丙二醛(MDA)含量的测定
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植物生理学实验课件
丙二醛（MDA）含量的测定 丙二醛（MDA）
丙二醛是膜脂过氧化最重要的产 物之一。 物之一。植物在逆境下遭受伤害与活 性氧积累诱发的膜质过氧化作用密切 相关。 相关。
原理
植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性 植物在逆境下遭受伤害（或衰老） 氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关， 氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关， 膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、 膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过 氧化物、丙二醛、乙烷等。 氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛 （MDA：Malondialdehyde）是膜脂 ： ） 过氧化最重要的产物之一， 过氧化最重要的产物之一，因此可通过测 了解膜脂过氧化的程度， 定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测 了解膜脂过氧化的程度 定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。 定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。
计算结果
V MDA( mmol g FW) = 6.452×( D532 D600 ) 0.559×D450 × t V ×W s
-1
式中，Vt：提取液总体积（mL）； 式中， 提取液总体积（ ）； Vs：测定用提取液体积（ml）； 测定用提取液体积（ ）； FW：样品鲜重（g）。 ：样品鲜重（ ）。
2
硫代巴比妥酸
丙二醛
3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮 （三甲川）
仪器设备
1. 2. 3. 4. 5. 6. 分光光度计； 分光光度计； 研钵； 研钵； 剪刀； 剪刀； 恒温水浴； 恒温水浴； 试管： 试管：20 mL×4 × 离心机。 离心机。
试剂
1. 5 %三氯醋酸； 三氯醋酸； 三氯醋酸 2. 0.5 %硫代巴比妥酸（用5 %三氯醋酸 硫代巴比妥酸（ 硫代巴比妥酸 三氯醋酸 溶解定容）； 溶解定容）； 3. 0.05 mol L–1磷酸缓冲液， 磷酸缓冲液， 磷酸缓冲液 pH 7.8。 。
wk.baidu.com
原理
丙二醛在高温及酸性环境下可与2 丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸 TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5 （TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5-三甲基恶 唑2,4-二酮（三甲川），该物质在532 nm处有一 2,4-二酮（三甲川），该物质在532 nm处有一 ），该物质在 吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收 处有较小光吸收。 吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收。根据 nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量 的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。 其532 nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。 可溶性糖对此反应有干扰， nm处有一 醛、可溶性糖对此反应有干扰，在450 nm处有一 吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。 吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。
注意事项
1．可溶性糖与TBA显色反应的产物在 ．可溶性糖与 显色反应的产物在532 nm 显色反应的产物在 也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于 ），当植物处于 也有吸收（最大吸收在 ）， 干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高， 干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高， 必要时要排除可溶性糖的干扰。 必要时要排除可溶性糖的干扰。 2．低浓度的铁离子能增强 ．低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反 与 的显色反 应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3+（最终浓度为 （最终浓度为0.5 nmol L-1） 3．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间， ．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间， 最好使用低温离心机离心。 最好使用低温离心机离心。
材料
正常生长的以及经逆境处理的小麦、玉米 正常生长的以及经逆境处理的小麦、 或其他植物的叶片。 或其他植物的叶片。
方法与步骤
1．取小麦植株上不同叶位的叶片3~5片，洗净擦干，剪成 ．取小麦植株上不同叶位的叶片 片 洗净擦干， 0.5 cm长的小段，混匀。 长的小段， 长的小段 混匀。 2．称取叶片切段 ．称取叶片切段0.3 g，放入冰浴的研钵中，加入少许石 ，放入冰浴的研钵中， 英砂和2 磷酸缓冲液， 英砂和 mL 0.05 mol L-1磷酸缓冲液，研磨成匀浆。 磷酸缓冲液 研磨成匀浆。 将匀浆转移到试管中，再用3 将匀浆转移到试管中，再用 mL 0.05 mol L-1磷酸 磷酸 缓冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液。 缓冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液。 3．在提取液中加入 mL 0.5 %硫代巴比妥酸溶液，摇匀。 硫代巴比妥酸溶液， ．在提取液中加入5 硫代巴比妥酸溶液 摇匀。 4．将试管放入沸水浴中煮沸 ，（自试管内溶液中 ．将试管放入沸水浴中煮沸10 min，（自试管内溶液中 ，（ 出现小气泡开始计时）。到时间后， ）。到时间后 出现小气泡开始计时）。到时间后，立即将试管取出并放 入冷水浴中。 入冷水浴中。 5．待试管内溶液冷却后，3000×g离心 离心15 min，取上清 ．待试管内溶液冷却后， × 离心 ， 液并量其体积。以0.5 %硫代巴比妥酸溶液为空白测 液并量其体积。 硫代巴比妥酸溶液为空白测 532 nm、600 nm和450 nm处的消光值。 处的消光值。 、 和 处的消光值
思考题
不同植物在同一逆境下，丙二醛含量变化 不同植物在同一逆境下， 不同，说明了什么？ 不同，说明了什么？
