医学免疫学实验五 流式细胞术检测免疫细胞表面标记
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FCM Applications
Flow Cytometry Principles
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种快速、准确、客观
的同时检测直线流动状态中单个细胞多项物理及生物学特性，加以分析定 量的技术。
检测速度快，分析样本量大在极短时间内可分析大量细胞，这
是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速 率进行测量。
Flow Cytometry Principles
了解目标抗原 1）细胞表面抗原 2）细胞内或是核内抗原（固定、透膜步骤） 3）以上两者兼备。先标记表面抗原，固定后，破膜 标记胞内抗原。 4）细胞内细胞因子的测定。使用细胞内蛋白分泌抑 制剂，如monensin、BFA，使得细胞因子不能分泌 到细胞外。（活化、固定、透膜）
•• " •
-
、 用BD CBA技 术 同 时 检 测 分泌到胞外的多种细胞因子
Flow Cytometry Applications
细胞周期 & 倍体分析
M G2
G0
G1
s
Байду номын сангаас
Journal of Molecular Signaling 2011, 6:13
Flow Cytometry Applications
Flow Cytometry Principles
Laser
侧向角散射光（SSC）
FALS Sensor
90LS Sensor
与激光束垂直的称为侧向角散射光信号（SSC）。SSC一般表 征细胞粒度及细胞内相对复杂性。
Flow Cytometry Principles
散射光信号，散点图 (Dot Plot)
流式细胞术检测免疫细胞表面标记
实验目的
1 了解BD FACS Verse的流式细胞术 2 学习并掌握FCM 的原理 3了解FCM 的运用 4 简单运用FCM检测免疫细胞特性
✓ Introduction FCM Principles FCM Applications
Introduction
BD是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于
了解荧光染料及其工作原理，做出准确的选择。 1）小分子化合物：FITC, Pacific Blue 2）大分子荧光蛋白： PerCP, PE, APC 3）串联染料：PE-Cy5, PerCP-Cy5.5
BD Fluorescence Spectrum Viewer A Multicolor Tool
—PE渗漏到FITC通道的信号 FL1-x%FL2 —FITC渗漏到PE通道的信号 FL2-x%FL1
Flow Cytometry Principles
在双色染色的实验中 （1）先用阴性管调电压 阴性管：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE （2）再用单染管调补偿 单染管：细胞+抗体A FITC or 抗体B PE
• RNA含量 • • 蛋白质含量 • • ……
细胞功能
• 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 • 细胞活性 • 细胞内/外的细胞因子 • 激素结合位点、细胞受体 • 蛋白磷酸化 • pH值 • 钙离子浓度 • 细胞膜电位、线粒体膜电位 • ……
用 BrdU. Annexin V 和其他方法检测 增殖和凋亡
1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。
Maxwell W. Becton
Fairlegh S. Dickinson
经过一百多年的发展，BD已成为世界上最大的医疗技术及医
疗设备公司之一，它以领先的技术、卓越的产品质量和诚实可
信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛赞誉。
BD Introduction ✓ FCM Principles
Flow Cytometry Principles
某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比 照射光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧 光的物质称为荧光素
单参数荧光直方图
双参数荧光散点图
流式细胞术操作流程
样本收集及处理 制备单细胞悬液 免疫荧光染色
上机检测 数据分析
Flow Cytometry Principles
利用优化的缓冲液和抗体借 助 流式细胞仪检测转录因子 表达
用流式细胞仪分选细胞或 检测细胞表面蛋白表达
用 BD Phosflow 抗 体 检测关键蛋白的磷酸化水平
用 ELlSA或 ELISPOT方 法 检 测
分泌的细胞因子
..，.---\1 用 流 式 细 胞 仪 检 测 特 异 细 胞 胞内细胞因子表达
100
80
60
40
20
0
300
350
400
4 5口
500
550
600
650
700
750
800
850
900
W avelength(nm)
BD
Flow Cytometry Principles
荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠 正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一 个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号
可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织，
悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。
BD
Flow Cytometry Principles
前向角散射光（FSC）
Laser
FALS Sensor
当激光束通过聚集的细胞颗粒时，激光向各个方向散射。与激 光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。FSC一般表征 细胞相对大小及其表面积。
荧光素的激发和发射光谱
激发光谱（Excitation，Ex） - 是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的 光线，也称为吸收光谱。 - 我们一般标注的是吸收波峰，也就是最大吸收波长： Ex-Max
发射光谱（Emission，Em） - 是指荧光素发射的一定波长范围内的荧光。所有荧光 都是宽谱发射。 - 一般标注的是发射波峰，即最大发射波长：Em-Max
BD Introduction FCM Principles ✓ FCM Applications
Flow Cytometry Applications Flow Cytometry Applications
• 细胞结构
• • 细胞大小 • • 细胞颗粒度 • • 细胞表面积 • • 核浆比例
• • DNA含量与细 胞周 期
Flow Cytometry Principles
