蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义-2011
致病菌检验-蜡样芽孢杆菌.
V-P反应
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － －
明胶液化
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
与类似菌鉴别：
表2 蜡样芽孢杆菌与其他类似菌的鉴别
项目 过氧化氢酶 动力 硝酸盐还原 酪蛋白分解 卵黄反应 葡萄糖利用（厌氧） 甘露醇 木糖 溶血 已知致病菌特性 巨大芽 孢杆菌 ＋ ＋/－ － ＋/－ － － ＋ ＋/－ － 蜡样芽孢 杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ 产生肠毒素 苏云金芽孢 杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － ＋ 对昆虫致病的 内毒素结晶 蕈状芽孢杆菌 炭疽芽孢杆菌 ＋ － ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － －/＋ 假根样生长 ＋ － ＋ －/＋ ＋ ＋ － － －/＋ 对动物
能分解葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，水杨苷，产酸不产气。
不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖，山梨醇，木糖 H2S（-），尿素酶试验（-）卵磷脂酶（+）， V-P试验（+），液化明胶。
二、致病性
食品蜡样芽胞杆菌数量>106/g（mL）时常可导致食物中毒，
导致中毒的主要原因是其产生的肠毒素 。 肠毒素类型： 耐热性肠毒素：100℃30min不能被破坏，常在米饭中形成。 不耐热肠毒素：能在各种食物中形成。
表1 蜡样芽孢杆菌生化分型
生化试验
型别 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
柠檬酸盐利用
＋ － ＋ － － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ － ＋ ＋
硝酸盐还原
＋ ＋ ＋ － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － －
淀粉水解
＋ ＋ － ＋ － － ＋ － － ＋ ＋ － ＋ － ＋
临床症状：食物中毒，分为呕吐型和腹泻型两类。
食品中蜡样芽孢杆菌的检验
三、微生物检验
▪ 操作步骤： 2、分离试验
取检样或稀释液划线分离培养于选择性培养基（MYP）上，置37℃培养12-20h，挑取可疑的 蜡状芽胞杆菌菌落接种于肉汤和营养琼脂作成纯培养，然后做证实试验。 3 证实试验 （1）镜检观察形态 （2）培养特性 （3）生化性状及分型
三、微生物检验
▪ （三）结果报告 根据证实为蜡状芽胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数，然后乘以稀释倍数，即得每 g(ml)样品中所含蜡状芽孢杆菌数。如MYP平板上的可以菌落为25个，取5个鉴定，证实为四 个，乘上稀释倍数（104），再乘上1g(ml)检样数（取的是0.1ml样)，则 N=25*4/5*104*10=2*106 报告每个g(ml)检样中含蜡状芽胞杆菌的数量（个/个g(ml))
中乳。
▪ 麦芽糖：阳性
（三）、生化反应
▪ 甘露醇：阴性
（三）、生化反应
▪ 木糖：阴性
（三）ห้องสมุดไป่ตู้生化反应
▪ 尿素酶试验：阴性
（三）、生化反应
未接种
接种
（四）、抵抗力
1、耐热； 2、对抗菌素的敏感性。
二、流行病学
（一）、细菌分布 蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。已 从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种 甜点等。 在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉 和奶、肉类食品引起；在我国主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。
二、流行病学
（一）、细菌分布 以前调查各种食品514件，发现本菌：日本1641件中有193件阳性，阳性率11.8%；国内480件 中有221件阳性，阳性率46%；乳制品阳性率77%；水果、干果阳性率8.1%；肉制品阳性率26%。
蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义-2011
蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义前言蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧芽胞杆菌，在自然界分布广泛。
