ZBL-生物化学第五章蛋白质化学(5-13节)讲义
吉林大学食品化学第5章 蛋白质protein1
Amphiphilic两亲的 2° Structures
Hydrophilic Hydrophobic
折叠片结构 β-折叠
b-Sheet
C=O and N-H perpendicular to chain form inter-segment Hbonds Parallel or antiparallel b-strands typically 5-15 A.A. More stable than a-helix
其它
二硫键
金属离子在蛋白质结构和稳定性中起作用
蛋白质构象的稳定性和适应性
蛋白质结构的细微变化 蛋白质的构象对环境的适应性对蛋白质执行各种功 能是必要的
如具有催化作用的蛋白质需要高度的稳定，通常分子间 存在双硫键
导致不稳定的因素是多肽链的构象熵
Conformational entropy （ △Sconf ）
Occurs suddenly and completely over a narrow range of conditions Slowly reversible可反转的 (if at all)
5.4.3 变性蛋白质的性质
Hydrophobic core
Hydrophilic surface
Fast under non-physiological conditions
( ) Quaternary
Denatured
Common in foods. Many nonnative forms depending on protein structure, solution conditions (& history) and ingredient interactions
食品化学第5章蛋白质化学
溶解性
饮料
乳清蛋白
粘度
汤、调味汁
明胶
持水性 香肠、蛋糕、 肌肉蛋白，鸡蛋蛋白
胶凝作用
肉和奶酪
肌肉蛋白和乳蛋白
粘结-粘合 肉、香肠、面条 肌肉蛋白，鸡蛋蛋白
弹性
肉和面包
肌肉蛋白，谷物蛋白
乳化
香肠、蛋糕 肌肉蛋白，鸡蛋蛋白
泡沫
冰淇淋、蛋糕 鸡蛋蛋白，乳清蛋白
脂肪和风味 的结合
油炸面圈
谷物蛋白
水化性质 路漫漫其修远兮,
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
大豆组织蛋白的结构
六、面团的形成
面筋蛋白
麦谷蛋白：分子质量大，二硫键（链内、链
间），决定面团的弹性、黏合性和抗张强度
（占Pr80％） 麦醇溶蛋白：链内二硫键，促进面团的流
动性、伸展性和膨胀性。
过度黏结
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
吾将上下而求索
结构性质
表面性质
感观性质
一、蛋白质的水合性质
蛋白质分子中带电基团、主链肽基团、 Asn、Gln的酰胺基、Ser、The和非极性 残基团与水分子相互结合的性质。
如分散性、湿润性、溶解性、黏度、胶 凝作用、乳化和起泡性等，都取决于水-蛋 白质的相互作用。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
作用方式：
凝胶化作用：是指变性的蛋白质分子聚集并形成 有序的蛋白质网络结构过程。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
凝胶化作用机制
溶胶状态----似凝胶状态-----有序的网络结构状态
凝胶化的相互作用
静电相互作用 氢键、疏水相互作用 二硫键 金属离子的交联相互作用
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
生物化学蛋白质化学
生物化学第一章蛋白质化学第一节蛋白质的重要性?蛋白质是机体最丰富的有机分子，占人体重量的16~20%，占干重的45%，肺组织高达80%。
?蛋白质的生物学功能：生物催化作用、调节作用（激素，基因表达调控作用）、免疫防御与保护作用（细胞因子、补体、抗体）、转运和储存作用（转运蛋白）、结构功能（保护和维持细胞、组织、器官的正常生理形态，细胞骨架）、运动与支撑作用、信息接收传递作用（受体蛋白）、生物膜功能?蛋白质组学：蛋白质组指的是基因组编码的全部蛋白质，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质；蛋白质组学本质上指的是在机体整体水平上系统地研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代等过程的整体而全面的认识。
