定性免疫学检验的性能验证与质量控制
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定性免疫学检验的性能验证与质量控制
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ISO15189实验室认可系列培训讲座
结果判断-4
用该方法检测，C50-20%的样本检测结果一致，C50+20%的样本不一定能得到一致 结果；需要用高于C50更大百分率浓度的样本（如+30%）进行补充试验。
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检出限的验证
n检测限（limit of detection）是指检测方法可检 测 出 的 最 低 被 测 量 浓 度 ， 也 称 检 测 低 限 （ lower limit of detection ） 或 最 小 检 出 浓 度 （ minimum detectable concentration），有时也称为分析灵敏 度（analytical sensitivity）。 n如前所述，分析物浓度位于C5-C95区间之外（小于 C5或大于C95）时，候选方法对同一样本的重复性检 测将得到相同结果。因此，C95代表了某一试剂可以 测出的最低被测量浓度。
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筛查试验
n筛查试验用于检测整个人群或部分人群中分析物的 存在情况。
n一般而言，筛查试验应当具有较高的临床敏感性（ 即临床检出率大于95%），对其特异性的要求（和阳 性预测值）则取决于对各种因素的综合考虑。
如粪便隐血检测
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n这里的C50指的是一个处于试剂检测临界点的样本浓 度，其一旦确定，是不变的。 n试剂盒CUT-OFF值指的是一个判断某一次测定结果的 由阴性和阳性对照信号值按一定公式计算出来的信号 值，每次测定都会有所差异。
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C5 浓度的定义
n一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阴性 结果时该分析物的浓度。
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结果判断-4
用该方法检测，C50-20%的样本检测结果一致，C50+20%的样本不一定能得到一致 结果；需要用高于C50更大百分率浓度的样本（如+30%）进行补充试验。
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检出限的验证
n检测限（limit of detection）是指检测方法可检 测 出 的 最 低 被 测 量 浓 度 ， 也 称 检 测 低 限 （ lower limit of detection ） 或 最 小 检 出 浓 度 （ minimum detectable concentration），有时也称为分析灵敏 度（analytical sensitivity）。 n如前所述，分析物浓度位于C5-C95区间之外（小于 C5或大于C95）时，候选方法对同一样本的重复性检 测将得到相同结果。因此，C95代表了某一试剂可以 测出的最低被测量浓度。
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筛查试验
n筛查试验用于检测整个人群或部分人群中分析物的 存在情况。
n一般而言，筛查试验应当具有较高的临床敏感性（ 即临床检出率大于95%），对其特异性的要求（和阳 性预测值）则取决于对各种因素的综合考虑。
如粪便隐血检测
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n这里的C50指的是一个处于试剂检测临界点的样本浓 度，其一旦确定，是不变的。 n试剂盒CUT-OFF值指的是一个判断某一次测定结果的 由阴性和阳性对照信号值按一定公式计算出来的信号 值，每次测定都会有所差异。
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C5 浓度的定义
n一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阴性 结果时该分析物的浓度。
免疫定性项目性能验证
9,500
500
4,500
85,500
95%
1%感染率
检出(+) 未检出(－)
