定性免疫学检验的性能验证与质量控制

不精密度评价结果判断-4
用该方法检测，C50-20%的样本检测结果一致，C50+20%的样本不一定能得到一致 结17 果；需要用高于C50更大百分辽率宁中浓医药度大学的附属样医本院临（床检如验中+心30%）进行补ISO充1518试9实验验室。认可系列培训讲座
数值化定性免疫测定的精密度评价方法
有些定性免疫测定，如ELISA等，样本的测定结果 可以COI（cut-off Index）或S/CO比值来表示，检测 系统或试剂厂家会在其试剂说明书中给出试剂的批内 和批间变异，这对于对实验室评价试剂的精密度以及 评估其室内质控的批间变异结果有参考价值。
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性能验证相关概念
筛查试验 诊断试验 确认实验 C50 C5 C95
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临界点（C50）浓度的定义
一份样本，在多次重复实验中各有50%的几率获得 阳性或阴性的结果时该分析物的浓度。对特定试剂， C50一旦确定，是恒定不变的。
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批间精密度的评估
评估方法：三个不同浓度的样本，在10天以上时间 内单次重复进行至少20批检测，计算所得S/CO值的均 值和SD，计算批间CV%。
质量控制：
判 断 结 论 ： 应 ≤ 试 剂 说 明 书 所 标 明 的 批 间 变 异 。 ELISA的批间变异CV%应≤15%。
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不精密度评价结果判断-1
-20%～+20%浓度范围在C5-C95区间之内；用该方法检测，浓度超过C50±20%的样
本检测结果不一致；此结论错误率5% ，需使用更宽浓度范围的样本（如±30%）
进14 行另外的试验。
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敏感性、特异性和阳性预测值、阴性预测值的计算
试剂的检测结果 阳性结果数 阴性结果数 共计 敏感性 特异性 阳性预测值 阴性预测值 符合率
分析物阳性 TP
分析物阴性 FP
FN TP+FN
TN
FP+TN
TP TP FN
TN TN FP
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（一）不精密度的验证
纯定性试验：采用浓度接近临界值的分析物作为检 测材料，不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性 检测方法的不精密度。
量值化定性试验：以COI（cut-off Index）或S/CO 比值作为分析方法的精密度评价指标。
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临床特异性和临床敏感性
临床敏感性：在患有明确临床疾病的患者中，其检 测结果呈阳性或者超过正常值范围的比率 （即出现 阳性结果和确定患者患病）。
临床特异性：在没有特定临床疾病的患者中，其检 测结果呈阴性或者在正常值范围内的比率。
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纯定性测定不精密度的评估方法
定性测定精密度分析质量指标为C5-C95浓度区间（ 亦即“灰区”），这一区间范围≤C50±20%。
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分析物浓度接近临界值时的不精密度曲线
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纯定性试验不精密度评价步骤
制备评价用样本 制备3份样本：一份浓度为C50，一份为C50+20%
，一份为C50-20%。 每份样本的体积需保证40次或更多次重复检测的
需要。 评价方法
每份样本检测40次，确定每一份样本结果为阳性 和阴性的百分比。
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不精密度评价结果判断-2
-20%～+20%浓度范围包含了C5-C95区间；用该方法检测，浓度超过C50±20%的样
本15 检测结果一致
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不精密度评价结果判断-3
用该方法检测，C50+20%的样本检测结果一致，C50-20%的样本不一定能得到一致 结16 果；需要用低于C50更大百分辽率宁中浓医药度大学的附属样医本院临（床检如验中-心30%）进行补ISO充1518试9实验验室。认可系列培训讲座
稳定性：有效期为6个月以上,实验室应对有效期进 行验证。
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质控物的选择
质控物数量、实验位置和频次：质控物数量应满足 一个批号至少半年的实验量。每分析批至少安排一个 弱阳性和一个阴性质控(高值阳性血清只用于监控 “HOOK效应”)。检测位置不能固定而应随机放置。
阳性质控品：特定项目人阳性血清混合物
ANA 1:1000 anti-dsDNA 1:100或以上 anti-ENA 中强度阳性：若组合式检测，至少有2个
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精密度评估的基本原则（2）
评估精密度时，应至少评估两个浓度水平样本的精 密度。
所选样本浓度应在测量范围内有医学意义，即至少 有一个浓度在医学决定水平左右，在定性测定，即为 接近临界水平的浓度。
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（二）检出限的验证
检测限（limit of detection）是指检测方法可检 测 出 的 最 低 被 测 量 浓 度 ， 也 称 检 测 低 限 （ lower limit of detection ） 或 最 小 检 出 浓 度 （ minimum detectable concentration），有时也称为分析灵敏 度（analytical sensitivity）。 如前所述，分析物浓度位于C5-C95区间之外（小于 C5或大于C95）时，候选方法对同一样本的重复性检 测将得到相同结果。因此，C95代表了某一试剂可以 测出的最低被测量浓度。
分为批内精密度评估和批间精密度评估