第二节蛋白质的化学组成?蛋白质含氮量平均为16%，蛋白质的含量=含氮量x6.25。
?天然存在的氨基酸约180种，组成蛋白质的氨基酸只有20余种（基本氨基酸）。
?基本氨基酸的共同特点：①除脯氨酸为α-亚氨基酸外，其他组成蛋白质的基本氨基酸均为α-氨基酸；②除甘氨酸外，其他氨基酸的α-碳原子为手性碳原子，且天然蛋白质中基本氨基酸皆为L-型；③不同的氨基酸的R链不同，对蛋白质的空间结构和理化性质有重要影响。
?20种常见氨基酸的名称和结构式（见书P11）?氨基酸的分类非极性R基氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸；极性不带电R基氨基酸（易溶于水）：甘氨酸、丝氨酸、氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；带负电的R基氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；带正电的R基氨基酸：赖氨酸、组氨酸、精氨酸。
?氨基酸的物理性质：①高熔点，200℃以上，以离子状态存在；②一般均溶于水，溶于强酸、强碱；不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂；③氨基酸一般有味；④除甘氨酸外均有旋光性。
?氨基酸的化学性质：①两性解离与等电点：pH高于等电点带负电，低于等电点带正电。
生物化学蛋白质课件
（二） 生物活性肽
1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH)
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生物化学蛋白质课件
•H2O
2
•2H2 O
•2GSH
•GSH过 氧化物酶
•GSSG
•NADP+
• GSH还原 酶
•NADPH+H+
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生物化学蛋白质课件
三、蛋白质的分类
•* 根据蛋白质组成成分 •单纯蛋白质 •结合蛋白质 = 蛋白质部分 + 非蛋白质部分
•精氨酸 arginine
Arg R 10.76
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•组氨酸 histidine
His H 7.59
生物化学蛋白质课件
•特殊氨基酸
• 脯氨酸 •（亚氨基酸）
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生物化学蛋白质课件
• 半胱氨酸
•+
•-HH
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•二硫键
•胱氨酸
生物化学蛋白质课件
•（二）氨基酸的理化性质
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生物化学蛋白质课件
•（一） -螺旋
•（二）-折叠
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生物化学蛋白质课件
•（三）-转角和无规卷曲
•-转角
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• 无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的 • 那部分肽链结构。
生物化学蛋白质课件
•（四）模体
• 在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具 有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一 个特殊的空间构象，被称为模体(motif)。
• 谷氨酰胺 glutamine
Gln Q 5.65
• 苏氨酸 threonine
蛋白质的化学—蛋白质的理化性质(生物化学课件)
蛋白质的化学
1
蛋白质的分子组成
2
蛋白质的分子结构
3
蛋白质的理化性质
血糖
**
蛋白质的化学
3.蛋白质的理化性质
3.1
等电点
目录 3.2