950
50
4,950 94,050
95%
95%
95%
950/[950+4950]=16% 9500/[9500+4500]=67.9%
85500/[85500+500]=99.4 %
9.9%
Clinical Laboratory and Standards Institute (CLSI)
精选课件
17
性能验证前的准备
应熟悉待验证的试剂或系统 进行必要的培训，包括样本的处理和储存、
试剂的处理和储存、合理的检测方案、对结 果合理的解释以及系统的质量控制等。 制定质量保证计划 确定患者样本的数量及强弱（评价重复性） 确定比较的方法
精选课件
6
2、定性实验的临床分类
筛查实验：如便潜血、TP 诊断实验：如微生物学培养与细菌鉴定 确认实验：对以上已做出的检验结果进行验
证和确认
精选课件
7
3.几个重要概念
筛查试验：临床上筛查方法通常用于检测整个人
群（或者人群中的特定部分）中特定指标的情况。 例如对需输血患者样本做HIV血清学试验。
临床免疫定性检测 的性能验证
精选课件
1
高速列车性能验证
空气动力学 速度 车体转向架运行 固定、悬挂的零部件强度 稳定性 舒适感 故障率 ……
精选课件
2
测定系统的关键要素
方法学
试剂
操作程序
测定系统
校准品
仪器
第3页
精选课件
3
医学检验为什么需要“性能验证”？
免疫学实验的质量控制
19.03.2024
24
（一）分析前质量控制
内容主要为： ① 人员的素质和稳定性 ② 实验室的设置和工作环境 ③ 实验仪器的质量保证 ④ 检测方法的选择和评价 ⑤ 试剂盒的选择与评价 ⑥ 病人准备 ⑦ 标本的采集、处理和储存 ⑧ 实验室用水等
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25
标本的搜集和处理（举例）
免疫学试验对标本的要求较严格。如
确定特异性的方法
对阳性结果用相应的免疫物质进行 阻断或抑制；用该试验检测正常人群与已 知无关的病例。
19.03.2024
12
二、评价某种免疫学试验质量的指标
诊断敏感性
概念 指在患者中用此试验得到阳性结果的百分率。
某种试验在患者和非患者中可能得出的结果
—————————————————————————————
法测得的近似真实的数值。
定值 是指标定的质控材料的已知值。
19.03.2024
16
三、与质控有关的重要术语
决定性方法
是指经过彻底研究未发现任何不精密和不
准确因素的方法。在分析某被测物时是所有测
定方法中具有最高准确度的方法。国际公认的
决定性方法很少，并且其设备昂贵及技术操作
复杂。
参考方法
按照美国国家标准局的建议，参考方法是
各级管理人员具备质控的基本理论知识。
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3
概述
定义：
质量控制（quality control，QC）是利用 现代科学管理的方法和技术检测分析过程中 的误差，控制与分析有关的各个环节，确保 实验结果的准确可靠。也称为实验室质量保 证。
19.03.2024
4
概述
质量控制的主要内容 全过程质量控制 室内质量控制 室间质量评价 实验室认可 试剂盒的选择和评价
定性免疫学检验的性能验证与质量控制
检出限的验证方法
样本选择：评估试剂分析灵敏度所使用的样本，如 检测项目有国家参考品，则可使用国家参考品或经国 家参考品标化的参考品进行检测，如没有国家参考品 ，则使用可以溯源或量化的样本，如国际标准物质， 或与国际标准物质溯源的样本。 验证方法：处于测定下限浓度（ C95 ）的样本，重 复检测20次，应至少有18次以上为阳性反应。
精密度评估的基本原则（2）
评估精密度时，应至少评估两个浓度水平样本的精 密度。 所选样本浓度应在测量范围内有医学意义，即至少 有一个浓度在医学决定水平左右，在定性测定，即为 接近临界水平的浓度。
批内精密度的评估
评估方法：三个不同浓度的样本，在一个测试批内 重复进行至少20次检测，计算所得S/CO值的均值和SD ，计算批内CV%。 质量控制：检验时应同时至少测一个质控品。 判断结论：应≤试剂说明书所标明的批内变异。 ELISA的批内变异CV%应≤10%。
（三）准确度验证
验证方法及指标： 以与临床诊断、金标准方法和标准血清盘的检 测比较来评价，常以敏感性（包括临床敏感性）/ 特异性（包括临床特异性）和阳性符合率/阴性符 合率来表示。
临床特异性和临床敏感性
临床敏感性：在患有明确临床疾病的患者中，其检 测结果呈阳性或者超过正常值范围的比率 （即出现 阳性结果和确定患者患病）。 临床特异性：在没有特定临床疾病的患者中，其检 测结果呈阴性或者在正常值范围内的比率。
（一）不精密度的验证