在植物、许多生熟食品上均能分离到，例如乳制品、禽畜类制品、蔬菜、汤汁、淀粉类制品等。
污染食品后，在20℃～45℃，pH4.9～9.3条件下可以迅速繁殖并产生大量肠毒素。
该菌引起的食物中毒的食品感官性状均无明显变化，除食品有发粘、稍有异味无明显腐败变质现象，容易被人忽视。
当一次摄入食品中细菌数量达到100万／g（ml），即可发生食物中毒。
特性：①生物学性状，革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，多数呈链状排列。
芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端，芽胞囊不突出菌体。
引起食物中毒的菌株多为周毛菌，有动力，不形成荚膜；②培养特性，需氧菌，最适生长温度28 ℃～35℃，最适pH7.0～7.4，营养要求不高。
在普通培养基上生长的菌落较大，直径3mm～10mm，灰白色，不透明，表面粗糙成毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐，呈扩散状。
在血平板上形成浅灰色、不透明呈毛玻璃状的菌落，有草绿色溶血环或完全溶血环。
在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）培养基菌落为粉红色（不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（产生卵磷脂酶）。
在普通肉汤中呈混浊生长，常形成均膜或壁环；③生化性状，卵磷脂酶、酪蛋白酶、过氧化氢酶、青霉素酶、明胶液化、硝酸盐还原试验均阳性。
溶血。
不发酵甘露醇、木糖、阿拉伯糖。
实验安排一、稀释菌悬液的制备：二、细菌接种：不发酵甘露醇，且产生卵磷脂酶的细菌。
（在MYP培养基上呈粉红色，周围有粉红色晕的菌落。
三、菌数测定：四、形态学观察：肉汤培基、营养琼脂培基、革兰氏染色、动力。
五、生化试验：酪蛋白酶、硝酸盐还原酶、明胶酶、过氧化氢酶阳性第一部分用灭菌生理盐水将检样作成10-1～10-5的稀释液。
取每个稀释度0.1ml接种在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置于32±1℃温箱培养12～20h。
一、稀释菌悬液的制备：1. 每组取5支高压灭菌的玻璃试管，用10ml吸管吸取9ml生理盐水分别加入5支试管之中。
食品中蜡样芽胞杆菌的检验.
（四）、抵抗力
1、耐热； 2、对抗菌素的敏感性。
二、流行病学
（一）、细菌分布
蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植 物和许多生熟食品中常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、 蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。 在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在 欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国主要与受污染 的米饭或淀粉类制品有关。 以前调查各种食品514件，发现本菌：日本1641件，有193件阳性11.8% 国内480件，有221件 46% 乳制品 77% 水果、干果 8.1% 肉制品 26%
3、在普通琼脂平板上，菌落灰白色,不 透明，边缘不整齐，表面粗糙，呈毛 玻璃状或白蜡状。
4、在血平板上，菌落呈浅灰色，不透 明，似白色毛玻璃状，有溶血环。
5、在甘露醇卵黄多粘菌素平板上，菌 落呈粉红色,具有白色混浊环.。
（三）、生化反应
1、能分解GLU，麦芽糖，蔗糖，水杨苷，产 酸不产气。 2 、不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖，山梨 醇，木糖 3 、 H2S （ - ），尿素酶试验（ - ）卵磷脂酶 （+），V—P试验（+），液化明胶，胨化 中乳。
一、概况
一、生物学特性
（一）、形态与染色 革兰氏阳性大杆菌，芽胞不突出菌体，菌体两 端较平整，多数呈链状排列，周身鞭毛，有 动力。
和荧 蜡光 样染 芽色 孢的 杆铜 菌绿 假 单 胞 杆 菌
用孔雀绿染色的蜡样芽孢杆菌芽孢
（二）、培养特性
1、需氧，最适生长30—32℃. 2、在肉汤中混浊生长，有菌膜或壁环， 振摇易乳化。
（二）蜡样芽胞杆菌的食物中毒的一 般情况
1、季节性强：（6—10月）夏秋季为高峰期 2 、中毒发病率高： 60%—100% ，集团中爆发， 与葡萄球菌相似 3、中毒与性别、年龄无关： 4、潜伏期长短与中毒症状相关： 呕吐症 0.5—5h，发病 • 腹泻 8h后 5、污染源：主要泥土，灰尘，通过昆虫，不洁 用具，工作人员传播，原料也有.