沉淀
CONTENTS
3.3
变性
三级结构和四级结构
**
3.1
等电点
一、蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质分子中具有可解离基团，分别可以使其带上 正、负电荷，因此蛋白质也具有两性，在电场中也可以 电泳。
条件 pH = pI pH = pI pH > pI pH < pI
能沉淀各类生物碱的化学试剂叫做生物碱试剂。 如：单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉 淀各类生物碱
湖北职业技术学院 医学院《人体机能学》教学课件
人体机能学
• 蛋白质沉淀的实践应用 1.分离制备有活性的天然蛋白制品 2.从制品中除去杂蛋白，或者制备失去活性的蛋白质 制品
湖北职业技术学院 医学院《人体机能学》教学课件
+++
酸
+
+碱
++
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质
碱
－－
－
－
酸
－ －－
－
带负电荷的蛋白质
脱水作用
++ +
+
+
+ ++
带正电荷的蛋白质
脱水作用
脱水作用
－－
碱
酸－
－
－
－－ －
不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
化学生物学导论蛋白质化学12PPT课件
COOH
H2NCH2CHCH2CH2CHCOOH
OH
NH2
4-羟基脯氨酸
5-羟基赖氨酸
CH3NHCH2CHCH2CH2CHCOOH NH2
6-N-甲基赖氨酸
I
HO
CH2CHCOOH
I
NH2
3,5-二碘酪氨酸
☺胶原中出现的羟基氨基酸残基是形成坚韧的胶原纤维的必要条件； ☺甲状腺球蛋白中带有甲状腺素等碘化酪氨酸残基。
碳
50%～55%
氮 15.0％～17.6％
氢
6.9％～7.7％
硫
0.3％～2.3％
氧
21%～24％
磷
0.4 %～ 0.9%
在任何生物样品中，每克氮的存在，大约表示该样品含 100/16=6.25g蛋白质。凯氏定氮法以生物样品中的含氮量计算
蛋白质含量（质量分数，％）＝每克样品中氮含量g 6.25 100%
重要知识点！
化学与材料科学学院
等电点的确定
pK1和pK2分别代表α碳上COOH和 NH3+的解离常数负对数。
曲线的转折点pK1=2.34，在此pH条件 下，有一半发生电离。可以将1mol/甘氨 酸溶于水时，溶液的pH约为6 ，用标准 盐酸溶液进行滴定，得到滴定曲线A。
曲线的转折点pK2=9.6，另一半电离。 用标准NaOH溶液滴定,得到曲线B。
碱所滴定，可根据氨基酸的滴定曲线来推算pK值。
氨基酸的等电点 pI
化学与材料科学学院
等电点的定义
❖等电点(isoelectric point, pI) :在某一pH的溶液中， 氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成 为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨 基酸的等电点。
生物化学蛋白质的化学知识点
生物化学蛋白质的化学知识点一、知识概述《生物化学蛋白质的化学知识点》①基本定义：蛋白质啊，简单说就是由许多氨基酸按一定顺序连起来的大分子。
就好比许多小珠子（氨基酸）串成一条长长的链子（多肽链），然后这些链子还能盘曲折叠，最后就形成了蛋白质。
②重要程度：在生物化学里那可是超级重要的。
像是细胞结构的组成部分啊，很多酶也是蛋白质，有了它们生物体内各种各样的化学反应才能顺利进行呢。
我觉得它就像建筑里的砖块一样，是构建生物体的基础。
③前置知识：咱们得先大概知道氨基酸是啥吧，毕竟蛋白质是由氨基酸组成的。
还有化学键的基本概念，像肽键就是连接氨基酸的重要化学键。
④应用价值：在制药方面，如果了解蛋白质的结构和功能，就能开发出针对特定蛋白质的药物。
在食品行业，像检测食物中的蛋白质含量也是基于这个知识点。
二、知识体系①知识图谱：蛋白质的化学知识点在生物化学学科里算是核心板块了。
它和核酸化学、酶化学等知识点都有联系。
打个比方，蛋白质和核酸就像伙伴，核酸给出指令，蛋白质负责做事。
②关联知识：和生物大分子中的核酸关联密切，核酸指导蛋白质的合成。
而且与新陈代谢的知识点也有联系，因为很多代谢反应是蛋白质（酶）参与催化的。
- 掌握难度：难。
- 关键点：理解蛋白质的一、二、三、四级结构比较难，像是四级结构，好多条肽链怎么组合起来的，得好好琢磨。
