NDV的血凝及血凝抑制试验(微量法)

NDV的血凝及血凝抑制试验（微量法）

目的要求熟练掌握病毒的血凝及血凝抑制试验（微量法）的操作方法及结果判定，明确其应用价值。

仪器及材料pH7.2生理盐水、1％鸡红细胞悬液、NDV、新城疫病毒待检血清、微量血凝板（96孔V型板）、微量移液器（带吸头）、微型振荡器、温箱、离心机、天平、注射器。

方法与步骤

（一）病毒的血凝（HA）试验

1．1％鸡红细胞悬液的制备

（1）采血先在注射器中吸入抗凝剂（3.8％枸橼酸钠液）1ml，采成年健康鸡血，心脏或静脉采血3-4ml。

（2）离心洗涤共3次，每次2000r/min，5min，每次离心后弃去上清液和白细胞，仅留纯的红细胞，最后读出红细胞的体积。

（3）配制用生理盐水将纯的红细胞稀释成体积比为1%的红细胞悬液。

2．操作术式

振荡1min，室温(18℃～20℃)下作用30～40min,或置37℃恒温培养箱中作用15～30min观察结果

（1）加生理盐水 1-12孔，每孔中分别加入50μl。

（2）NDV病毒液倍比稀释换吸头，吸取50μl病毒液，加于第1孔的生理盐水中，并用移液器吹打3～5次使液体混和均匀，然后取50μl移入第2孔，混匀后取50μl移入第3孔，依次倍比稀释到第11孔，第11孔中液体混匀后从中吸出50μl弃去。第12孔不加病毒抗原，作盐水对照。

（3）加1%红细胞悬液换吸头，1-12孔，每孔中分别加入50μl。

加样完毕，振荡1min，室温（18～20℃）下作用30～40min，或37℃恒温箱中作用15～30min，观察并判定结果。

3．结果判定及记录

完全凝集（＋）：红细胞呈伞状分布于反应孔底层。伞

完全不凝集（－）：红细胞呈点状沉淀于反应孔底层。点

不完全凝集（±）：介于＋与－之间。

病毒的血凝价（或称血凝滴度）：能使一定量红细胞发生完全凝集的病毒最大稀释倍数为该病毒的血凝滴度，或称血凝价。

（二）病毒的血凝抑制（HI）试验

采用同样的血凝板，每排孔可测1份血清样品。

1．配制4单位病毒根据病毒的血凝价，用生理盐水配制4单位病毒。

4单位病毒的稀释倍数＝病毒的血凝滴度/4。

如病毒的血凝价为128（27），则4单位病毒的稀释倍数为32倍（25）。

2．制备被检血清静脉或心脏采血，不加抗凝剂，待血液完全凝固后自然析出血清或离心获得血清。

3．操作术式

表2 病毒血凝抑制试验操作术式单位:μl

孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

生理盐水

待检血清

待检血清稀释倍数

4单位病毒50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 100

50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 －－

弃50

21 2 2 23 24 25 26 27 28 29 210病毒盐水

对照对照50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 －

1%鸡R B C悬液50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

结果举例－－－－－－±±＋＋＋－（1）加生理盐水 1-12孔，每孔中分别加入50μl。

（2）被检血清倍比稀释换吸头，取待检血清50μl置于第１孔的生理盐水中，吹打3～5次混匀，吸出50μl放入第2孔中，然后依次倍比稀释至第10孔，并将第10孔的液体混匀后取50μl弃去。第11孔为病毒对照，第12孔为盐水对照。

（3）加4单位病毒换吸头，用微量移液器吸取稀释好的4单位病毒，向1～11

孔中分别加50μl。

振荡1min，将反应板置室温下作用20min，或在37℃恒温培养箱中作用5～10min。

（4）加1%红细胞悬液换吸头，1-12孔，每孔中分别加入50μl。

振荡1min，将反应板置37℃温箱中作用15～30min取出，观察并记录结果。

4．结果判断和记录

完全凝集（＋）：红细胞呈伞状分布于反应孔底层。伞

完全不凝集（－）：红细胞呈点状沉淀于反应孔底层。点

不完全凝集（±）：介于＋与－之间。

血清的血凝抑制效价（血凝抑制滴度）：能使4单位病毒凝集红细胞的能力受到完全抑制的血清最大稀释倍数叫该血清的血凝抑制滴度或血清的血凝抑制效价。

血清的血凝抑制滴度即血清中的抗体水平。

思考题 1．病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原抗体反应？为什么？

2．HI是不是一种特异的抗原抗体反应？为什么？

附：离心机的使用

1．平稳放置。

2．配平：用天平配平。离心管、套管和液体内容物为一整体进行配平；离心管中液体总量不能超过总体积的3/4。

3．平衡放入离心机的离心孔中：正确放置时离心机转动平稳、噪音低。

4．离心：先加盖后启动；变速，按档位升高或降低。

5．取出条件：停转。

6．异常情况处理：如遇异常声音，立即停机检查。