色谱技术在体内药物分析中的应用进展

色谱技术在体内药物分析中的应用进展

童珊珊1,余江南1综述　刘文英2,安登魁2审校

(1.镇江医学院,江苏镇江　212001;2.中国药科大学,江苏南京　210009)

摘要:本文综述了近年来色谱技术在体内药物分析中的应用进展,包括柱切换技术、手性色谱技术、高效毛细管电泳技术、超临界流体色谱技术以及色谱联用技术。由于这些新技术在进样方式、分离模式、检测手段等方面独特的优越性,从而提高了分析的准确度、灵敏度和选择性,使色谱技术成为体内药物分析中最强有力的工具之一,具有广阔的应用前景。

关键词:色谱技术;色谱联用技术;体内药物分析

中图分类号:R917　文献标识码:A　文章编号:1001-0971(2000)06-0360-05

在体内药物分析中,色谱技术一直是研究体内药物及其代谢物最强有力的手段。目前,随着药物分析技术与其他学科新技术相结合,色谱技术在进样方式、分离模式、检测技术及适用对象等方面迅速发展。近年来,色谱技术在体内药物分析中应用的最新研究进展主要集中在柱切换技术、手性色谱技术、高效毛细管电泳、超临界流体色谱和色谱联用技术。

1　柱切换技术

在生物样品分析中,随着高效液相色谱(HPLC)的广泛应用,样品的预处理显得尤为重要。但预处理一般耗时,耗费试剂,还需要有足够量的样品,往往会给结果带来较大误差。为解决这一问题,柱切换技术(column switching)得到迅速发展。柱切换技术最显著的特点是其在线分离,在不降低灵敏度的情况下,不仅增强了色谱的选择性,对微量样品进行富集,防止样品在预处理中受到污染,还能在一个柱切换体系内以多种切换方式来分离复杂的组分。一般一个柱切换系统内有多个泵,多个分析柱或预柱,多种洗脱体系。近年来的研究表明,将直接进样固定相运用于柱切换系统中,可使柱切换技术处理含蛋白质等杂质的生物样品更加有效。直接进样固定相又称限进介质(restricted access media, RAM),其特点是:填料表面有足够的亲水性,避免蛋白质变性;填料孔径足够小,使蛋白质能完全洗

　收稿日期:2000-03-29

　基金项目:江苏省青年科学基金资助项目(BQ98043);镇江医学院博士科研启动基金资助项目(9942)脱;内表面具有足够疏水性,使小分子物质获得满意的色谱分离。近年来研制的种类包括涂渍蛋白质的ODS柱,内表面反相固定相(ISRP),屏蔽疏水相(SHP),半渗透表面固定相(SPS),混合功能固定相(MFP)、二元层叠相填料以及以聚合物为基质的固定相等。

Oertel等[1]用柱切换技术测定生物体液中的药物,无需预处理,用一根分析柱,两根固相萃取柱的自动双柱系统将生物体液直接注入,首先在萃取柱上进行提纯富集,当生物基质充分洗脱后,再用柱反冲技术将待测组分带入分析柱进行分离。Eklund 等[2]用超过滤法和偶联柱液相色谱法测定了血浆中的游离沙美利定(sameridine)的浓度。偶联柱由一个反相柱,一个阳离子交换萃取柱和一个阳离子交换分析柱组成,用U V检测器于205nm处检测,最低定量限(LOQ)为1nmol・L-1,实验结果选择性很高。Cavaleri等[3]采用柱切换技术分析尿液中的肽类抗生素药雷莫拉宁(ramoplanin)。预柱固定相为ISRP,用醋酸调节到pH 3.3,反相分析柱,用两种不同的洗脱液4个泵以回路切换方式进行测定,分析结果LOQ为0.1mg・L-1,线性范围0.1～2 mg・L-1,RSD为0.71%～8.75%,分析全过程35 min,选择性、准确度极高。

2　手性色谱

为了评价药物对映体的生物学活性,检查其光学纯度,近年来药物对映体测定技术尤其是拆分和定量方法有了迅速发展,并在分离分析生物体液中药物对映体及其药代动力学研究中发挥了重要的作