蜡样芽孢杆菌的检测
实验材料 •甘露醇 卵黄 多粘菌素（MYP）琼脂平板 甘露醇-卵黄 多粘菌素（ 甘露醇 卵黄-多粘菌素 ） •营养琼脂培养基 营养琼脂培养基 •L-酪氨酸营养琼脂培养基 •胰酪胨大豆羊血琼脂 胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB) 胰酪胨大豆羊血琼脂 •动力 硝酸盐生化鉴定管 动力-硝酸盐生化鉴定管 动力 •木糖 明胶生化鉴定管 木糖-明胶生化鉴定管 木糖 •硝酸盐试剂 硝酸盐试剂(1%对氨基苯磺酸溶液 0.2% α-萘胺溶 对氨基苯磺酸溶液, 硝酸盐试剂 对氨基苯磺酸溶液 萘胺溶 液) •3%的双氧水 的双氧水 •革兰染液 革兰染液
4 证实试验
预 实 验 营 养 琼 脂 培 养 基 菌落形态观察
革兰染色
镜检观察菌体 卵磷脂酶实验 L-酪氨酸分解实验 酪氨酸分解实验 触酶实验 溶血实验
双氧水 胰酪胨大豆羊血琼脂平板 MYP琼脂平 琼脂平 板 L-酪氨酸琼脂培养基 L-酪氨酸琼脂培养基
生 化 实 验
鉴 别 试 验
动力与硝酸盐还原实验
动力-硝酸盐生化鉴定管 动力 硝酸盐生化鉴定管
1 形态观察 本菌革兰染色阳性，呈短链或长链，芽孢位于菌体 中央或偏端，不是菌体胀大。
2 实验结果 1 MYP平板上：粉红色菌落，菌落周围产生粉红色浑浊 MYP平板上 粉红色菌落 菌落周围产生粉红色浑浊 平板上： 菌落， 圈。 2 L-酪蛋白琼脂培养基：菌落周围形成透明圈。 酪蛋白琼脂培养基：菌落周围形成透明圈 透明圈。 3 触酶试验：加入过氧化氢后30秒产生气泡。 触酶试验：加入过氧化氢后30秒产生气泡 30秒产生气泡。 4 TSSB平板上：菌落周围产生的β溶血圈。（在菌落 TSSB平板上 菌落周围产生的β溶血圈。 平板上： 周围出现一个大小不一的完全透明清楚的宽带）。 周围出现一个大小不一的完全透明清楚的宽带）。 紫云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱得溶血现象， 紫云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱得溶血现象， 而炭疽芽胞杆菌通常不溶血。 而炭疽芽胞杆菌通常不溶血。 5 动力-硝酸盐生化鉴定管：细菌沿穿刺线扩散生长， 动力-硝酸盐生化鉴定管：细菌沿穿刺线扩散生长 扩散生长， 加硝酸盐试剂后培养基变红 加硝酸盐试剂后培养基变红。 蕈状芽孢杆菌常常呈绒毛状生长， 蕈状芽孢杆菌常常呈绒毛状生长，蜡样和紫云金芽 孢杆菌通常运动极为活泼，而炭疽芽胞杆菌则不运动。 孢杆菌通常运动极为活泼，而炭疽芽胞杆菌则不运动。
致病菌检验 蜡样芽孢杆菌
?MYP培养基中含有卵黄、甘露醇、多 粘菌素和pH指示剂酚红等。多粘菌素 可抑制杂菌的生长。 ?蜡样芽孢杆菌不发酵甘露醇，菌落为 粉红色（否则为黄色）。 ?该菌产生卵磷脂酶，由于脂肪和卵磷 脂被分解，在菌落周围产生粉红色的晕。
分离培养和证实试验:
注：＋ 90%~100% 的菌株阳性；－ 90%~100% 的菌株阴性；＋ /－ 大多数菌株阳性；－ /＋ 大多 数菌株阴性。
★鉴别：
蜡样芽孢杆菌在形态以及生化性状上与苏云金芽孢杆菌极为相似 ，要 进行鉴别。主要是通过观察伴孢晶体来判断，苏云金芽孢杆菌有伴孢晶体， 蜡样芽孢杆菌无。
苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体
临床症状：食物中毒，分为呕吐型和腹泻型两类。
三、检验方法
1、检验标准； GB 4789.14—2003
2、培养基和试剂
培养基:
肉浸液肉汤培养基
酪蛋白琼脂培养基
动力-硝酸盐培养基
缓冲葡萄糖蛋白胨水
血琼脂培养基
木糖-明胶培养基
甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基、
试剂：0.5% 碱性复红染色液、革兰氏染色液、3% 过氧化氢 溶液、甲萘胺-乙酸溶液、对氨基苯磺酸-乙酸溶液。
选择性培养基 （分离培养）
MYP
36℃±1℃ 12 h ~ 20 h
④与类似菌的鉴别：主要是与苏 菌数计算
营养琼脂培养基
பைடு நூலகம்
云金芽孢杆菌的鉴别。
⑤结果报告：报告每g（mL ）检样
中所含的蜡样芽孢杆菌数。
生长及菌落观察 染色镜检 生化试验 菌株保存
报告
菌数测定：
将样品稀释液0.1 mL涂布于甘露醇卵黄多粘菌素（ MYP）琼脂平板上 培养后，选取适当菌落数的平板进行计数。计数后，从中挑取 5个典型菌落 做证实试验。根据证实的蜡样芽孢杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数。