纯定性试验：采用浓度接近临界值的分析物作为检 测材料，不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性 检测方法的不精密度。 量值化定性试验：以COI（cut-off Index）或S/CO 比值作为分析方法的精密度评价指标。
纯定性测定不精密度的评估方法
免疫定性实验性能验证
方法。
1、符合率 ——（2）方法符合率验证
2)验证方案： 选取： 10份阴性样本（包含至少5份其他标志物阳性的样本） 10份阳性样本（包含至少5份弱阳性样本，1份极高值阳 性样本） 注：弱阳性样本浓度在CUT-OFF值和2-4 倍CUT-OFF之间
共20份样本，随机每4份分成一组。 采用参比方法和候选方法均每天按照患者样本检测程序进行
性能验证的合格标准及验证人员
试剂盒说明书指标（先决条件！） 国际和／或国内标准 性能实验验证只能由本实验室人员在自己的场地、使用
自己的检测系统进行，厂家的数据、外单位的实验室 测定结果、学术刊物发表论文结论、科技成果等均不 能替代，只可做参考。
评价前的准备
实验室工作人员的培训 熟悉待评价的试剂或系统 掌握样本和试剂的处理和存储过程 按厂商的要求进行，注意基质效应 定性实验需进行阴性和阳性质控物测定
×100%
13、似然比(LR) 表达的是患某种疾病的患者所测定不同结果范围中，
患该病与不患该病的比值。在只有阳性、阴性结果时， 一般分阳性似然比及阴性似然比两种。
阳性似然比：真阳性率( TPR)与假阳性率(FPR)的 比值即为阳性似然比(+LR)。可用以描述当某就诊者的该 诊断性试验结果为阳性时，其患病与不患病的机会比。 显然阳性似然比的值越高，检验结果阳性时，诊断为某 病的概率越大，该检测方法确诊疾病的能力就越强。其 阳性似然比的计算公式为：
1、符合率 ——（1）诊断符合率验证
金标准（诊断准确度标准）
疾病
非疾病
候选实验
a(+，阳性)
b(+，阳性)
a+b
c( -，阴性) d( -，阴性)
c+d
n1
1、符合率 ——（2）方法符合率验证
2)验证方案： 选取： 10份阴性样本（包含至少5份其他标志物阳性的样本） 10份阳性样本（包含至少5份弱阳性样本，1份极高值阳 性样本） 注：弱阳性样本浓度在CUT-OFF值和2-4 倍CUT-OFF之间
共20份样本，随机每4份分成一组。 采用参比方法和候选方法均每天按照患者样本检测程序进行
性能验证的合格标准及验证人员
试剂盒说明书指标（先决条件！） 国际和／或国内标准 性能实验验证只能由本实验室人员在自己的场地、使用
自己的检测系统进行，厂家的数据、外单位的实验室 测定结果、学术刊物发表论文结论、科技成果等均不 能替代，只可做参考。
评价前的准备
实验室工作人员的培训 熟悉待评价的试剂或系统 掌握样本和试剂的处理和存储过程 按厂商的要求进行，注意基质效应 定性实验需进行阴性和阳性质控物测定
×100%
13、似然比(LR) 表达的是患某种疾病的患者所测定不同结果范围中，
患该病与不患该病的比值。在只有阳性、阴性结果时， 一般分阳性似然比及阴性似然比两种。
阳性似然比：真阳性率( TPR)与假阳性率(FPR)的 比值即为阳性似然比(+LR)。可用以描述当某就诊者的该 诊断性试验结果为阳性时，其患病与不患病的机会比。 显然阳性似然比的值越高，检验结果阳性时，诊断为某 病的概率越大，该检测方法确诊疾病的能力就越强。其 阳性似然比的计算公式为：
1、符合率 ——（1）诊断符合率验证
金标准（诊断准确度标准）
疾病
非疾病
候选实验
a(+，阳性)
b(+，阳性)
a+b
c( -，阴性) d( -，阴性)
c+d
n1
免疫学检验质量控制
“即刻法”的具体计算方法
先将测定值从小到大排列 计算X和S。 计算SI上限和SI下限值。 将SI上限、SI下限值与SI值中的数字比较。
当SI上限值和SI下限值＜n2S时，表示“在控” 当SI上限和SI下限有一值处于n2S和n3S值之间时，表示处于 “告警”状态 当SI上限和SI下限有一值＞n3S时，属“失控”。 数值处于"告警"和"失控"状态应舍去
质评计划的组织和设计 邀请书的发放 质控品的选择和准备 与参加者的沟通 报告的发放 结果的核对
质控品的包装和运输
检测结果的接受
检测靶值的确定
检测结果的录入
参加者的工作流程
接受质控品 按规定的日期进行检测 结果申报 收到评价结果
决定是否采取纠正措施
评估采取措施的效果
EQA质评样本
样本特征与患者样本应尽量一致 样本浓度与试验的临床应用相适应 在样本发放的条件下稳定 不存在不可避免的传染危险性
免疫检验质量控制中常用统计学方 法的选择 定性免疫检验 定量免疫检验
定性免疫检验质量控制
定性免疫检验的方法很多，主要有沉淀试验、凝集试