用。

测定药物对映体的方法有直接法和间接法,在体内药物分析中,待测药物浓度很低,一般采用直接法(即在色谱中运用手性固定相或手性流动相添加剂)进行测定。目前,在药物分析领域中应用较为广泛的手性固定相主要有环糊精手性固定相、蛋白质手性固定相及Pirkle型手性固定相。常用的手性流动相添加剂有手性蛋白、环糊精手性试剂、手性冠醚等。Sueyasu等[4]用HPLC法测定了人血中的硫戊巴比妥及其对映体,先用预柱对样品进行净化处理,分析柱采用A1-酸性糖蛋白手性固定相(AGP),在15min内分离出药物对映体母体及其代谢物,检测限(LOD)为15ng・L-1,回收率91%～93.4%。Wu 等[5]用高效毛细管电泳法测定了血液中抗精神病药氟哌啶醇及其手性代谢物,在电泳的磷酸盐缓冲液中加入10L mol・L-1的二甲基B-环糊精作为手性流动相添加剂,待测对映体校正曲线线性范围为50～500nmol・L-1,LOD为30L g・L-1。Rudaz等[6]亦采用该法测定了曲马朵(tr amadol)对映体及其在尿液中的代谢物,在缓冲液中加入B-环糊精,在30 min内分离出6对对映体。较新开发的毛细管电泳的手性流动相添加剂还有大分子抗生素,如万古霉素、利托菌素(ristocetin)等。已在实际应用中显示了较佳的应用前景。

近年来,利用超临界流体色谱技术进行手性拆分引起人们的关注,并在药物的手性分离中体现了高效快速、操作条件易于变换的优越性。但由于在设备和技术上的要求较高,在理论上各种参数对立体选择性及分离效率的影响机制尚未完全清楚,限制了该技术在体内药物分析中手性分离上的应用,但随着理论和技术上的日趋完善,可以预见超临界流体色谱技术在体内手性分析中具有巨大潜力。

3　高效毛细管电泳

高效毛细管电泳(high-per for mance capillary electrophor esis,HPCE)是20世纪80年代后期发展起来的经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物,它分离模式多,分离效率高,速度快,适用范围广,所需样品、试剂用量少,在体内药物分析中得到广泛应用。特别是近年来出现了各种在柱预浓缩技术,如场放大、电堆积富集、等速电泳聚焦浓缩、固相预浓缩、膜预浓缩等,大大提高了HPCE的检测灵敏度。其中,场放大样品富集(field-amplified sample stacking,FASS)技术操作方便,灵敏度提高显著,在体内药物分析中应用极为广泛。Eap等[7]采用FASS技术对血样中的四环类抗抑郁药物进行富集,测定了米安色林(mianserin)、去甲米安色林、8-羟基米安色林及其对映体的血药浓度。在进样前以流体动力进样法引入一小段水柱,加压到5kV后,该区场强增高,使待测物快速迁移入毛细管,在水柱和背景电解质交界处进行富集。米安色林和去甲米安色林的LOQ为5L g・L-1,8-羟基米安色林的LOQ为15L g・L-1,检测快速,适用于治疗药物监测。Song等[8]采用该技术测定了血液中的二甲双胍,还指出由于待测物的极性很大,血液中的带电离子和蛋白质会影响富集效果,所以生物样品测定前的去蛋白和萃取很重要。

固相预浓缩(solid-phase preconcentration)技术是在柱前采用一个微型浓缩室,内填固相填料,样品中的待测组分在浓缩室内进行提纯和富集。Pe-tersson等[9]采用固相预浓缩技术测定了血液中的特布他林(terbutaline)及其对映体。以一根内径为200L m的毛细管短柱作为浓缩室,内填厚度为12 L m的C18硅胶,两端用玻璃纤维过滤器隔开,与电泳毛细管相连。整个在线富集过程包括:先用水和甲醇对浓缩室进行冲洗和浸润,样品吸附到填料上,基质的洗脱,待测物的解离,最后再用CE缓冲液对提纯和浓缩后的样品进行分析测定。在一根58cm的电泳毛细管上达到了250000塔板数的分离效率,分析灵敏度提高了7000倍,LOD达到0.6nmol・L-1,而若不进行富集,只能达到4.4L mol・L-1。

HPCE与HPLC均为液相分离技术,在很大程度上,二者互为补充。Wynia等[10]将HPLC与HPCE加以比较,分别用这两种技术测定体液中的抗抑郁药,考察了实验结果的精密度、线性、LOD 等,认为虽然HPCE比HPLC进行分析更加快速、简便、且柱效更高,但精密度和检出灵敏度都逊于HPLC,通过柱上浓集技术的深入研究,HPCE的灵敏度将不断提高,成为研究体内药物的有力工具。

4　超临界流体色谱

超临界流体色谱(super critical fluid chr omato-graphy,SFC)早在1962年就已问世,但由于技术上的原因,1980年以后才得到推广。所用的流动相是超临界流体(SF)并加入改性剂以调节溶解、洗脱能力、改善峰形。CO2的临界温度31℃,临界压力730