食品中蜡样芽孢杆菌的检验
摇易乳化。 3、在普通琼脂平板上，菌落灰白色,不透
明，边缘不整齐，表面粗糙，呈毛玻璃 状或白蜡状。
第三页，共21页。
一、生物学特性
4、在血平板上，菌落呈浅灰色，不透明， 似白色毛玻璃状，有溶血环。
5、在甘露醇卵黄多粘菌素平板上，菌落 呈粉红色（表示不发酵甘露醇）,周围 有粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）
土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中 常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、 乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、 炒米饭以及各种甜点等。
在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型 食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉 饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国主要与 受污染的米饭或淀粉类制品有关。
三、微生物检验
▪ （三）结果报告 根据证实为蜡状芽胞杆菌的菌落数计算出该平板
上的菌落数，然后乘以稀释倍数，即得每g(ml)样 品中所含蜡状芽孢杆菌数。如MYP平板上的可以菌 落为25个，取5个鉴定，证实为四个，乘上稀释倍 数（104），再乘上1g(ml)检样数（取的是0.1ml样)，
则N=25*4/5*104*10=2*106
第十一页，以前调查各种食品514件，发现本菌：日
本1641件中有193件阳性，阳性率11.8%；国 内480件中有221件阳性，阳性率46%；乳制 品阳性率77%；水果、干果阳性率8.1%；肉 制品阳性率26%。
第十二页，共21页。
（二）蜡样芽胞杆菌的食物中毒的一般情况
（三）、生化反应
▪ 甘露醇：阴性
第七页，共21页。
（三）、生化反应
▪ 木糖：阴性
第八页，共21页。
蜡样芽孢杆菌的检测共22页
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
13、遵守纪律的风气的培养，只有领 导者本 身在这 方面以 身作则 才能收 到成效 。—— 马卡连 柯 14、劳动者的组织性、纪律性、坚毅 精神以 及同全 世界劳 动者的 团结一 致，是 取得最 后胜利 的保证 。—— 列宁 摘自名言网
15、机会是不守纪律的。——雨果
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 —了，或曾经满足过人的 好斗的 本能， 但它同 时还满 足了人 对掠夺 ，破坏 以及残 酷的纪 律和专 制力的 欲望。 ——查·埃利奥 特 12、不应把纪律仅仅看成教育的手段 。纪律 是教育 过程的 结果， 首先是 学生集 体表现 在一切 生活领 域—— 生产、 日常生 活、学 校、文 化等领 域中努 力的结 果。— —马卡 连柯(名 言网)
蜡样芽孢杆菌的检测.ppt
实验结果
3 计数（表面涂布法）
1克样品中含的蜡样芽孢杆菌数： 证实阳性菌落数 挑取的菌落数
MYP平板上的菌落数×
× 稀释倍数× 10
举例：将检样10-4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板 上，生成的可疑菌落数为25个，取5个进行鉴定， 证实为蜡样芽胞杆菌的是4个，则1g样品中含的蜡 样芽孢杆菌数为（25×4/5）×104×1/0.1
三 流行病学
蜡样芽胞杆菌
病原菌 条件致病菌
食物中毒
肠 毒 素 耐 热
人或动物 非肠道传染病
eg:结膜炎
不 耐 热
呕吐型 污染食品：米饭 我国多见
腹泻型 污染食品：蛋白 型食品及果汁 欧美等国多见
污染途径： 泥土和灰尘 昆虫 不洁用具 不卫生的食品从业 人员
实验目的
1、掌握蜡样芽孢杆菌检验的主要步骤与方法。
4 证实试验
预 实 验 营 养 琼 脂 培 养 基
菌落形态观察
革兰染色
镜检观察菌体
生 化 实 验
卵磷脂酶实验 L-酪氨酸分解实验
触酶实验 溶血实验
双氧水
MYP琼脂平 板 L-酪氨酸琼脂培养基
鉴 别 试 验
胰酪胨大豆羊血琼脂平板
动力与硝酸盐还原实验
动力-硝酸盐生化定管
