实验9 气相色谱、内标法测定蘑菇醇的含量

内标法测定蘑菇醇的含量【摘要】气相色谱法（GC）分离效率、选择性、灵敏度都很高，适用于热稳定性好、易挥发的物质。

外标法通过配置标准溶液来制作工作曲线，但使用溶液体积很少时误差较大，可以通过加入内标物减小误差。

本实验通过内标法和气相色谱法来测定未知物中的蘑菇醇含量。

【关键字】气相色谱内标法蘑菇醇【实验目的】1、了解气相色谱法的基本原理及仪器结构。

2、了解气相色谱基本仪器操作。

3、掌握内标法的配样与计算方法。

【基本原理】•原理概述：气质联用仪（GC-MS）近年来在有机化学领域起到越来越重要的作用，其原理是利用气相色谱的分离能力，将样品各组分分离开，然后对各组分进行质谱分析，得出组分信息。

再利用内标法制作工作曲线来计算未知物浓度。

•气相色谱法（GC）：是利用气体作流动相的色层分离分析方法。

优点：分离效率、选择性、灵敏度都很高。

缺点：只适用于热稳定性好、易挥发的物质。

•内标法：在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校准和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。

内标物的选择要求：1、是能得到纯样的己知化合物；2、和被分析的样品组分有基本相同的物理化学性质（化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等）、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物；3、不与样品中各组分充分分离发生反应；4、既可被色谱柱所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，原理：只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量：m ：样品的质量；ms ：待测样品中加入内标物的量；As ：待测样品中内标物的峰面积；f s,i ：组分i 与内标物的校正因子之比，称为相对校正因子。

•蘑菇醇：即1-辛烯-3-醇分子式：C 8H 16O；分子量：128.21应用：用于日化和食用香精；作为化学合成原料，应用於制药领域；作为蚊虫引诱剂，应用于杀蚊制品。

【仪器与试剂】1、仪器：Agilent7890N 气相色谱仪，10μl 进样针，1000μl 移液枪。

2、试剂：蘑菇醇储备样（10.107mg/ml），内标物（10.140mg/ml），蘑菇醇未知样，乙腈溶液。

【实验步骤】1、配制标准溶液：以移液枪分别移取200、400、600、800、1000μl 蘑菇醇储备液和400、400、400、400、400μl 氯苯储备液与5ml 容量瓶中，用乙腈定容到刻度。

2、配制未知溶液：以移液枪量取200μl 蘑菇醇未知液和400μl 氯苯储备液与5ml 容量瓶中，用乙腈定容到刻度。

3、设定气相色谱参数：进样口：气化温度：250℃，分流比：10:1；色谱柱：流速：2.0ml/min；柱温箱：120℃（保持1min），10℃/min 升到200℃；图1蘑菇醇结构式%100m f m x si s,i s i ⨯⨯⨯⨯=A A检测器：基座温度250℃，H 2：45ml/min，Air：450ml/min，N 2：40ml/min。

保存。

4、进样：以以上方法测定标样及未知样，记录实验数据（保留时间及峰面积）。

5、做出内标标准曲线，以内标法计算未知样中蘑菇醇含量。

【注意事项】1、配制溶液时要注意不要将溶液滴到容量瓶外面，否则会大大影响测量的结果；移液枪的使用要规范，每种溶液用各自的枪头。

2、GC 中手动进样技术的熟练与否，直接影响到分析结果的好坏，正确的进样手法是：取样后，一手持注射器(防止气化室的高气压将针芯吹出)，另一只手保护针尖（防止插入隔垫时弯曲）。

先小心地将注射针头穿过隔垫，随即快速将注射器插到底，并将样品轻轻注入气化室（注意不要用力过猛使针芯弯曲），同时按start 键，拔出注射器，注射样品所用时间及注射器在气化室中停留的时间越短越好。

2、在进多个不同样品时，每次进样前都要将进样针润洗干净，确保洗针溶剂不干扰样品检测。

在测定标样以绘制标准曲线时，由于进样的浓度是梯度升高的，在测定前只用每次的待测液润洗即可。

若先进高浓度溶液样品再进低浓度溶液样品则还得用溶液（乙腈）洗净。

【数据处理与实验结果分析】1、试剂浓度与测量数据：蘑菇醇储备样10.107mg/ml；内标物10.140mg/ml。

2、内标法：由可知，以c 蘑菇醇/c 内标横坐标，为A 蘑菇醇/A 内标纵坐标作内标法曲线，曲线拟合如下：t 内标（min）t 蘑菇醇（min）A 蘑菇醇A 内标A 蘑菇醇/A 内标c 蘑菇醇/c 内标标样11.72.2546.81105.60.49460.4984标样21.82.21093.31012.1 1.08020.9967标样31.82.21498.8968 1.5483 1.4951标样41.82.22235.31082.9 2.0642 1.9935标样51.82.22738.41053.4 2.5996 2.4919未知物 1.8 2.2665.510390.6405表1标样与未知物保留时间与峰面积数据%100m f m x si s,i s i ⨯⨯⨯⨯=A A由图可得，拟合的直线为y =0.9586x +0.00221，R =0.99952。

由测定数据计算得，未知样的峰面积之比为0.6405，代入上述拟合直线进行计算得x =0.6659，即c 蘑菇醇/c 内标=0.6659。

可计算得未知样蘑菇醇的浓度为：3、外标法：以c 蘑菇醇/c 内标横坐标，为A 蘑菇醇纵坐标作外标法曲线，曲线拟合如下：图2内标法工作曲线ml mg ll ml mg /504.13200400/140.106659.0c =⨯⨯=μμ未知样图3外标法工作曲线由图可得，拟合的直线为y =1062.99066x -32.9604，R =0.99642。