验、荧光免疫试验和酶免疫试验等，测定结果的判定 为阴性或阳性，此类测定的质控要点是测定下限。 已知的弱阳性质控:每次测定都应至少带一个已知的 弱阳性对照，从而有助于判断临床标本的检测结果是
可能会妨碍给出不同结果的改良方法的发 展。由于质评标本的靶值是建立在现有的 最常用的方法试剂的基础上，如靶值为所 有参评实验室的修正均值或参考实验室的 均值等，这样对于可能测定性能更优的改 良方法，用此靶值来评价的话，质评结果 有可能较差，这样就妨碍这种新的方法在 实验室的应用。
在不同的EQA程序中，对实验室的评价有 可能不同。由于不同的外部机构，其所发 标本的类型、浓度、数量或评价方法可能 会有所差异，因此，同一个实验室参加不 同外部机构组织的室间质量评价，评价的 结果很有可能会不一样。
免疫学检验技术—免疫学检验的质量控制
通常为含蛋白质的缓冲液，对测定结果无 明显影响。
标准品浓度在方法的测定范围即可。
标准品的 基本条件
在规定保存条件下具有良好的稳定性
无已知传染危险性，对已知的血液传 播病原体必须做灭活处理。
标准品浓度在方法的测定范围即可。
二、定量、半定量和定性免疫检验
（一）定量免疫检验
• 定量免疫检验通常需要使用全自动免疫分析仪，在测 定时须用校准品对仪器进行校准。
3、质控血清盘：用于特定的定性免疫测定试剂盒的评价
第二节 免疫检验质量控制的特殊性
• 免疫学检验方法的种类较多，其测定方法的灵敏 度和特异性要比生化方法高得多，因此进行质量 控制的手段不能照搬生化模式。
• 免疫检验质量控制包括定量、半定量和定性免疫 检验三种类型。
一、标准品
（一）标准品的概念和分类
（三）定性实验
• 定性免疫检验是免疫学检验的重点，其测定方法有很多，常 以“有”或“无”也即“阳性”或“阴性”来表达测定结果。
• 定性测定的室内质控要点是控制测定下限，设置临界cutoff 值（CO值）的低值弱阳性质控物是定性室内质控的关键。
• 应选择靶抗原或抗体浓度接近试剂盒或方法的测定下限的质 控品进行室内质量控制，并与临床标本的测定同时进行，这 一点对于使用肉眼判定测定结果的方法尤为重要
• 标准品（standard） 指含量明确的处于一定基质中其特性明确的物质， 通常用于比较检测未知的物质或成分。
• 标准品质量的优劣 直接影响样品的测定结果。
• 根据标准品性质的差异，可分为三级：
一级标准品 二级标准品 三级标准品
为冻干品，内含 载体蛋白，数量 有限，可使用 10~20年。通常 为国际标准品， 由WHO指定的实 验室制备
定性免疫学检验的性能验证与质量控制(PDF 69页)
辽宁中医药大学附属医院临床检验中心
分析物浓度接近C50的定性方法精密度试验
ISO15189实验室认可系列培训讲座
进行重复性研究时，理想情况下需绘制在规定条件下候选方 法的整个不精密度曲线，然而具体操作时需要检测的样本数量 较大 可使用一个简单的方法，即为待评价的检测方法建立分析物 的临界浓度，并判定某一特定浓度范围，例如C50±20%，是否 包含了C5-C95区间。 若-20%到+20%浓度范围包含了C5-C95区间，那么20%或距离 C50更远浓度的样本将得到一致的检测结果，即在 C5-C95区间 之外的样本检测结果可认为是精密的，浓度>C95，将持续得到 阳性结果，浓度<C5，将持续得到阴性结果。
辽宁中医药大学附属医院临床检验中心
ISO15189实验室认可系列培训讲座
5.5 检验程序
5.5.1.1 检验方法和程序的分析性能验证内容应参考 试剂盒说明书上明确标示的性能参数进行验证，至少 应包括：检出限、符合率（采用国家标准血清盘或临 床诊断明确的阴阳性样品各20份或与其他分析方法比 对），如为定量方法应验证精密度（包括重复性和中 间精密度）；并应明确检验项目的预期用途，如筛查 、诊断、确认。
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确认试验
确认试验用于验证筛查试验或者诊断试验结果的确 认。
对于确认试验，特异性比敏感性更为重要。
如梅毒密螺旋体抗体荧光吸收试验（FTA-ABS）C50）浓度的定义
ISO15189实验室认可系列培训讲座
一份样本，在多次重复实验中各有50%的几率获得 阳性或阴性的结果时该分析物的浓度。
辽宁中医药大学附属医院临床检验中心
分析物浓度接近临界值时的不精密度曲线
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免疫学检验的质量保证
原料术 难度大
引起试剂 盒批间变 异原因是 多方面的
提纯方法 不好掌握 质量控制 要求较高 产品质量 不易稳定
每批原材 料的纯度 和活性都 有所差别