1 形态观察 本菌革兰染色阳性，呈短链或长链，芽孢位于菌体 中央或偏端，不是菌体胀大。
实验步骤
2：样品稀释及计数：
1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
10-1
9mL 9mL 9mL 9mL 9mL
10-6
1 每个稀释度混匀吹打完毕 后换用另一只灭菌吸管。 2 每稀释度接种两个平皿。
各稀释度0.1mL，L型玻棒均匀涂布 30℃ ，24h
实验三食品中蜡样芽孢杆菌的检验
第1页，本讲稿共31页
（一）蜡样芽胞杆菌生物学性状
1、形态和染色特性 该菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽胞呈椭圆 形，位于菌体中央稍偏一端,多呈链状排列,无荚膜，有周鞭毛。
第2页，本讲稿共31页
2、培养特性
（1）需氧菌，生长温度范围在10-45℃之间。最适 生长温度为28-35℃。
酶）。阴性时应继续培养72 h再观察。
（5）溶菌酶试验：用直径2mm接种环取纯菌悬液
一环,接种于溶菌酶肉汤中，35℃培养24h。
该菌在本培养基（含0.001％的溶菌酶）中能 生长。如出现阴性反应,应继续培养24 h。
第7页，本讲稿共31页
4、致病性
蜡样芽胞杆菌引起食物中毒，除必须具有大量的细菌外，肠毒 素也是重要的致病因素。
病因素；潜伏期短，一般为2～3小时，最短为30分钟，最长5～ 6小时；症状以呕吐，腹痉挛为主，腹泻则少见，一般经过 8～10小时而治愈。
腹泻型中毒：由各种食品中不耐热肠毒素引起，潜伏期 在6小时以上，一般为6～14小时；症状以腹泻，腹痉挛，而呕 吐却不常见；病程24～36小时。
第11页，本讲稿共31页
液做成10-1～10-5的稀释液。取各稀释液0.1ml，接种在选择培养基（甘露醇卵黄多 黏菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个表面，置37℃培养12～20h后，选取 菌落数在30个左右者进行计数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表
示不发酵甘露醇）,环绕有白色至淡粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。计数后，从 中挑取5个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计 算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克或每毫升样品所 含的蜡样芽孢杆菌数。
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蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义
前言
蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧芽胞杆菌，在自然界分布广泛。
在植物、许多生熟食品上均能分离到，例如乳制品、禽畜类制品、蔬菜、汤汁、淀粉类制品等。
污染食品后，在20℃～45℃，pH4.9～9.3条件下可以迅速繁殖并产生大量肠毒素。
该菌引起的食物中毒的食品感官性状均无明显变化，除食品有发粘、稍有异味无明显腐败变质现象，容易被人忽视。
当一次摄入食品中细菌数量达到100万／g（ml），即可发生食物中毒。
特性：①生物学性状，革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，多数呈链状排列。
芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端，芽胞囊不突出菌体。
引起食物中毒的菌株多为周毛菌，有动力，不形成荚膜；②培养特性，需氧菌，最适生长温度28 ℃～35℃，最适pH7.0～7.4，营养要求不高。
在普通培养基上生长的菌落较大，直径3mm～10mm，灰白色，不透明，表面粗糙成毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐，呈扩散状。
在血平板上形成浅灰色、不透明呈毛玻璃状的菌落，有草绿色溶血环或完全溶血环。
在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）培养基菌落为粉红色（不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（产生卵磷脂酶）。
