食品中致病菌检测方法有关问题的探讨-刘绪平

采样原则及采样方案
• 国际食品微生物标准委员会(ICMSF) 同时对16类产品 的n值（每批采样个数）作出了参考值，对于沙门氏菌 等致病菌均要求n=10，部分产品要求n=20 。 • GB/T 4789.1-2008中采用了ICMSF法则，但是相关产品 标准中n值（每批采样个数）并无明确的规定。 • 在实际工作为兼顾可操作性与结果的科学准确，如何 更为科学地制定采样方案，n值取多少为合适？
副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）
• 感染源：主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇， 以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。 。 • 致病性：临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主 要症状。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体发病。 近年来由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多。
沙门氏菌（salmonella）
• 感染源：蛋、家禽和肉类产品。 • 致病性：沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患 病之一，可导致胃肠炎、伤寒和副伤寒等。除可感染人外，还 可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。 • 特性：属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。已发现的近一千种 菌株。按其抗原成分，可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。 其中与人体疾病有关的主要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙组的副 伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组的副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌， 丁组的伤寒杆菌和肠炎杆菌等。 。 • 检验情况： 本次调查与评价工作，检测了猪肉（或猪肝）、鸡肉、卤 （酱）肉制品、牛肉、蛋、凉拌菜共6个品种样品中沙门氏菌 的污染情况，检出率分别为1.33%、1.43%、0.95%、13.33%、 0%、0%。
沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 蜡样芽孢杆菌
易污染食品
肉、禽、蛋、鱼、奶类 及其熟制品 奶类、糕点、熟肉类 剩米饭、奶、肉、 豆制品 生食鱼贝类，卤、咸菜 含水量高的食品、熟制品 自制发酵豆制品、肉制品 低酸性罐头 肉类、水产品、熟食、 牛奶 牛肉、牛奶及其制品 鸡肉、蔬菜、水果、饮料 自制发酵淀粉类制品 禽蛋类、奶、肉及其制品 蔬菜、青贮饲料 牛奶、肉类、豆类、蔬菜 肉及肉制品、奶类
谢 谢！
几点思考？
采样原则及采样方案
采样原则 • 根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、 微生物的危害程度等确定采样方案。 • 应采用随机原则进行采样，确保所采集的样品 具有代表性。 • 采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的 外来污染。 • 样品在保存和运输的过程中，应采取必要的措 施防止样品中原有微生物的数量变化，保持样 品的原有状态。如何做到这一点？
• 发展中国家
数十亿病例与肠道菌感染腹泻相关 每年约170万0-15岁儿童因食源性微生物污染引起的腹泻而死亡。
背景资料 食源性疾病 Foodborn Disease
凡是通过摄食而进入人体的病原体, 使人 体患感染性或中毒性疾病,统称为食源性疾病 (WHO定义)
背景资料
食品中常见的致病性细菌
病原菌
背景资料
2003年微生物性食源性疾病暴发病原菌构成
肉毒杆菌 0.3% 其他 17.5% 副溶血性弧菌 致病性大肠杆菌 4.8% 40.1%
金黄色葡萄球菌及其毒素 9.4%
腊样芽孢杆菌 8.6%