④考点分析：- 在考试中的重要性：非常重要。
- 考查方式：会直接考蛋白质的结构层次、氨基酸的组成计算，也会间接考蛋白质在某些生理过程中的作用。
三、详细讲解【理论概念类】①概念辨析：- 蛋白质就是由氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。
氨基酸好比是字母，按照特定顺序排列就能写出不同的单词（小的肽段），这些肽段再组装就成了蛋白质这个大文章。
②特征分析：- 具有两性电离特性。
这就是说它既能像酸一样给出质子，又能像碱一样接受质子。
比如说，在人体不同的生理pH环境下，蛋白质的带电情况就不一样。
- 有特定的空间结构。
生物化学蛋白质课件
• 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化
原因CO：OαH-羧-基H+ pK1在2.0C左O右O-，-当H+pH>3.5，CαO-O羧- 基
以 H3N+
CH
-RCOO-
pK1'
形+ 式 H+
存H在3N。+
αC R-
氨H基
pK pK2'
+ H+2
在
9H.24N左C右 R
，H
当
PH pH1 <8.0
pH=pK+lg[Gly±]/[Gly+] = pK1 = 2.34 第二拐点： 100%Gly± 净电荷：0 等电点pI 第三拐点： 50%Gly± ，50%Gly- 平均净电荷：-0.5
pH=pK2+lg[Gly-]/[Gly±]=pK2=9.6 终点： 100% Gly- 净电荷：-1
His咪唑基的pKa值为6.0，在pH7附近有明显的缓冲作用。 在生理条件下，只有His有缓冲能力。血红蛋白中His含量 高，在血液中具很强的缓冲能力。
第一章 蛋白质(Protein)
蛋白质存在于所有的 生物细胞中，是构成 生物体最基本的结构 物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的 物质基础，它参与了 几乎所有的生命活动 过程。
第一节 概 述
一、蛋白质的定义 蛋白质：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸
通过肽键连接而成的生物大分子；其种类繁多，各具有 一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功 能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。
★蛋白质含量的测定：凯氏定氮法(测定氮的经典方法) 优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单； 缺点：易将非蛋白氮(如核酸中的氮)都归入蛋白质中, 不精确。
蛋白质化学讲义
第二章蛋白质化学要求掌握：氨基酸的种类；蛋白质的结构层次；蛋白质的重要性质；熟悉：氨基酸的重要化学性质；蛋白质分离纯化技术的基本原理。
了解：蛋白质的分类；蛋白质的结构与功能的关系；重点内容：氨基酸的种类；蛋白质的结构层次；蛋白质的变性、别构和两性性质。
难点内容：肽键，蛋白质的空间结构。
英文名：Protein希腊语：П ，本义为“最原初的”“第一重要的”有学者建议中文译为朊（ruan）蛋白质是一类重要的生物大分子第一节概述一、蛋白质的化学概念蛋白质是生命的物质基。
氨基酸是蛋白质的基本组成单位。
二、蛋白质的分类（一）根据分子形状：球状蛋白质纤维状蛋白质（分子轴比小于10 （分子轴比大于10）较易溶解，如血红蛋白）可溶性不溶性（如血纤维蛋白原）（角蛋白）（二）根据化学组成单纯蛋白质：仅由氨基酸组成结合蛋白质：蛋白部分+非蛋白部分核蛋白色蛋白糖蛋白脂蛋白磷蛋白（三）根据溶解度清蛋白：又称白蛋白，溶于水。
精蛋白：溶于水及酸性溶液。
组蛋白：溶于水及稀酸溶液。
球蛋白：微溶于水和稀的中性盐。
谷蛋白：不溶于水、醇和中性盐，溶于稀酸稀碱。
醇溶蛋白：溶于70~80%乙醇，不溶于水。
硬蛋白：不可溶。
（三）根据功能催化功能、调节功能、保护和支持功能、运输功能、储存和营养功能、收缩和运动功能、防御功能、识别功能、信息传递功能、基因表达调控功能、凝血功能、蛋白质的其他众多生理功能第二节氨基酸一、蛋白质的元素组成的显著特点----平均含氮量等于16%这是凯氏定氮法测定样品中蛋白质总含量的理论基础：蛋白质百分含量=氮百分含量X6.25注意：（1）所测为粗蛋白（2）不同样品中换算系数可不同二、氨基酸的种类（一）氨基酸的结构通式NH2R – CO – COOHHR表示侧链基团，R基不同则氨基酸不同。