在普通肉汤中呈混浊生长，常形成均膜或壁环；③生化性状，卵磷脂酶、酪蛋白酶、过氧化氢酶、青霉素酶、明胶液化、硝酸盐还原试验均阳性。
溶血。
不发酵甘露醇、木糖、阿拉伯糖。
实验安排
一、稀释菌悬液的制备：
二、细菌接种：不发酵甘露醇，且产生卵磷脂酶的细菌。
（在MYP培养基上呈粉红色，周围有粉红色晕的菌落。
三、菌数测定：
四、形态学观察：肉汤培基、营养琼脂培基、革兰氏染色、动力。
五、生化试验：酪蛋白酶、硝酸盐还原酶、明胶酶、过氧化氢酶阳性
第一部分
用灭菌生理盐水将检样作成10-1～10-5的稀释液。
取每个稀释度0.1ml接种在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置于32±1℃温箱培养12～20h。
一、稀释菌悬液的制备：
1. 每组取5支高压灭菌的玻璃试管，用10ml吸管吸取9ml生理盐水分别加入5支试管之中。
2. 用1ml的吸管吸取样品液1ml，加入第一支玻璃试管中，吹打混匀。
3. 再用此吸管吸取该试管中的菌悬液1ml，加入第二支玻璃试管，吹打混匀。
依此类推。
二、细菌接种：
用0.1ml吸管于从最高稀释度管（10-5）开始分别吸取菌悬液0.1ml于甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置32±1℃温箱培养20～48h。
第二部分
一、观察MYP培养基上的菌落
在MYP培养基上，呈粉红色（表示不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）的菌落可能为蜡样芽胞杆菌。
二、菌数测定
选取适当菌落数的平板进行计数。
计数后，从中挑取5个此种菌落做证实试验。
根据证实为蜡样芽胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数，然后乘以其稀释倍数，即得每g（或ml）样品中所含蜡样芽胞杆菌数。
例如MYP平板的可疑菌落为25个，取5个鉴定，证实为4个，乘上稀释倍数（如10-4）的倒数，再乘上1g（或ml）检样数（取的是0.1ml样）则为：25×4/5×1/10-4×10=2×106
三、普通肉汤及血琼脂培养
每组挑取该平板中的5个菌落，将每个菌落分别接种于普通肉汤培养基、普通营养琼脂培养基、血琼脂平板上，35℃培养18～24h。
第三部分
一、观察普通肉汤培养基、普通营养琼脂培养基、血琼脂平板上细菌的生长状况
在普通琼脂培养基上生长的菌落较大，直径3mm～10mm，灰白色，不透明，表面粗糙成毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐，呈扩散状。
在血平板上形成浅灰色、不透明呈毛玻璃状的菌落，有草绿色溶血环或完全溶血环。
在普通肉汤中呈混浊生长，常形成菌膜或壁环。
二、形态学观察（革兰氏染色）
初染液：结晶紫或龙胆紫。
媒染液：卢戈(Lugol)碘液。
脱色液：95%乙醇。
复染液：石炭酸复红稀释液常规制备涂片：涂片干燥固定。
初染：将结晶紫液覆盖菌膜，染l min，水冲洗。
媒染：滴加卢戈氏碘液数滴染l min，水冲洗。
两者生成结晶紫-碘复合物。
脱色：滴加脱色液乙醇后，频频倾动玻片0.5 min ，见无紫色脱下立即用水冲洗。
复染：滴加复染液染l min，水冲洗，待干，镜检。
形态观察：革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，多数呈链状排列。
芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端，芽胞囊不突出菌体。
三、生化试验
1. 点种酪蛋白琼脂平板。
32℃培养48h。
2. 动力和硝酸盐还原试验：取菌落穿刺接种于动力-硝酸盐半固体高层培养基，32℃培养48h。
3. 明胶液化试验：用接种针挑取少许可疑菌落，穿刺接种木糖-明胶培养基，32℃培养18～24h。
第四部分
一、观察生化试验结果
1. 点种酪蛋白琼脂平板（结果）：在菌落周围有透明圈形成（产生酪蛋白酶），为阳性。
2. 动力和硝酸盐还原试验（结果）：如细菌不限于沿穿刺线生长，并伴有混浊，即表示有动力；然后，分别加入对氨基苯磺酸和α-萘胺等量混合液0.1ml，如立即或10min内出现红色，即表示能还原硝酸盐，硝酸盐还原酶阳性。
3. 明胶液化试验（结果）：蜡样芽胞杆菌可液化明胶。
4. 触酶（过氧化氢酶）试验：挑取少许可疑菌落置于一载玻片上，加3%过氧化氢溶液一滴。
如有气泡产生，为触酶阳性。
二、撰写实验报告。