第十五章混合斑检验

多个Y-STR基因座上出现2条以上的带，可以认 为是混合斑。
第三节 多个体血液混合斑鉴定
ABO血型测定：
测定血痕的ABO凝集原和凝集素，当凝集 原和凝集素矛盾时，可判断血痕为多人血混合
血清型与酶型测定：
发现有3个或3个以上等位基因能确证为多 人血混合。
ABO血型测定（筛查）
DNA多态性检验
（一）混合斑的确定： 某一个基因座发现3个或3个以上等位基因 （要排除正常基因分型的异常图谱），可以确认为 混合斑。 （二）混合斑的个人识别
第十五章
混合斑检验
第一节
概述
混合斑 是指两名或两名以上个体的体液、分
泌液混合形成的斑痕。可以分成两大类：
由不同个体的同一种体液，分泌液混合而成，
最常见为混合血痕。
由不同个体的不同体液，分泌液混合而成，
最常见为精液与阴道分泌液组成的混合斑。
受混合成分种类、混合个体数、以及不同个 体来源的成分所占比例等因素的影响，检测 结果分析较单一斑痕要复杂。
实际操作前，应进行涂片检查，根据精子和阴道上皮 细胞的比例，对消化时间、温度、试剂的浓度等进行适当的调整 提取方法选择----采用有机溶剂的方法比较好。 酚-氯仿能够去掉混合斑中的精浆蛋白，阴道分泌液、细菌 污染严重的的,用有机溶剂提取后,用5%clekex100提1次。
Y染色体DNA分析：
1 男性特有，Y-STR检测不受女性成分的干扰，不需 分离精液成分和阴道液成分，两者比例为1/100--2000时 仍可正确检出精子DNA，避免了两步消化过程，及操作过 程中精子DNA的损失，提高了检出阳性率。 2 精子细胞比体细胞更稳定，保存25年的阴道式子YSTR获得成功 3 轮奸案----可以推测犯罪嫌疑人的数目。
由于从阴道分泌液中未能有效检测出ORMl、GC 和γ－GGT型，而DIA3为精子所特有，故检测这些 遗传标记是混合斑中精液个人识别的有效手段之 一。
（三）DNA分析
常染色体分析：
关键---获得纯净的精子DNA-----差异裂解或二步抽提法
原理：精子细胞的表面蛋白含有大量的二硫键，可以抵抗去垢剂 SDS核蛋白酶K的消化，而其他组织的细胞膜则可以被这两种物质消化。 方 法 ： 第 一 步 ： 检 材 + 1 % SDS+100ug/ml 蛋 白 酶 K---37 度 2 ~ 3 h 500r/min离心15min、去上清，精子留在沉淀物中。 第二步：+40Mm/L DTT+1%SDS+100ug/ml蛋白酶K---注意：消化条件选择----主要是第一步消化时间 消化不完全----当阴道上皮细胞过多，不能使两者彻底分离 过渡消化----可能消化一部分精子细胞，导致精子DNA减少
检测出来，然后与案件相关的个体进行比对分 析。
现代方法----分离混合斑中成分，分别进行遗传标
记的检测。例如采用差异裂解细胞的办法分离混 合精斑中的精子和阴道上皮细胞，然后再分别分 型鉴定。
主要采用DNA分型技术检测方法：
检验程序：确证检材是否是混合斑------然后检测遗 传标记，进行个人识别。
第二节 精液与阴道液混合斑
混合斑的确证:检测精液成分及阴道成分确定
(一)精斑的确证：利用精斑的确证试验
细胞学方法-----精子的检出 免疫学方法-----精斑确证最好试剂----抗P30血清 生化学方法-----LDH-X
(二)阴道液的确证：
细胞学检查 ：阴道上皮细胞（复层鳞状上皮细胞） HE染色：大而扁平、形态不规则、胞浆红染 嗜碘试验：斑痕沉淀涂片，干燥后+2滴Lugo’s碘液 ---2~3min镜检呈红褐色或深黄褐色， （口腔上皮细胞不染色） 阴道肽酶测定：（VP） 是一种催化肽键水解的酶 仅存在女性生殖道分泌液中，与年龄、性活动、 月经周期无关。 方法：淀粉凝胶电泳 L-缬氨酸-L-亮氨酸 注意：阳性检出率只有64%，故阴性结果不能否 定阴道液存在。检出期限为7个月。

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Amelogenin基因座：可判定检材的性别。 Y峰出现说明检材含有男性成分，X和Y峰面积 信息可用于判断是否混合斑，X峰面积明显大于 Y峰，可以认为是男女混合血痕。 Y-STR基因座分析：能证明混合斑有男性成 分，还能确定混合斑中男性个体数。 在做混合斑的个人识别时，应将性别位 点，Y-STR与常染色体STR结合应用。
混合斑常出现在下列情况：
性犯罪案件检材 阴道拭子、床单、嫌疑人外生殖器拭
子等
多人受伤的现场 凶器、当事人身上或衣物上的血痕
咬痕拭子 含有咬者的口腔上皮细胞和被咬者的皮肤细
胞
指甲垢 可能含有本人和被抓者的细胞 血衣 有另一个人的汗液、唾液或尿液等
鉴定方法：
经典方法----将混合斑痕中所有的遗传标记都