(四)检测试剂的稳定性及影响因素 • 试剂盒抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材 料制成 • 抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳 定，易保存；浓度低时，应加0.1%~1.5%的 牛血清白蛋白作保护剂。 • 酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用 NaN3 。 • 抗体浓缩液应在-20℃保存，避免反复冻融。
• 诊断特异度（specificity of diagnosis） 又称真阴性，是指一项试验能将实际上未 患某病的人正确地判定为未患某病的能力。 其值越大，则误诊的可能性愈小。
• 本指标是用于评价测定方法的临床应用价 值，理想测定方法的诊断特异度应为100%。
• 正确诊断指数（Youden’s index） 又称约登指数，指将灵敏度和特异度 结合的评价某种免疫学实验的综合指标。 其值是灵敏度与特异度之和减去1，大小范 围从0到1 。 • 正确诊断指数愈大，实验的真实性亦愈好。 理想实验方法的正确诊断指数为1。
• 半定量实验在免疫检验中比较少用，此类 实验主要有酶免疫试验、荧光免疫试验等， 测定结果通常以抗体的滴度、效价等表示。
3.定性实验
• 定性实验是免疫学检验的重点，其测定方 法有很多，常以“有”或“无”也即“阳 性”或“阴性”来表达测定结果。
(三)检测试剂的批间差异
不同厂家 不同批号
产品的质量、技术 含量的区别
血清蛋白(白蛋白、 α 1-抗胰蛋白酶、 C3 铜蓝蛋白、 100 转铁蛋白) 人补体成分 (C4 、 C5 、 Clq 、 B 因子 ) FITC —绵羊抗人 IgG γ 链 过氧化物酶标记绵羊抗人 Ig 抗 RNP 抗体 平滑肌抗体 线粒体抗体 100 100 100 -
引起试剂 盒批间变 异原因是 多方面的
提纯方法 不好掌握 质量控制 要求较高 产品质量 不易稳定
每批原材 料的纯度 和活性都 有所差别
(四)检测试剂的稳定性及影响因素 • 试剂盒抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材 料制成 • 抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳 定，易保存；浓度低时，应加0.1%~1.5%的 牛血清白蛋白作保护剂。 • 酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用 NaN3 。 • 抗体浓缩液应在-20℃保存，避免反复冻融。
• 诊断特异度（specificity of diagnosis） 又称真阴性，是指一项试验能将实际上未 患某病的人正确地判定为未患某病的能力。 其值越大，则误诊的可能性愈小。
• 本指标是用于评价测定方法的临床应用价 值，理想测定方法的诊断特异度应为100%。
• 正确诊断指数（Youden’s index） 又称约登指数，指将灵敏度和特异度 结合的评价某种免疫学实验的综合指标。 其值是灵敏度与特异度之和减去1，大小范 围从0到1 。 • 正确诊断指数愈大，实验的真实性亦愈好。 理想实验方法的正确诊断指数为1。
• 半定量实验在免疫检验中比较少用，此类 实验主要有酶免疫试验、荧光免疫试验等， 测定结果通常以抗体的滴度、效价等表示。
3.定性实验
• 定性实验是免疫学检验的重点，其测定方 法有很多，常以“有”或“无”也即“阳 性”或“阴性”来表达测定结果。
(三)检测试剂的批间差异
不同厂家 不同批号
产品的质量、技术 含量的区别
血清蛋白(白蛋白、 α 1-抗胰蛋白酶、 C3 铜蓝蛋白、 100 转铁蛋白) 人补体成分 (C4 、 C5 、 Clq 、 B 因子 ) FITC —绵羊抗人 IgG γ 链 过氧化物酶标记绵羊抗人 Ig 抗 RNP 抗体 平滑肌抗体 线粒体抗体 100 100 100 -
临床免疫学检验的定性项目性能验证方案
临床免疫学检验的定性项目性能验证方案检验程序性能验证是临床实验室质量管理的关键技术要求，是保证实验室检测结果准确的前提。
根据中国合格评定国家认可委员会（CNAS）发布的《CNAS-GL038：临床免疫学定性检验程序性能验证指南》，要求申请认可或已获认可的医学实验室对临床免疫学（定性）检验程序，在新检验程序常规应用前、检验程序分析性能受影响后（如仪器主部件故障、仪器搬迁、环境失控等）、检验程序的任一要素（仪器、试剂、校准品等）变更等，都要对检验程序的性能进行验证或重新验证，通过验证结果来分析评估该检验程序是否符合实验室的质量管理要求并满足临床的诊断需要。
