免疫学实验操作流程

免疫学实验操作流程

第一次实验 双向免疫扩散试验

1、小鼠摘眼球取血，双侧均摘取，(搞眼球者和用Eppendorf 管接血者配合好，尽量不要让血液流到管外)。收集血液于Eppendorf 管中(1管/鼠)。(小鼠取血前12小时停止给固体食物，多给水)

2、待血液凝固后，用牙签剥离血块，将Eppendorf 管于37℃放置半小时后，转入4℃ 冰箱中，直至血清彻底析出(约2小时)。

3、在第一个半小时内(37℃ 孵育)，解剖小鼠，观察小鼠免疫器官的状、大小、位置等。

4、在4℃ 的2个小时内，要做两件事情。一是为第二天的ELISA 实验做准备，具体是包被的那一步骤；二是双向免疫扩散的实验操作。

(1) ELISA 的包被

包被是将抗原吸附于酶标板的过程。抗原的包被浓度为10ug/ml 。48孔酶标板各孔依次加包被液100ul/孔，注意设置空白对照。包被好的酶标板置于4℃ 过夜。

包被说明：设三复孔。A1-A3不包被抗原，C1-C3不包被抗原，它们用于阴性对照。

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(2) 琼脂双向免疫扩散实验操作步骤

①制板

配制1.5%琼脂粉溶液(用生理盐水)，微波炉加热至琼脂成溶胶状态(短间隔多次)，室温自然冷却至50℃左右(手摸上去能忍受)将琼脂粉溶液倾倒至载玻片上，待琼脂成凝胶状态后进行下一步。(琼脂凝胶尽可能厚一些)

②打孔用打孔器在琼脂上打孔。

③为稀释抗体和抗原(倍比稀释)做准备。抗体浓度在做预实验时从原浓度开始稀释至8倍结束共3个梯度。

稀释方法：取三个EP管，分别标记为1/2、1/4、1/8。每管先加50ul的生理盐水。取血清50ul，加入标记1/2的EP管内，充分混匀后，用加样器吸出50ul，加入到标记有1/4的EP管内，再充分混匀后，再取出50ul，加入至标记1/8的EP管内，充分混匀。再将各管内的血清加入到对应的孔内，每个对应孔加25ul(见图)。

④加样结束后将载玻片置于一个湿盒内，置于37℃孵箱中过夜。

第二次实验 ELISA

1、于水池内甩净40孔酶标板孔内的包被缓冲液，倒置于吸水纸上，控干孔内液体。

2、封闭：1%牛血清白蛋白(BSA)，200ul/孔。37℃放置1小时。

3、洗涤：采取步骤1中的方法倾倒封闭液，将洗液(含0.05% Tween-20的PBS)加至满孔，室温放置2分钟，倾倒洗液。重复2-3次。最后一次倾倒洗液要彻底。

4．加一抗(待检血清)。血清从1：200起始按倍比稀释至10240倍结束，100ul/孔，同一浓度设三复孔。加完样后盖好酶标板于37℃孵育1小时。

AB 两排用于检测不加佐剂组的血清，CD 两排用于检测加佐剂组的血清。以不加佐剂组的血清为例，简述待测血清抗体的稀释方法如下：取8个EP 管，分别标记为1-8号。向第1号管中加入995ul 的PBS ，向2-8号管中分别加入500ul 的PBS 。取待测血清5ul ，加入至第1号管内，充分混匀后，吸出500ul 加入至第2号管内。再混匀从第2号管内吸出500ul 加入至第3号管内。依此类推直至第8号管也混匀为止。加佐剂组的血清也用同样的方法稀释(注意用不同的EP 管)。稀释全部完成后，按如下对应的方式加样：

不加佐剂组血清：

1号：A1-A3；2号：A4-A6；3号：A7-A9；4号：A10-A12；

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5号：B1-B3；6号：B4-B6；7号：B7-B9；8号：B10-B12。

加佐剂组血清：

1号：C1-C3；2号：C4-C6；3号：C7-C9；4号：C10-C12；

5号：D1-D3；6号：D4-D6；7号：D7-D9；8号：D10-D12。

5、洗涤：同步骤3。

6、加二抗(酶标抗体)：

每孔加100ul，酶标板置于37℃孵箱中孵育40分钟。

7、洗涤：同步骤3。

8、加底物：底物要现用现配。所选用底物为邻苯二胺(OPD)，用底物缓冲液(柠檬酸盐缓冲液)配制。每孔中加入100ul的底物后避光放置3-5分钟，加入2M H2SO4终止液，每孔50ul，终止反应。用酶标仪测量OD值。

9、结果分析

选2倍于阴性对照OD值的抗体最高稀释倍数作为抗体的效价。