混合斑中精液成分的个人识别

应取受害人和犯罪嫌疑人的血液、唾液检材做参比样本 已婚的被害人，须提取其丈夫的血样和唾液样同时检测 传统的血型标记在混合斑个体识别鉴定具有实用价值，主 要有两类方法： 一类是对比推断法：简单易行，信息量有限 另一类是检测精液与阴道液的特有遗传标记成分





目前广泛采用STR基因座分型技术：信息量大，常规技术


测α 2－精浆糖蛋白分子中的ABH抗原
人类精浆水溶性ABH物质存在于α 2 精浆糖蛋白中。
α 2一SGP来源于精囊腺，抗- SGP血清是用纯化后 的α 2－SGP，免疫动物获得，抗血清含有两类抗体：
一类为抗糖侧链抗体，能与A、B、H等血型物质发生反 应； 另一类为抗-α 2 －SGP蛋白抗体，能与α 2 －SGP发生反 应。

被害人没有的血型物质可以认为是来自精斑 分泌型和非分泌型个体的体液中血型物质的含量无绝对 的界线 ，凝集抑制的级数反映分泌型的强弱。 所有的分泌型个体的体液中都可以检测出H物质，只是 O型分泌型的H物质含量最高，而A型、B型和AB型个体的A 和B物质含量明显高于H。 例：A型物质仅抑制2级。案件的被害人为A型，则提 示混合斑的H物质是来自精斑。 能否检测出混合斑各个体的血型物质，还受混合比例等 影响因素。在检测中注意多处取材，分析所有的检测结果， 才有可能准确推定精液的血型。

常染色体基因座分析：
STR分型，确定混合斑具有的等位基因再进行鉴定：
a.确定混合血样中可能的个体数； b.确定混合型DNA图谱中个体组分的近似比例； c.推断混合型DNA样品基因型组合并与受害人或嫌 疑人基因型比对
Y X＋XX
STR基因座
嫌疑人
混合斑
被害人
DNA多态性检验
（二）混合斑的个人识别
混合斑中阴道液成分的个人识别
检案中很少用
ABO血型 同精斑的ABO血型检测 酶、血清型 PGM1、Gm、Km、GLOI DNA分 析 DNA提取-----二步抽提法的第一次消 化后离心的上清液 遗传标记------进行常染色体STR分析
轮奸案混合斑检材的鉴定
无法分离不同个体的精子。分型结果是多个男性 个体的混合图谱，对确定犯罪嫌疑人有困难，例 如常染色体STR分型会出现3条或3条以上的等位基 因条带，混合分型图谱对确定犯罪嫌疑人有一定 的困难。 注意提取多处检材或一份检材不同部位的斑痕， 分别进行DNA提取和扩增，尽可能找出来自单个个 体的精斑，以最后确定各犯罪嫌疑人的基因型。
（
脱落上皮细胞HE染色图
混合斑中精液成分的个人识别


精液和阴道液都是人体分泌液，均存在可溶性 ABH血型物质和部分血清型和酶型蛋白，可供分 型检测。 从精子细胞和阴道上皮细胞提取DNA，可以获得 DNA多态性信息。 从混合斑测出的遗传标记型别是精液与阴道液遗传 标记的总和。 经过与参比检材的对照，其中除被害人以外的遗传 标记可以认为是来源于犯罪嫌疑人。
用A、B、O型压积红细胞和AB型人血清吸收粗制抗 血清后，抗－α 2－SGP血清中的抗糖侧链抗体被吸 收除去，仅留抗－α 2－SGP蛋白抗体。 共同抗原，交叉反应：不宜用于精液与唾液或精 液与乳汁混合斑的 ABO血型测定。
（二）血清型、酶型测定: 对比推断法
精液可检测GC、Gm、Km和ORMl等血清型和PGMl、 DIA3、Fu、γ一GGT等酶型。 阴道液中能检测Gm、Km、PGMl和Fu。所以可用 对比推断法检测混合斑中精液的Gm型、Km型、 PGMl型和Fu型进行个人识别。
（一）ABO血型测定
对比推断 中和试验、解离试验、ELISA法等 对照种类：嫌疑人、被害人及被害人丈夫的血液和唾液 中和试验 用中和试验测定混合斑和受害人唾液的ABH物质及分泌 状态，进行对比分析，可推测混合斑中精液的ABO血型。
若混合斑中精液血型与犯罪嫌疑人血型不同，则可否定犯
罪嫌疑人；如相同，则不能否定。若受害者为非分泌型， 则很容易从混合斑中判断犯罪嫌疑人的血型。