁移距离。
这对于进一步的数据分析和结果解释非常重要。
4. 标定凝胶浓度：Marker还可以用于帮助研究者选择适当的凝胶浓度。
不同分子量的Marker在不同的凝胶浓度下会产生不同的迁移模式，因此可以根据Marker的迁移特性选择合适的凝胶浓度。
总体而言，Marker在Western blot实验中起到了标定、验证和标定凝胶浓度等多个方面的作用，使实验结果更加准确和可靠。
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Western blot
抗HRP HRP
抗生物素 生物素 生物素化二抗 一抗 组织抗原
实验材料
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1．29:1聚丙烯酰胺凝胶 2．Tris-甘氨酸电泳缓冲液： 25mM Tris 碱 250mM 甘氨酸 0.1%(m/v) SDS 3．1×SDS凝胶加样缓冲液： 50mmol/L Tris-Cl (pH6.8) 100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT） 2% (m/v) SDS 0.1% (m/v) 溴酚蓝 10% 甘油 临用前加DTT，DTT可用0.01M 乙酸钠（pH5.2）配成1mmol/L母液。 4．转移缓冲液： 25mM Tris 碱 193mM 甘氨酸 20% 甲醇 5．1×TBS： 20mM Tris-HCl 150mM NaCl 最后调pH值至7.4 6．TBST: TBS中加入0.05% Tween-20。 7．封闭液：用TBST配制5%脱脂奶粉。 8．Stripping Buffer： 100mM β巯基乙醇 2%(m/v) SDS 62.5mM Tris-H次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别 较大则只需用TBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗 杂交开始，后续步骤同前。 • 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近 则需更强的洗涤，可用 strip strip液（可用杂交袋）于室温摇动 洗涤30min~60min，然后用TBST洗涤10min×3次，再从封 闭开始，后续步骤同前。 • 对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条 带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃ 洗涤30min，然后用TBST洗涤10min×3次，再从封闭开始， 后续步骤同前。
• • •
二．样品处理
1．培养的细胞（定性）： ⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵ 对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。 ⑶ 100℃，1min。 ⑷ 用细胞刮刀刮下细胞后在EP管中煮沸10min。 ⑸ 用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在 4000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽 吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 ⑹ 待样品恢复到室温后上样。 2．培养的细胞（定量）： ⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 ⑶ 用细胞刮刀刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 ⑷ 12000g离心，4℃，2min。 ⑸ 取少量上清进行定量。 ⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。 3．组织： ⑴ 匀浆：对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。 注意尽量保持低温，快速匀浆。 ⑵ 12000g离心，4℃，2min。 ⑶ 取少量上清进行定量。 ⑷ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
四、注意事项
• 内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表 达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验 误差，保证实验结果的准确性。 在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同 时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正 上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个 Western Blot显色或者发光体系是否正常。 常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白 含量不会发生改变的蛋白作内参。 1. 为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳 性对照（最好有标准品（比如β-actin， GAPDH）或阳性血清）；阴性 对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加一抗，用PBS代 替）；无关对照（用无关抗体） 2. 一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。 3. 实验设计时所釆用的抗原批次要一样，尽量的避免人为的带来个体差异。特别在做裂解液时更要注意所釆用的操 作条件，尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。 4. 凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP 和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。 5. 电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气 泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。 6. 封闭时一般在室温下2h就够了，但是要注意如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用 BSA效果更好。 7. 加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的 匹配。 8. 在显色发光时要特别注意二抗所对应的显色方法，特别是在发光时要注意发光时间和显影时间的控制，以看得清 楚目的条带为标准。
是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。 是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。 原理及步骤 T or cell 提取蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白（ 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白（SDS-PAGE ) 转移（印迹） 转移（印迹）于硝酸纤维素膜 加抗体检测某种特异性蛋白质
Western Blot
四．转膜
1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备： • 浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水 中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min 以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。 2．取胶： • 将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣 的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按 “滤纸—凝胶—NC膜—滤纸”（从上到下）的顺序装置好。注意用玻棒逐出 气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路） 3．转膜： • 湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺于海绵上， 滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降 温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不 同蛋白的要求不同。 • 干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以 1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。
三．电泳
1．上样前将胶板下的气泡赶走。 2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳 道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用 1×loading buffer调整至与样品等体积。 3. 以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳， 当电压达65V时改为稳压电泳。 4. 在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。
六．发光鉴定
• • • 一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。 1．HRP-ECL发光法： 将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反 贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸 贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所 见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后 放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫 描。 2．AP-NBT/BICP显色法： 每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个 EP管中，每张 3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加 漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体 （如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现 时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。
Western印迹 印迹
实验目的
实验原理
• Western印迹杂交法是利用特异性抗体做探针，对 附着于固相支持体上的某些特异性蛋白进行鉴别 和定量的方法。它具有固相操作简便及不必对细 胞进行放射性预标记等优点。原理为：将待测样 品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，SDS聚丙 烯酰胺凝胶电泳使蛋白变性并分离，用电转移方 法转移到固相支持体上（NC膜、PVDF膜），滤膜 与抗靶蛋白的非标记抗体反应，再用二级免疫学 试剂进行检测。检测方法有放射性标记、酶标化 学显色或酶标化学发光等。酶标化学发光法以其 高敏感性、结果可在X光片上长期保存等优点而优 于酶标化学显色法。
五．封闭及杂交
1．封闭： • 将膜从电转槽中取出，去离子水与TBST稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。 必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离 子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。 2．结合一抗： • 一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。 • 反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出， 滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时 或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。 3．洗涤： • 一抗孵育结束后，用TBST漂洗膜后再浸洗四次，每次10min。 4．结合二抗： • 根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀 释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。 5．洗涤： • 二抗孵育结束后，用TBST漂洗膜后再浸洗六次，每次10min。