氨基酸为两性电解质天然氨基酸有180多种，其中参与蛋白质组成的氨基酸称为蛋白质氨基酸。
常见蛋白质氨基酸有二十种，这二十种氨基酸称为基本氨基酸其他称为非蛋白质氨基酸。
食品生物化学课件
食品生物化学
第五章 蛋白质化学
二、蛋白质的化学组成 蛋白质是生命活动的物质基础。 生物体内的蛋白质是除水以外，机体组织中最
多的组分，占人体干重的45%，占细胞干重的 50～70% 。
食品生物化学
第五章 蛋白质化学
㈠蛋白质的元素组成（按干重计算）
有些蛋白质含有 其它微量元素：
P、Fe、Cu、 Mn、
食品生物化学
第五章 蛋白质化学
三、氨基酸的重要理化性质 ㈠物理性质
⑴形态 ⑵溶解性 ⑶熔点 ⑷旋光性 ⑸味感 ⑹光吸收
食品生物化学
第五章 蛋白质化学
⒈形态
均为白色结晶或粉末，不同氨基酸的晶型结构不 同。有六角、四角 、菱状、柱状等。
如： L-Glu（四角柱）
D-Glu（菱状）
⒉溶解性
一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮、 乙醚 ，在稀酸和稀碱中溶解性好。
芳香族氨基酸：
苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸
杂环氨基酸：
脯氨酸、组氨酸
食品生物化学
第五章 蛋白质化学
3、按侧基R基与水的关系分：
非极性氨基酸：
甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸
极性不带电氨基酸：
天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、 酪氨酸、半胱氨酸
极性带电氨基酸：
食品生物化学
第五章 蛋白质化学
生命是蛋白体的存 在方式，这种存在 方式本质上就在于 这些蛋白体的化学 组成部分的不断自 我更新。
恩格斯《反杜林论》1878
食品生物化学
第五章 蛋白质化学
第一节 蛋白质的概述
一、蛋白质定义及生物学意义
㈠定义
蛋白质是由许多不同的α-氨基酸按一定的序列 通过酰胺键铆（蛋白质化学中专称为肽键）缩 合而成的，具有较稳定的构象并且具有一定生 物功能的生物大分子。
生物化学蛋白质化学下ppt
模体（motif）
转角
-转角
螺旋
螺旋 -螺旋 N
模体：在许多蛋白质的分 子中，常发现几个（多为 23个）具有二级结构的 肽段相互靠近，形成具有 特定功能的空间构象；或 者仅是一个具有特定功能 的很短的肽段。
C
HTH模体结构示意图
螺旋-转角-螺旋模体由2个螺旋和1个转角组成。HTH模体是DNA结合蛋白三维
基。第2个螺旋是DNA识别部位，结合于DNA分子的深沟中。
五 球状蛋白的三级结构
由蛋白质二级结构、超二级结构或结构域相互连接组 合形成的蛋白质构象结构称谓蛋白质三级结构。 具有三级结构的多肽链称谓亚基（subunit）。单个 多肽链构成的蛋白，具有三级结构才能有活性。多条 肽链形成蛋白，需要亚基进一步组合才能有活性。 亲水基团在外，疏水基团在内，形成疏水核心。
Glu Gln Cys
Ser
Cys Thr
Asn Gln His Leu
Val 1 Phe
5
Cys
Gly
Ser
Asn
COOH
Tyr
20
Cys
Asn
Lys Pro Thr
Tyr
Val
Cys
Gly Glu
Leu 20 Arg
Gly
Phe Phe
25
Tyr
NH2
10 His
Leu 15
B链
Leu
Ala
Val Glu
蛋白质
OHH+
蛋白质
带正电荷的亲水胶体 在等电点时的亲水胶体 带负电荷的亲水胶体
脱
脱
脱
水
水
大学生物化学之蛋白质讲课文档
和 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为
命 终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：
名
Ser-Val-Tyr-Asp-Gln
第二十八页，共89页。
第二十八页，共89页。
肽的命名
❖ 从肽链的N-末端开始，残基用酰称呼。
例如：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸,
简写：Ser-Gly--Tyr -- Ala -- Leu，