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精密度评估的基本原则（1）
操作者必须熟悉检测系统工作原理，了解并掌握仪 器的操作步骤和各项注意事项，应在评估阶段维持仪 器的可靠和稳定。
用于评估试验的样本一般常采用临床实验室收集的 血清(浆)样本；当实验室收集的样本不稳定或不易得 到时，也可考虑使用稳定的、以蛋白质为基质的商品 物质，如校准品或质控品。
TP TP FP
×100% ×100% ×100%
TN
TN FN ×100%
TN TP
TP FP TN FN ×100%
TP—分析物存在时检测结果为阳性的数量。 FP—分析物不存在时结果为阳性的数量。 TN—分析物不存在时检测结果为阴性的数量。 FN—28分析物存在时检测结果为阴性的数量辽。宁中医药大学附属医院临床检验中心
C50
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C5 浓度的定义
一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阴 性结果时该分析物的浓度。
C5
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C95 浓度的定义
一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阳 性结果时该分析物的浓度。
C95
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性能验证的样本准备
质控品：商用或自备，含阳性和阴性。 C50和C5（C50-20%）及C95（C50+20%）浓度样本： 用于重复性及最低检出限验证，不少于40次检测量。 临床样本或血清盘：用于准确性验证，不少于50份 阳性和阴性样本。
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两种不同方法的不精密度曲线比较
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如何获得 “临界点（C50）”
检测试剂或系统的说明书可能会注明分析物的临界 浓度，但需验证。
如果临界浓度未知，则可以将阳性样本进行一系列 稀释，然后将他们进行重复检测以确定能够获得50% 阳性和50%阴性结果的那个稀释度，这一稀释度的分 析物浓度即为临界点（C50）。
验证方法：处于测定下限浓度（C95）的样本，重 复检测20次，应至少有18次以上为阳性反应。
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（三）准确度验证
验证方法及指标： 以与临床诊断、金标准方法和标准血清盘的检
测比较来评价，常以敏感性（包括临床敏感性）/ 特异性（包括临床特异性）和阳性符合率/阴性符 合率来表示。
阳性符合率和阴性符合率的计算
待评价试剂与已验证方法相比较进行阳性符合率和阴性符合率的计算
待评价试剂的检测结果 +
已验证方法
+
-
a
b
共计
c
d
a+c
b+d
阳性符合率= a/(a+c) ×100%。 阴性符合率= d/(b+d) ×100%。 总符合率=(a+d)/(a+b+c+d)×100%。
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检出限的验证方法
样本选择：评估试剂分析灵敏度所使用的样本，如 检测项目有国家参考品，则可使用国家参考品或经国 家参考品标化的参考品进行检测，如没有国家参考品 ，则使用可以溯源或量化的样本，如国际标准物质， 或与国际标准物质溯源的样本。
阳性符合率和阴性符合率
如果没有可用的诊断标准，那么需提供待评价试剂 与某一已验证方法进行比较的结果，在这种情况下， 则不能够计算敏感性和特异性，而是计算阳性符合率 和阴性符合率。
这种计算反映的并非方法的准确度，而是待评价试 剂和已验证方法的一致性程度。
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定性免疫学检验的性能验 证与质量控制
杨方华
一、定性免疫试验的性能验证
CNAS-CL39：2012《医学实验室质量和能力认可准则 》在临床免疫学检验领域的应用说明：
检验方法和程序的分析性能验证内容应参考试剂 盒说明书上明确标示的性能参数进行验证，至少应包 括：检出限、符合率（采用国家标准血清盘或临床诊 断明确的阴阳性样品各20份或与其他分析方法比对） ，精密度（包括重复性和批间精密度）；并应明确检 验项目的预期用途，如筛查、诊断、确认。
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批内精密度的评估
评估方法：三个不同浓度的样本，在一个测试批内 重复进行至少20次检测，计算所得S/CO值的均值和SD ，计算批内CV%。
质量控制：检验时应同时至少测一个质控品。
判 断 结 论 ： 应 ≤ 试 剂 说 明 书 所 标 明 的 批 内 变 异 。 ELISA的批内变异CV%应≤10%。
试剂盒所设的阴、阳性内对照是用来计算CUT OFF 值及有效性判断标准，只能在同批号试剂内使用，不 能作为质控指标，质控必须是可以监控到不同批号试 剂间的变化的外对照。
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质控物的选择
阴性质控品：特定项目人阴性血清混合物（若为 ELISA质控品浓度宜0.5倍临界值左右）
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二、检验结果质量的保证-----室内质控 质控品的来源
第三方质控品 检测系统配套质控品 自制质控品
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质控物的选择
基质：应尽量选择人血清基质，动物源性的基质由 于人体内有大量的异嗜性抗体的存在引起假失控。稀 释液也应用人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水。
共计 TP+FP FN+TN TP+FP+FN+TN
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定性免疫检验项目敏感性、特异性要求
作为筛查试验，检测的敏感性应>95%；作为诊断试 验，检测敏感性和特异性均应>95%；作为确认试验特 异性应>98%-99%。
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