性能验证指标的选择应满足该项目检测的预期用途，临床免疫学定性检验程序的分析性能参数一般包括：符合率、精密度（重复性）、检出限、临界值、抗干扰能力、血清与血浆结果一致性等。
下面将对临床免疫学定性检验程序的符合率、精密度（重复性）、检出限和临界值这4个性能指标的验证方案进行介绍解释。
1符合率验证符合率验证的目的是评估该检验程序所检测结果的正确度，有两种验证方案，一是诊断符合率，采用国家标准血清盘或临床明确诊断的阴阳性样品进行比对；二是方法符合率，即与其他分析方法进行比对，包括用候选方法评估已知能力验证或室间质评的样本以及不同方法学或/和相同方法学在不同实验室之间的比对。
1.1诊断符合率验证选取国家标准血清盘或临床明确诊断的阴性样本20份（包含至少10份其他标志物阳性的样本）、阳性样本20份（包含至少10份浓度在cut-off值和2-4倍cut-off值之间的弱阳性样本，1份极高值阳性样本），随机分组分批检测样本，以国家标准血清盘或临床明确诊断的样本结果为金标准，计算候选检验程序所检测结果的诊断符合率，如表1，表1诊断符合率验证金标准合计+-候选检验程序+a b a+b -c d c+d合计n1n2n 诊断符合率计算：诊断灵敏度=[a/n1]×100%诊断特异性=[d/n2]×100%诊断符合率=[（a+d）/n]×100%验证通过标准：要求计算得出的诊断灵敏度、诊断特异性和诊断符合率不低于厂商检验方法声明。
临床免疫定性实验的质量保证
为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由第三方机
构，采取一定的办法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误
差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。这是对实验 室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来评价实时的测定结 果的可接受性。当EQA用来为执业许可或实验室认证的目的而评价 实验室操作时，常描述为实验室能力比对检验（Proficiency
运输贮存
仪器的校准与标定
酶标仪的校准一定要定时进行（一般使用频繁 不超过半年，最多不超过一年）。
加样器及水浴用温度计均应进行计量校准后使 用，前者可采用称重法校准，后者可到国家计 量单位进行。
酶免疫测定操作中的注意事项
加样
温育
洗板 显色
比色
结果判断
结果报告及解释
检验科与临床的对话
检验医师要将新开展的新项目新方法向临床宣 传，广泛征求临床医生的意见 检验医师要积极参与临床会诊，对检验结果进 行分析和解释 检验科向临床提供检验申请单的正确填写方式， 样本的采集方式，检验方法的可靠性和局限性；
检验结果的适当解释
THANK YOU !
当底物为 OPD(邻苯二胺） 时，显色反应应避 光进行；底物为TMB（四甲基联苯胺）时，要 新鲜配制。
显色时间：建议在 37℃ 下反应15～30分钟后， 终止反应比色测定。
比色
加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀
测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适
最好选择双波长比色测定，双波长测定能去除 背景的干扰，注意避免出现吸光度值为负值的 现象。
CV为该试剂的批内CV (一般在15-20%)；⑵
CO±2s，s为实验室做室内质控RCV常规条件
构，采取一定的办法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误
差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。这是对实验 室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来评价实时的测定结 果的可接受性。当EQA用来为执业许可或实验室认证的目的而评价 实验室操作时，常描述为实验室能力比对检验（Proficiency
运输贮存
仪器的校准与标定
酶标仪的校准一定要定时进行（一般使用频繁 不超过半年，最多不超过一年）。
加样器及水浴用温度计均应进行计量校准后使 用，前者可采用称重法校准，后者可到国家计 量单位进行。
酶免疫测定操作中的注意事项
加样
温育
洗板 显色
比色
结果判断
结果报告及解释
检验科与临床的对话
检验医师要将新开展的新项目新方法向临床宣 传，广泛征求临床医生的意见 检验医师要积极参与临床会诊，对检验结果进 行分析和解释 检验科向临床提供检验申请单的正确填写方式， 样本的采集方式，检验方法的可靠性和局限性；
检验结果的适当解释
THANK YOU !