某些蛋白质具有转运功能，携 带各种小分子、离子等从一处到 另一处。
第十四页，共89页。
1. 催化 2. 调节
3. 受体
4. 转运
5. 贮存
6. 运动 7. 结构成分 8. 防御 9. 异常功能
有些蛋白质有贮藏氨基酸的作用，用作有 机体生长发育的氮源。
如蛋类中的卵清蛋白为鸟类胚胎发育提供 氮素
小麦种子中的醇溶蛋白为种子发芽提供氮素。
书写时，通常把NH2末端AA残基放在左边，COOH末端AA残基 放在右边。
❖ 共价主链：肽链的骨干是由--N --Cα --C --序列重复排列而成，
称为共价主链。
第二十九页，共89页。
第二十九页，共89页。
四肽的结构
第三十页，共89页。
第三十页，共89页。
三、肽的重要理化性质
1.每种肽也有其晶体，晶体的熔点都很高。
胰岛素（insulin ）的一级结构：
胰岛素是动物胰脏β细胞分泌的一种分子量较小的激素蛋白，主要功能是降 低体内血糖含量。
胰岛素的分子量为5734道尔顿 ，由51个氨基酸组成。 含A、B两条链，（A链：21 肽 ，B链：30肽）。
A链和B链之间由两个链间二硫键（A7-B7,A20-B19)连
接，A链本身第6位和第11位的2个Cys残基之间形成一个
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• carboxypeptidase (羧肽酶法)
Phe Glu
~~~~Leu-Glu-Phe-COOH
leu
Reaction time (hour) 12
2. 二硫键的拆开和肽链的分离
• 一般情况下，蛋白质分子中肽链的数目应等于N末端氨 基酸残基的数目，可根据末端分析来确定一种蛋白质 由几条肽链构成。
2
以胰岛素为例，它的主要功能是降低体内血糖含量。临床上用 来治疗糖尿病。最先由Sanger于1953年完成测定胰岛素一级 结构.
3
二、蛋白质序列的测定步骤
测定蛋白质的一级结构，要求样品必须是均一的（纯度大 于97％）而且是已知分子量的蛋白质。一般的测定步骤是： 1. 拆开肽链内部的二硫键。（β-巯基乙醇、二硫苏糖醇） 2. 通过末端分析确定蛋白质分子由几条肽链构成。 3. 将每条肽链分开，并分离提纯。可用8mol/L尿素或6mol/L盐
→
14
3. 肽链的部分水解和肽段的分离
（1）部分酸水解：限制水解时间、酸强度、水解温度 （2）用溴化氰处理，可断裂甲硫氨酸的羧基形成的肽键。
水解后甲硫氨酸残基转变为C末端高丝氨酸残基。 （3）酶水解 • 胰蛋白酶（trypsin）:它专门水解赖氨酸和精氨酸的
羧基形成的肽键，所以生成的肽段的C末端是赖氨酸或 精氨酸。 • 糜蛋白酶:水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水残基 的羧基形成的肽键。其他疏水残基反应较慢。
③ 羧肽酶法更常用： • 将蛋白质在pH 8.0, 30℃与羧肽酶一起保温，按一定
时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根 据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸 的排列顺序。 • 羧肽酶A水解除精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外所有肽键， 羧肽酶B水解精氨酸和赖氨酸。
11
Amount of Amino Acid residue (mol/l)
18
6. 肽链的完全水解和氨基酸组成的测定
15
• 胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶：前者水解疏水残基之间的肽键， 后者水解疏水残基的氨基形成的肽键。
• 金葡菌蛋白酶：又称谷氨酸蛋白酶或V8蛋白酶，水解谷氨 酸和天冬氨酸的羧基形成的肽键。在醋酸缓冲液中只水解 谷氨酸，在磷酸缓冲液中还可水解天冬氨酸。
• 梭状芽孢杆菌蛋白酶：水解精氨酸羧基形成的肽键。
16
• ② 丹磺酰氯法比DNFB法灵敏100倍。 • 丹磺酰氯是一种强荧光剂，可用于测定肽链的氨基末端，它
能专一地与链N-端α-氨基反应生成丹磺酰-肽，后者水解生 成的丹磺酰-氨基酸具有很强的荧光，可直接用电泳法或层 析法鉴定出N-端是何种氨基酸。
7
• ③ 异硫氰酸苯酯(PITC)法 • 又叫 Edman降解法。此法在pH9．0的碱性环境下，将异硫