沙门菌 8.1%
变形杆菌 11.3%
背景资料
2003年食源性疾病暴发事件责任单位的构成
集体食堂 27.9% 街头摊点 6.0% 快餐店 2.5% 送餐 1.5% 宾馆饭店 20.6% 其他 6.9% 其他 4.9% 食品超市 0.6%
• 特性：系弧菌科弧菌属，革兰染色阴性，为多形态杆菌或稍弯 曲弧菌。本菌嗜盐畏酸。是一种嗜盐性细菌，本菌存活能力强， 在抹布和砧板上能生存1个月以上，海水中可存活47天。 • 检验情况： 本次调查与评价工作，检测了水产(海水)、水产(淡水)、 生食水产品（生食鱼片、贝壳类、甲壳类）共3个品种样品中 副溶血性弧菌污染情况，检出率分别为13.33%、0%、5.71%。
2009年检验情况
• 重庆、陕西、青海、贵州、广西、云南、西藏 7个地区的1470批次样品的生物性危害指标检 测任务； • 指标为4项：沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄 色葡萄球菌、副溶血性弧菌；
2009年检验情况
生物性危害调查与评价品种和检测指标
类别 评价品种 猪肉（或猪肝） 鸡肉 动物性食品
1
检测指标 沙门氏菌、单增李斯特菌 沙门氏菌、单增李斯特菌
PCR法
• PCR法需要同时进行阴性对照和阳性对照试验， 如待测样品未出现相应大小的扩增条带，则可 报告该样品检验结果为阴性，可以出具未检出 该致病菌的报告； • 如待测样品出现相应大小扩增条带则可判定该 样品结果为假定阳性，则回到传统的检测步骤， 进一步应按传统的标准检测方法进行确认，最 终结果以传统的方法结果为准。
检测指标 沙门氏菌 检测方法 标准代号 食品卫生微生物学检验 沙门 GB/T 4789.4-2008（定性）； 氏菌检验 自建SOP方法（定量）
单增李斯特菌
食品卫生微生物学检验 单核 GB/T 4789.30-2008（定性）； 细胞增生李斯特菌检验 自建SOP方法（定量）
食品卫生微生物学检验 金黄 GB/T 4789.10-2008（定性）； 色葡萄球菌 GB/T 4789.37-2008（定量） 食品卫生微生物学检验 副溶 GB/T 4789.7-2008 血性弧菌检验 （定性、定量）
170 000 300 000 224 000 8 000 2013
美国 美国 美国 中国 美国 日本 比利时 日本 法国
背景资料
2003年食源性疾病暴发事件病因构成
原因不明 13.5%
混合因素 1.4% 动植物 14.7%
微生物 46.4%
化学物 24.1%
中国疾病预防控制中心营养与食品安全所数据，下同
食品中致病菌检测有关问 题的探讨
江西省食品药品检验所 刘绪平 2010-01-13
目录content
• 一些背景资料 • 2009年食品生物性危害指标的检测情况 • 几点思考
背景资料
食源性疾病与食品污染
已成为一个世界性公共卫生问题
• 发达的工业化国家
每年约有30％的人口感染食源性疾病。
• 美国
每年约发生7.6万例食源性疾病，32.5万人住院, 5,000人死亡。
外界环境及多种动物体内 鸟、禽类及哺乳动物
背景资料 重大国际微生物性事件
1984 1985 1989 1991 1994 1996 1997 2000 2001 鼠伤寒沙门氏菌 沙拉酱 鼠伤寒沙门氏菌 巴氏消毒奶 金黄色葡萄球菌 蘑菇罐头 甲肝病毒 毛蚶 肠炎沙门氏菌 巴氏消毒液态冰激凌 大肠杆菌 O157:H7 萝卜 肠炎沙门氏菌 蛋和肉制品 金黄色葡萄球菌 雪印牛奶 单增李斯特菌
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )
• 感染源：奶、肉、蛋、鱼及其制品、剩饭、油煎蛋、糯米糕及 凉粉等。 • 致病性：金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌， 可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等， 甚至败血症、脓毒症等全身感染。 • 特性：在自然界中无处不在，因而，食品受其污染的机会很多。 近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感 染占第二位，仅次于大肠杆菌，金黄色葡萄球菌肠毒素是个世 界性卫生难题。 • 检验情况： 本次调查与评价工作，检测了卤（酱）肉制品、生食水 产品（生食鱼片、贝壳类、甲壳类）、牛肉共3个品种样品中 单增李斯特菌的污染情况，检出率分别为5.71%、4.29%、0%。
评价省份
卤（酱）肉制品