当底物为 OPD(邻苯二胺） 时，显色反应应避 光进行；底物为TMB（四甲基联苯胺）时，要 新鲜配制。
显色时间：建议在 37℃ 下反应15～30分钟后， 终止反应比色测定。
比色
加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀
测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适
最好选择双波长比色测定，双波长测定能去除 背景的干扰，注意避免出现吸光度值为负值的 现象。
CV为该试剂的批内CV (一般在15-20%)；⑵
CO±2s，s为实验室做室内质控RCV常规条件
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临床特异性和临床敏感性
临床敏感性：在患有明确临床疾病的患者中，其检 测结果呈阳性或者超过正常值范围的比率 （即出现 阳性结果和确定患者患病）。
临床特异性：在没有特定临床疾病的患者中，其检 测结果呈阴性或者在正常值范围内的比率。
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二、检验结果质量的保证-----室内质控 质控品的来源
第三方质控品 检测系统配套质控品 自制质控品
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质控物的选择
基质：应尽量选择人血清基质，动物源性的基质由 于人体内有大量的异嗜性抗体的存在引起假失控。稀 释液也应用人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水。
阳性符合率和阴性符合率的计算
待评价试剂与已验证方法相比较进行阳性符合率和阴性符合率的计算
待评价试剂的检测结果 +
已验证方法
+
-
a
b
共计
c
d
a+c
b+d
阳性符合率= a/(a+c) ×100%。 阴性符合率= d/(b+d) ×100%。 总符合率=(a+d)/(a+b+c+d)×100%。
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（二）检出限的验证
检测限（limit of detection）是指检测方法可检 测 出 的 最 低 被 测 量 浓 度 ， 也 称 检 测 低 限 （ lower limit of detection ） 或 最 小 检 出 浓 度 （ minimum detectable concentration），有时也称为分析灵敏 度（analytical sensitivity）。 如前所述，分析物浓度位于C5-C95区间之外（小于 C5或大于C95）时，候选方法对同一样本的重复性检 测将得到相同结果。因此，C95代表了某一试剂可以 测出的最低被测量浓度。
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（一）不精密度的验证
纯定性试验：采用浓度接近临界值的分析物作为检 测材料，不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性 检测方法的不精密度。
量值化定性试验：以COI（cut-off Index）或S/CO 比值作为分析方法的精密度评价指标。
分为批内精密度评估和批间精密度评估
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精密度评估的基本原则（1）
操作者必须熟悉检测系统工作原理，了解并掌握仪 器的操作步骤和各项注意事项，应在评估阶段维持仪 器的可靠和稳定。
用于评估试验的样本一般常采用临床实验室收集的 血清(浆)样本；当实验室收集的样本不稳定或不易得 到时，也可考虑使用稳定的、以蛋白质为基质的商品 物质，如校准品或质控品。
阳性质控品：特定项目人阳性血清混合物
ANA 1:1000 anti-dsDNA 1:100或以上 anti-ENA 中强度阳性：若组合式检测，至少有2个
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精密度评估的基本原则（2）
评估精密度时，应至少评估两个浓度水平样本的精 密度。
所选样本浓度应在测量范围内有医学意义，即至少 有一个浓度在医学决定水平左右，在定性测定，即为 接近临界水平的浓度。
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试剂盒所设的阴、阳性内对照是用来计算CUT OFF 值及有效性判断标准，只能在同批号试剂内使用，不 能作为质控指标，质控必须是可以监控到不同批号试 剂间的变化的外对照。
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质控物的选择
阴性质控品：特定项目人阴性血清混合物（若为 ELISA质控品浓度宜0.5倍临界值左右）
TP TP FP
×100% ×100% ×100%
TN
TN FN ×100%
TN TP
TP FP TN FN ×100%
TP—分析物存在时检测结果为阳性的数量。 FP—分析物不存在时结果为阳性的数量。 TN—分析物不存在时检测结果为阴性的数量。 FN—28分析物存在时检测结果为阴性的数量辽。宁中医药大学附属医院临床检验中心