由测量数据得：A 蘑菇醇=665.5，带入上述拟合曲线进行计算得x =0.6571，即c 蘑菇醇/c 内标=0.6571。

可计算得未知样蘑菇醇的浓度为：由拟合曲线的数据可以看出：外标法的相关系数比内标法的相关系数小，说明内标法确实优于外标法。

【思考题】1、你做出来的标准曲线相关系数是多少？你觉得操作过程中有哪些地方会带来误差？有哪些操作或参数还可以优化？答：1.内标法R =0.99952，线性关系较好，外标法R =0.99642，线性关系也较好，但比内标法稍差。

内标法优于外标法。

2.在如下几个方面可能存在实验误差：1试剂本身的误差：由于样品长时间使用，可能会分解、挥发等，造成浓度与刚配置时有一定误差，不过应该影响不大；相对可能影响较大的是，在测量的过程中标液在量取后，溶液中的氯仿可能挥发（氯仿沸点低），造成浓度变化。

2配制溶液中的人为误差：移取溶液、定容不可避免的会有人为误差，可能造成某个标准溶液的配置准确度较差；另外，溶液混匀可能不充分，对测定也有一定影响；配制溶液时使用移液枪，虽精度较高，但可能存枪老化等问题导致其精密度下降，而内标法对溶液浓度的要求较高，故可能导致误差的出现。

3进样时的误差：量取 1.00μL 注入气相色谱仪的量可能有误差（对外标法有较大影响）；另外，GC 中手动进样技术的熟练与否也影响到分析结果的好坏。

4仪器本身的误差：峰出现拖尾、分裂等情况会对峰面积计算有影响，且有噪音影响，而且同一个样品测量结果也会有不小的误差，说明仪器本身有一定的误差。

3.优化方式：1操作方面，用较为准确的微量注射器或者移液枪来移取溶液，提高配制溶液的浓度准确度；或者增加梯度浓度组，提高线性相关度，减小误差。

2样品方面，将待测的未知样品中蘑菇醇的浓度提高一些，使之落在标准工作曲线正中间，提高准确性。

ml mg ll ml mg /326.13200400/140.106571.0c =⨯⨯=μμ未知样3仪器方面：若实验时发现样品中各物质的峰分离不完全，可选择降低柱箱升温速率，减少色谱柱流量，增大进样口分流比，或减小进样量，若还是无法分离，则需考虑改换极性更强的色谱柱。

实验时应根据具体情况进行调整2、比较归一化法，外标法和内标法各自的优缺点。

答：1.归一化法：优点：①与进样的准确性无关，与仪器和分析条件有关；②操作条件略有变动或进样量控制不十分精确对分析结果影响都很小缺点：①定量计算必须先知道各成分的校正因子，校正因子的得出较麻烦；②所有有效组分必须出峰，且所有组分必须在一个分析周期内流出色谱峰；2.外标法：优点：①简便，适用范围广；②只关注待测成分出峰，不需要所有成分出峰。

缺点：①必须有被测组分的纯品作为标准对照物；②此方法准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响；③若响应值与试样的浓度或含量没有线性关系，则需要大量的校正数据且误差较大。

3.内标法：优点：①定量测量较准确，其结果与进样量重复性无关；②只需要内标物与被测物出峰，达到一定的分离度即可；③常用于未知样品的GC定量检测以及微量成分含量检测。

缺点：①内标物需要跟待测组分在同样条件下出峰，且分离度较好，所以内标物的选择较困难；②配置较麻烦；3、你对本实验有什么意见或建议吗？答：①由于内标法对样品制备的要求较高，在配置标准溶液时可以配置两组，进行平行实验，可以增加实验结果的可靠度；②实验中所用到的氯苯、乙腈等试剂有一定的毒性，在实验过程中应注意操作规范和实验安全，配置溶液时应在通风橱中进行，提供手套口罩等；③本实验的溶液配制及仪器操作均较较简单，在实验过程中有很长的等待时间，仪器的操作一人即可完成，实验室有4台仪器，可以考虑将仪器全部投入使用，可以使小组四位同学均在实验中得到锻炼。

【讨论与体会】气相色谱法是化学学科特别是有机化学中分离、表征物相的基本表征手段之一，实验原理较简单，操作也较轻松，但想要得到良好的线性内标曲线并不容易。

通过气相色谱技术，定性、定量分析了奶茶中的香兰素的含量。

下面是本实验的一些经验和体会：1、本实验主要是上机操作，所以实验前最好预习相关操作，在助教老师讲解时认真听讲、熟悉操作过程；2、进样时要特别注意：取样后，一手持注射器，另一只手保护针尖，防止插入隔垫时弯曲）。

先小心地将注射针头穿过隔垫，随即快速将注射器插到底，并将样品轻轻注入气化室，同时按start 键，拔出注射器，注射样品所用时间及注射器在气化室中停留的时间越短越好；3、在进多个不同样品时，每次进样前都要将进样针润洗干净，确保洗针溶剂不干扰样品检测，并且针外壁应擦试干净，减少干扰；4、注射器的插入与取出既要迅速又要小心谨慎，不要用力过猛使针芯弯曲在探头中。

本实验在配置和移取溶液的过程中，锻炼了我们认真耐心、一丝不苟的态度，巩固了基础分析化学的相关操作；在两人配合上样的过程中，提高了团结合作、相互配合的能力；在处理数据和作图的过程中，提高了处理数据和定性分析的能力。