大肠杆菌的检测：大肠菌群测定的操作细则(中英文对照版)

大肠杆菌的检测:大肠菌群测定的操作细则

大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染

肠道致病菌的可能。

食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。

1 设备和材料

1.1 温箱:36±1℃。 1.2 冰箱:0~4℃。 1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。

1.9 吸管。 1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。

1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。

1.14 试管架。

2 培养基和试剂

2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。

2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。

2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。

2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。

2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中

3.22规定。

2.6 生理盐水。

2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。

3.1 检样稀释

3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。

3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。

3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支

1mL灭菌吸管。

3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。

3.2 乳糖发酵试验

将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置

36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。

3.3 分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。

3.4 证实试验

在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置

36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。

3.5 报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。

4 粪大肠菌群(faecal coliform)

4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置

44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。4.2 结果报告

根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值

乳酸菌的检测:

一概述

乳酸菌是指一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸,需氧和兼性厌氧,多数无动力,过氧化氢酶阴性,革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。这类细菌在自然界分布广泛,可栖居在人和各种动物的口腔、肠道等器官内,在土壤、食品、饲料、水及一些临床标本中都有乳酸菌的存在。乳酸菌在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的领域应用价值很高,相当多的乳酸菌对人、畜的健康起着有益的作用,但个别菌种能对人畜致病,乳酸菌主要包括23个属的细菌。

二样本采集

检样主要为含乳酸菌活菌的饮料和微生态制剂,样本应放入冰箱保存,心快检验。

三检验方法(中华人民共和国国家标准乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验GB/T 16347-1996)

乳酸菌菌总数的测定:乳酸菌菌落总数是指标样在一定条件下培养后,所得

1ml检样中所含乳酸菌菌落的总数。

(一)检验程序

乳酸菌菌落总数检验程序如下:

(二)培养基和试剂

改良TJA培养基(改良番茄汁琼脂培养基);改良MC培养基(modified Chalmers 培养基);0.1%亚甲蓝牛乳培养基;6.5%氯化钠肉汤参照;pH9.6葡萄糖肉汤;40%胆汁肉汤;淀粉水解培养基;精氨酸水解培养基;乳酸杆菌糖发酵管;七叶苷培养基;革兰氏染色液;3%过氧化氢溶液;蛋白胨水、靛基质试剂;明胶培养基;硝酸盐培养基、硝酸盐试剂;生理盐水:定量分装于三角瓶和试管内灭菌。

(三)操作步骤

1.以无菌操作将经过充分摇匀的检样25ml(或25g)放入含有225ml灭菌生理盐水的来菌广口瓶内做成1:10的均匀稀释液。

2.用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1m,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)。

3.另取1ml灭菌吸管,按上述操作顺序,作10倍增稀释液,如此每递增一次,即换用1支1ml灭菌吸管。

4.选择2~3个以上适宜稀释度,分别在作10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度作两个平皿。

5.稀释液移入平皿后,应及时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基(改良TJA或改良MC)注入平皿约15ml,并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1ml稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照,以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成。

6.待琼脂凝固后,翻转平板,置36℃±1℃温箱内培养72h±3h取出,观察乳酸菌菌特征,选取菌落数在30~300之间的平板进行计数。计算后,随机挑取5个菌落数进行革兰氏染色,显微镜检查并做过氧氢酶试验。革兰氏阳性,过氧化氢酶阴性,无芽胞的球菌

或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出皿内的乳酸菌数,然后乘其稀释倍数即得每亳升样品中乳酸菌数。例如,检样10-4的稀释液在改良TJA琼脂平板上,生成的可疑菌落为35个,取5个鉴定,证实的乳酸菌的4个,则1ml检样中乳酸菌数为:

35×4/5×104=2.8×105