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敏感性、特异性和阳性预测值、阴性预测值的计算
试剂的检测结果 阳性结果数 阴性结果数 共计 敏感性 特异性 阳性预测值 阴性预测值 符合率
分析物阳性 TP
分析物阴性 FP
FN TP+FN
TN
FP+TN
TP TP FN
TN TN FP
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批内精密度的评估
评估方法：三个不同浓度的样本，在一个测试批内 重复进行至少20次检测，计算所得S/CO值的均值和SD ，计算批内CV%。质量源自制：检验时应同时至少测一个质控品。
判 断 结 论 ： 应 ≤ 试 剂 说 明 书 所 标 明 的 批 内 变 异 。 ELISA的批内变异CV%应≤10%。
阳性符合率和阴性符合率
如果没有可用的诊断标准，那么需提供待评价试剂 与某一已验证方法进行比较的结果，在这种情况下， 则不能够计算敏感性和特异性，而是计算阳性符合率 和阴性符合率。
这种计算反映的并非方法的准确度，而是待评价试 剂和已验证方法的一致性程度。
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C95
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性能验证的样本准备
质控品：商用或自备，含阳性和阴性。 C50和C5（C50-20%）及C95（C50+20%）浓度样本： 用于重复性及最低检出限验证，不少于40次检测量。 临床样本或血清盘：用于准确性验证，不少于50份 阳性和阴性样本。
稳定性：有效期为6个月以上,实验室应对有效期进 行验证。
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质控物的选择
质控物数量、实验位置和频次：质控物数量应满足 一个批号至少半年的实验量。每分析批至少安排一个 弱阳性和一个阴性质控(高值阳性血清只用于监控 “HOOK效应”)。检测位置不能固定而应随机放置。
共计 TP+FP FN+TN TP+FP+FN+TN
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定性免疫检验项目敏感性、特异性要求
作为筛查试验，检测的敏感性应>95%；作为诊断试 验，检测敏感性和特异性均应>95%；作为确认试验特 异性应>98%-99%。
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批间精密度的评估
评估方法：三个不同浓度的样本，在10天以上时间 内单次重复进行至少20批检测，计算所得S/CO值的均 值和SD，计算批间CV%。
质量控制：
判 断 结 论 ： 应 ≤ 试 剂 说 明 书 所 标 明 的 批 间 变 异 。 ELISA的批间变异CV%应≤15%。
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两种不同方法的不精密度曲线比较
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如何获得 “临界点（C50）”
检测试剂或系统的说明书可能会注明分析物的临界 浓度，但需验证。
如果临界浓度未知，则可以将阳性样本进行一系列 稀释，然后将他们进行重复检测以确定能够获得50% 阳性和50%阴性结果的那个稀释度，这一稀释度的分 析物浓度即为临界点（C50）。
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纯定性测定不精密度的评估方法
定性测定精密度分析质量指标为C5-C95浓度区间（ 亦即“灰区”），这一区间范围≤C50±20%。
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分析物浓度接近临界值时的不精密度曲线
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性能验证相关概念
筛查试验 诊断试验 确认实验 C50 C5 C95
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临界点（C50）浓度的定义
一份样本，在多次重复实验中各有50%的几率获得 阳性或阴性的结果时该分析物的浓度。对特定试剂， C50一旦确定，是恒定不变的。
定性免疫学检验的性能验 证与质量控制
杨方华
一、定性免疫试验的性能验证
CNAS-CL39：2012《医学实验室质量和能力认可准则 》在临床免疫学检验领域的应用说明：
检验方法和程序的分析性能验证内容应参考试剂 盒说明书上明确标示的性能参数进行验证，至少应包 括：检出限、符合率（采用国家标准血清盘或临床诊 断明确的阴阳性样品各20份或与其他分析方法比对） ，精密度（包括重复性和批间精密度）；并应明确检 验项目的预期用途，如筛查、诊断、确认。
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