牛肉 水产2 蛋 凉拌菜
沙门氏菌、金黄色葡萄球菌
沙门氏菌、单增李斯特菌、金 黄色葡萄球菌 副溶血性弧菌 沙门氏菌、 沙门氏菌 31个省（区、 市）
自加工冷菜
生食水产品（生食鱼 副溶血性弧菌、金黄色葡萄球 片、贝壳类、甲 菌 壳类）
2009年检验情况
各评价指标执行的检测方法标准
采样原则及采样方案
采样方案 分为二级和三级采样方案，二级采样方案 设有n、c和m值，三级采样方案设有n、c、m 和M值 • n：同一批次产品应采样个数。 • c：最大允许超过m值的样品数。 • m：微生物指标可接受水平的限量值。 • M：微生物指标的最高安全限量值。
采样原则及采样方案
• 按照二级抽样方案设定的指标，在n个样品中， 允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值大于 m值。 • 按照三级抽样方案设定的指标，允许全部样品 中相应微生物指标检验值小于或等于m值；允 许有c个样品其相应微生物指标检验值在m值和 M值之间；不允许有样品其相应微生物指标检 验值大于M值 。
一点想法
• 在这次工作中，碰到的较大的一个问题就是，致病菌检测时间 非常紧张，平均算下来，每批样品检测完成的时间周期大约是 7至10天。 • 对于2010年的任务，如何提高工作效率？ • 一点想法：采用PCR法进行初筛（其检测周期约为24h至 48h），发现阳性样品再采用传统的标准方法进行确证检测。 可大大提高工作效率，同时也能保证结果的准确可靠。 • 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准已经出台了，包括10 种制病菌的PCR快速检测方法。 （ SNT 1869-2007 食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法）
污染来源
感染的动物及其粪便, 被污染的水源 人或动物的 化脓性病灶 土壤、空气、 尘埃、昆虫 海水、海产品 患者粪便,水源 土壤,动物粪便 人畜粪便、土壤、污水
副溶血性弧菌 志贺氏菌 肉毒梭菌
产气荚膜梭菌
大肠O157:H7
椰酵假单胞菌 单增李斯特氏菌
牛、鸡、猪等
土壤, 变质银耳 土壤、污水、 粪便
耶尔森氏菌 空肠弯曲菌
金ห้องสมุดไป่ตู้色葡萄球菌
副溶血性弧菌
2009年检验情况
定性检测
• 在检测过程中，发现采用标准的方法，因为纯化不完全或试验条件等原因有 时会出现假阳性或假阴性的结果，因此阳性检出结果均采用了API试剂盒 （生物梅里埃公司）进行确证，其结果的准确性较好。
• 沙 门 氏 菌-----API 20E • 副溶血性弧菌-----API 20E • 单增李斯特氏菌-----API Listeria • 金黄色葡萄球菌-----API Straph 定量检测 • 一 MPN法(The Most Probable Number Method) :适用于目标菌数 较少样品； • 二 平板计数法(APC法):适用于目标菌量较大的样品； • 三 PCR法
单增李斯特氏菌（Listeria Monocytogenes）
• 感染源：肉、蛋、禽、海产品、乳制品、蔬菜等。 • 致病性：能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血 症、脑膜炎和单核细胞增多。该疾病主要影响人口中易受影响 的特定群体如老人、小孩、AIDS患者等。目前国际上公认的 李斯特菌共有七个菌株,其中单增李斯特菌是唯一能引起人类 疾病的。食源性李斯特菌病是相对少见但十分严重的疾病，其 死亡率很高（20%-30%）。 • 特性：该菌在自然界中广泛存在，在一般热加工处理中能存活， 在4℃下仍然能大量生长繁殖，所以冰箱食品需加热后再食用。 该菌是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。 • 检验情况： 本次调查与评价工作，检测了猪肉（或猪肝）、鸡肉、牛 肉共3个品种中单增李斯特菌的污染情况，均有检出，检出率 分别为4.67%、16.19%、11.67%。
原因不明 1.4% 家庭 34.7%
从病因构成来看，有将近50%的食源性疾病暴发事 件是由微生物污染引起的，食源性微生物污染已经较 大范围地危害到了公众的饮食卫生安全。 从责任单位的构成来看，有约60%的食源性疾病暴发 事件是由餐饮服务业所引起的。 所以说，我们做的是一项伟大的事业，国家局开展食 品中生物性危害指标的调查与评价工作是非常有意义， 同时也对我们6个所的检测能力提出更高的要求。