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种快速、准确、客观
的同时检测直线流动状态中单个细胞多项物理及生物学特性，加以分析定 量的技术。
检测速度快，分析样本量大在极短时间内可分析大量细胞，这
是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速 率进行测量。
Flow Cytometry Principles
了解目标抗原 1）细胞表面抗原 2）细胞内或是核内抗原（固定、透膜步骤） 3）以上两者兼备。先标记表面抗原，固定后，破膜 标记胞内抗原。 4）细胞内细胞因子的测定。使用细胞内蛋白分泌抑 制剂，如monensin、BFA，使得细胞因子不能分泌 到细胞外。（活化、固定、透膜）
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、 用BD CBA技 术 同 时 检 测 分泌到胞外的多种细胞因子
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细胞周期 & 倍体分析
M G2
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Journal of Molecular Signaling 2011, 6:13
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Flow Cytometry Principles
Laser
侧向角散射光（SSC）
FALS Sensor
90LS Sensor
与激光束垂直的称为侧向角散射光信号（SSC）。SSC一般表 征细胞粒度及细胞内相对复杂性。
Flow Cytometry Principles
散射光信号，散点图 (Dot Plot)
流式细胞术检测免疫细胞表面标记
实验目的
1 了解BD FACS Verse的流式细胞术 2 学习并掌握FCM 的原理 3了解FCM 的运用 4 简单运用FCM检测免疫细胞特性
✓ Introduction FCM Principles FCM Applications
Introduction
BD是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于
了解荧光染料及其工作原理，做出准确的选择。 1）小分子化合物：FITC, Pacific Blue 2）大分子荧光蛋白： PerCP, PE, APC 3）串联染料：PE-Cy5, PerCP-Cy5.5
BD Fluorescence Spectrum Viewer A Multicolor Tool
—PE渗漏到FITC通道的信号 FL1-x%FL2 —FITC渗漏到PE通道的信号 FL2-x%FL1
Flow Cytometry Principles
在双色染色的实验中 （1）先用阴性管调电压 阴性管：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE （2）再用单染管调补偿 单染管：细胞+抗体A FITC or 抗体B PE
• RNA含量 • • 蛋白质含量 • • ……
细胞功能
• 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 • 细胞活性 • 细胞内/外的细胞因子 • 激素结合位点、细胞受体 • 蛋白磷酸化 • pH值 • 钙离子浓度 • 细胞膜电位、线粒体膜电位 • ……
用 BrdU. Annexin V 和其他方法检测 增殖和凋亡
1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。
Maxwell W. Becton
Fairlegh S. Dickinson
经过一百多年的发展，BD已成为世界上最大的医疗技术及医
疗设备公司之一，它以领先的技术、卓越的产品质量和诚实可
信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛赞誉。
BD Introduction ✓ FCM Principles
Flow Cytometry Principles
某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比 照射光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧 光的物质称为荧光素
单参数荧光直方图
双参数荧光散点图
流式细胞术操作流程
样本收集及处理 制备单细胞悬液 免疫荧光染色
上机检测 数据分析
Flow Cytometry Principles
利用优化的缓冲液和抗体借 助 流式细胞仪检测转录因子 表达
用流式细胞仪分选细胞或 检测细胞表面蛋白表达
用 BD Phosflow 抗 体 检测关键蛋白的磷酸化水平
用 ELlSA或 ELISPOT方 法 检 测
分泌的细胞因子
..，.---\1 用 流 式 细 胞 仪 检 测 特 异 细 胞 胞内细胞因子表达
100
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4 5口
500
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600
650
700
750
800
850
900
W avelength(nm)
BD
Flow Cytometry Principles
荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠 正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一 个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号
可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织，
悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。
BD
Flow Cytometry Principles
前向角散射光（FSC）
Laser
FALS Sensor
当激光束通过聚集的细胞颗粒时，激光向各个方向散射。与激 光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。FSC一般表征 细胞相对大小及其表面积。
荧光素的激发和发射光谱
激发光谱（Excitation，Ex） - 是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的 光线，也称为吸收光谱。 - 我们一般标注的是吸收波峰，也就是最大吸收波长： Ex-Max
发射光谱（Emission，Em） - 是指荧光素发射的一定波长范围内的荧光。所有荧光 都是宽谱发射。 - 一般标注的是发射波峰，即最大发射波长：Em-Max
BD Introduction FCM Principles ✓ FCM Applications
Flow Cytometry Applications Flow Cytometry Applications
• 细胞结构
• • 细胞大小 • • 细胞颗粒度 • • 细胞表面积 • • 核浆比例
• • DNA含量与细 胞周 期