• 必须设法把这些肽链分离开来，然后测定每条肽链的 氨基酸顺序。
13
• 如果这些肽链之间不是共价交联的，可用酸、碱、高浓度的盐或其他 变性剂处理蛋白质，把肽链分开。
• 如果肽链之间以二硫键交联，或肽链中含有链内二硫键，则必须用氧 化或还原的方法将二硫键拆开。如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇等。
• 二硫键拆开后形成的不同肽链，可用纸层析、离子交换柱层析、电泳 等方法进行分离。
第一套肽段 HOWTOUSEOVERLAPS 第二套肽段 HOWTOUSEOVERLAPS
6
测序过程中常用方法：
1. 末端分析 （1）N末端测定 • ① 二硝基氟苯(DNFB)法---Sanger法 • DNFB在弱碱性溶液中与肽链末端自由氨基反应，生成黄色的
二硝基苯基蛋白质（DNP-蛋白质），酸水解后生成DNP-AA和 其它氨基酸混合物，再用色谱分析鉴定氨基酸种类。
第五节 蛋白质的共价结构
蛋
一级结构
共价结构
白
二级结构
质 的
超二级结构
高级结构
结
结构域
空间构象
构
三级结构
层
四级结构
次
1
一 蛋白质一级结构的概念
蛋白质的一级结构----是指蛋白质肽链中氨基酸的组成及排 列顺序。 一级结构的主要化学键是肽键，有些还包括二硫键（-S-S-） 。因共价键的键能大，故蛋白质的一级结构稳定性较强。 蛋白质的一级结构是最基本的结构，它决定着蛋白质高级结 构。
的氨基酸顺序，利用不同肽段的AA顺序彼此间的交错重叠， 拼凑出整条多肽链的AA顺序。 9. 测定原来的多肽链中二硫键和酰胺基的位置。
5
氨基末端残基 H
羧基末端残基 S
第一套肽段
OUS PS EOVE RLA HOWT
第二套肽段
SEO WTOU VERL
APS HO
末端残基 H
S
末端肽段 HOWT
APS
酸胍处理，即可分开多肽链。
4. 肽链的一部分样品进行完全水解，测定其氨基酸组成和 比例。
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二、蛋白质序列的测定步骤
5. 肽链的另一部分样品进行末端鉴定。（二硝基氟苯法 （FDNB）测N端；肼解法测C端。）
6. 肽链降解成一套大小不等的肽段，将各个肽段分离并测序。 7. 再用另一种部分水解方法水解成另一套肽段。 8. 用Edman降解等方法测定各肽段氨基酸顺序，比较两套肽段
4、肽段的氨基酸序列测定---主要采用Edman降解法
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•异硫氰酸苯酯(PITC)法
5、肽段在多肽链中次序的推断
氨基末端残基 H
羧基末端残基 S
第一套肽段
OUS PS EOVE RLA HOWT
第二套肽段
SEO WTOU VERL
APS HO
末端残基 H
S
末端肽段 HOWT
APS
Hale Waihona Puke 第一套肽段 HOWTOUSEOVERLAPS 第二套肽段 HOWTOUSEOVERLAPS
8
PITC
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测序过程中常用方法： （2）C末端测定 • ① C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的α氨基醇。
肽链水解后，再用层析法鉴定。 • ② 肼解法。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有
的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的 酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用纸层析鉴定。
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氰酸苯酯(PITC)和蛋白质或多肽N端氨基酸耦合，生成相 应的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH –AA），最后以色谱法鉴定 出降解下来的PTH-AA种类，从而得到蛋白质或多肽N端序 列信息。 • 优点：是异硫氰酸苯酯与所有氨基酸残基的反应产率和回 收率都相当高，因此反应副产物少，用色谱可以准确鉴定。 • 特点：从N-端依次对氨基酸进行鉴定。