丙二醛（MDA）含量的测定 丙二醛（MDA）
丙二醛是膜脂过氧化最重要的产 物之一。 物之一。植物在逆境下遭受伤害与活 性氧积累诱发的膜质过氧化作用密切 相关。 相关。
原理
植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性 植物在逆境下遭受伤害（或衰老） 氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关， 氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关， 膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、 膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过 氧化物、丙二醛、乙烷等。 氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛 （MDA：Malondialdehyde）是膜脂 ： ） 过氧化最重要的产物之一， 过氧化最重要的产物之一，因此可通过测 了解膜脂过氧化的程度， 定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测 了解膜脂过氧化的程度 定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。 定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。
计算结果
V MDA( mmol g FW) = 6.452×( D532 D600 ) 0.559×D450 × t V ×W s
-1
式中，Vt：提取液总体积（mL）； 式中， 提取液总体积（ ）； Vs：测定用提取液体积（ml）； 测定用提取液体积（ ）； FW：样品鲜重（g）。 ：样品鲜重（ ）。
2
硫代巴比妥酸
丙二醛
3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮 （三甲川）
仪器设备
1. 2. 3. 4. 5. 6. 分光光度计； 分光光度计； 研钵； 研钵； 剪刀； 剪刀； 恒温水浴； 恒温水浴； 试管： 试管：20 mL×4 × 离心机。 离心机。
试剂
1. 5 %三氯醋酸； 三氯醋酸； 三氯醋酸 2. 0.5 %硫代巴比妥酸（用5 %三氯醋酸 硫代巴比妥酸（ 硫代巴比妥酸 三氯醋酸 溶解定容）； 溶解定容）； 3. 0.05 mol L–1磷酸缓冲液， 磷酸缓冲液， 磷酸缓冲液 pH 7.8。 。
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原理
丙二醛在高温及酸性环境下可与2 丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸 TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5 （TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5-三甲基恶 唑2,4-二酮（三甲川），该物质在532 nm处有一 2,4-二酮（三甲川），该物质在532 nm处有一 ），该物质在 吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收 处有较小光吸收。 吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收。根据 nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量 的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。 其532 nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。 可溶性糖对此反应有干扰， nm处有一 醛、可溶性糖对此反应有干扰，在450 nm处有一 吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。 吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。
注意事项
1．可溶性糖与TBA显色反应的产物在 ．可溶性糖与 显色反应的产物在532 nm 显色反应的产物在 也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于 ），当植物处于 也有吸收（最大吸收在 ）， 干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高， 干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高， 必要时要排除可溶性糖的干扰。 必要时要排除可溶性糖的干扰。 2．低浓度的铁离子能增强 ．低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反 与 的显色反 应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3+（最终浓度为 （最终浓度为0.5 nmol L-1） 3．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间， ．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间， 最好使用低温离心机离心。 最好使用低温离心机离心。
材料
正常生长的以及经逆境处理的小麦、玉米 正常生长的以及经逆境处理的小麦、 或其他植物的叶片。 或其他植物的叶片。
方法与步骤
1．取小麦植株上不同叶位的叶片3~5片，洗净擦干，剪成 ．取小麦植株上不同叶位的叶片 片 洗净擦干， 0.5 cm长的小段，混匀。 长的小段， 长的小段 混匀。 2．称取叶片切段 ．称取叶片切段0.3 g，放入冰浴的研钵中，加入少许石 ，放入冰浴的研钵中， 英砂和2 磷酸缓冲液， 英砂和 mL 0.05 mol L-1磷酸缓冲液，研磨成匀浆。 磷酸缓冲液 研磨成匀浆。 将匀浆转移到试管中，再用3 将匀浆转移到试管中，再用 mL 0.05 mol L-1磷酸 磷酸 缓冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液。 缓冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液。 3．在提取液中加入 mL 0.5 %硫代巴比妥酸溶液，摇匀。 硫代巴比妥酸溶液， ．在提取液中加入5 硫代巴比妥酸溶液 摇匀。 4．将试管放入沸水浴中煮沸 ，（自试管内溶液中 ．将试管放入沸水浴中煮沸10 min，（自试管内溶液中 ，（ 出现小气泡开始计时）。到时间后， ）。到时间后 出现小气泡开始计时）。到时间后，立即将试管取出并放 入冷水浴中。 入冷水浴中。 5．待试管内溶液冷却后，3000×g离心 离心15 min，取上清 ．待试管内溶液冷却后， × 离心 ， 液并量其体积。以0.5 %硫代巴比妥酸溶液为空白测 液并量其体积。 硫代巴比妥酸溶液为空白测 532 nm、600 nm和450 nm处的消光值。 处的消光值。 、 和 处的消光值
思考题
不同植物在同一逆境下，丙二醛含量变化 不同植物在同一逆境下， 不同，说明了什么？ 不同，说明了什么？