4.免疫电镜细胞化学技术

铁蛋白标记抗体是由Singer（1959）首创的一种
免疫细胞化学技术。这技术曾广泛应用于病毒和细胞 表面抗原的检测。铁蛋白作为电镜观察的标记物，具 有颗粒大、分辨率高、散射力强的特点，可用于细胞 膜表面抗原的准确定位。所以，虽然40年后的今天已 发展了多种免疫电镜细胞化学技术，但铁蛋白标记法 仍然是一种基本技术。
优点：
①胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的
生物活性不发生明显的变化。
②金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒
清晰可辨，易精确定位。
③不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于 扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。 ④胶体金标记物易于制备，而且可以根据需要制备不同 大小的胶体金，因此可以进行免疫电镜的双重标记。 ⑤根据抗原抗体反应部分结合金颗粒数量的多少，可进 行粗略的免疫细胞化学定量研究。
（2）电镜包埋前免疫金染色
① 新鲜组织经适当固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲 醛固定0.5～1h），制成厚切片。 ② 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗3次，每次 15min。 ③ 0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，灭活自由醛基。 ④ TBS漂洗，5min×3次， ⑤ 1%牛血清孵育组织块30min。
3）样品与染液的均匀分散度为促进样品与染料的均匀
分散提高染色效果，可以采用某些分散剂 4）悬液与染液的酸碱度 一般以中性或略偏酸性（PH 6.4－7）为宜。 5）染色时机的把握 吸去过多样品悬液后尽快滴加负染色液
1、标本－染液混合染色法：
病毒悬液和2％的磷钨酸染液等量混合
用毛细管滴到有膜的载网上（吸去过多的病毒－
（3）电镜包埋后免疫金染色法 ①超薄切片50～70nm，置于镍网或金网中。
②1% H2O2蚀刻，使试剂能穿透标本。
EPON包埋的组织蚀刻时间约10min，而
LRWhite、LR Gold包埋的组织蚀刻时间则
常小于5min.
③ 双蒸水漂洗3次，每次10min。 ④ 1%牛血清孵育切片15min。 ⑤ 载网不冲洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室温孵育1～2h或
免疫电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术是电镜技术与细胞化学技术相结合 产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。 目的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞 超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核 酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物 质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与 功能的相互关系。
（1）胶体金的制备
①柠檬酸三钠还原法（15nm） ②鞣酸-柠檬酸钠还原法（6nm）
檬酸三钠的用量与胶体金直径的关系
0.01%氯化金 （ml) 100 100 100 100 100 100 1%柠檬酸三钠 （ml） 3.0 4.0 6.0 1.5 1.0 0.6 胶体金颗粒直径 （nm） 19.0 15.0 12.5 24.5 41.0 71.5
4℃18～24h。
⑥ TBS漂洗，3min×3次。 ⑦ 室温下适当稀释度的胶体金标记探针（二抗胶体金探针或蛋白A胶体金探
针等）孵育30～60min。
⑧ TBS漂洗，3min×3次，后在用双蒸水漂洗切片。 ⑨ 醋酸铀和硝酸铅轻微染色后电镜观察。
2.电镜免疫金染色 用于电镜的免疫金法可以采用包埋前染色和包埋后 染色，可根据抗原的性质加以选择。 染色方法也有直接法和间接法。
对抗原性破坏较小。（2）可在定位后再进行超薄切片，提高阳性检
出率.（3）免疫染色后，用四氧化锇后固定，有利于膜型结构的保 存。
包埋后染色：是指在超薄切片上进行免疫染色。
优点：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫试剂分子穿透障碍，不 需要穿透剂。
2.免疫染色 ① 直接法：用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，
走。
3）用刀片将琼脂块的边缘切除（为便于剥离）轻轻将载有琼脂块的载玻片浸入 PTA或醋酸铀溶液中，并把Formvar膜剥离和漂浮到染液水面上。
4）将铜网放到剥离到水面上的 Formvar膜上。
5）用不锈钢小柱把铜网膜同Formvar膜一起打捞出来，即可进行电镜观察。
4、病毒颗粒免疫电镜技术：
病毒颗粒与其外周相伴随的结构成分杂质或人工损伤产物混淆不清。 特别是肠道病毒与粪便中成分难以分辨。 这种情况需要借助特异性的抗血清（抗体），把病毒颗粒包被、凝
鞣酸-柠檬酸钠还原法制备不同大小胶体颗粒的配方1%柠檬酸三钠 1%鞣酸 0.025 mol/L K2CO3 去离子双蒸水 胶体金颗粒直 径 （ml) （ml） （ml） （ml） （nm）
15 10 6.0 3.5
4
4 4 4
0.02
0.1 0.5 3
0
0 0.5 3
19.98
19.90 15.00 14.00
免疫电镜技术
免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的 产物，根据抗原抗体的高度特异性结合原理，用高电 子密度的标记物（如：金、铁蛋白等）在超微结构水 平上检测某些抗原性物质的定位、定性、半定量的一 种方法。
目前免疫电镜技术主要包括酶免疫电镜技术，免疫铁蛋白技术和免疫胶
体金技术，此外还有抗体杂交技术、凝集素电镜标记技术和铁蛋白-抗 铁蛋白电镜复合物技术。 用以标记抗体的酶要具备以下条件： 1.与抗体（或抗原）结合后，仍能保持酶和抗体（或抗原）的生物活性。 2.酶的纯度高、特异性强、稳定、可溶性好、敏感、廉价。 3.在体液或组织中不存在该酶的底物。 酶标技术中最常用的标记酶是辣根过氧化物酶（HRP）
(5)染色结果判断 假阳性染色和假阴性染色 可以通过调整固定液种类、浓度、固定时间，改变 一抗和二抗胶体金探针浓度、孵育时间、温度等减 少假阳性和假阴性染色。
双标记菌毛上两种抗原，胶体金5nm, 20nm
图7-11 血小板表面胶体金标记GPIb单抗 ×9000
铁蛋白标记电镜免疫细胞化学技术
电镜免疫细胞化学技术的标本处理原则
1、取材与固定
取材原则与常规电镜取材相同，力求保持组织新鲜，标本固定要求 是既要保持组织成分的抗原性，又要保存细胞的超微结构。低浓度的
甲醛短时固定队抗原性保存好，但是超微结构保存又受影响。
（1）2%多聚甲醛液 （2）2%多聚甲醛-0.01%～0.05%戊二醛 （3）4%多聚甲醛-0.5%苦味酸-0.5%戊二醛
染液混合物），待干后进行电镜观察。
一般认为病毒浓度在105以上时不难发现病毒。
2、琼脂扩散技术：
检测的材料中病毒含量不足时，为了达到浓缩病毒 的目的，并去除材料中所含盐分，可采用琼脂扩散法。 用0.8%琼脂铺好的琼脂块，把含病毒的悬液滴到琼 脂块上，然后把载网倒悬在这滴悬液上。琼脂块把水分吸 收，浓缩的病毒沾附在载网上，再经过负染色后进行电镜 观察。
基本原理： 铁蛋白是一种直径10～12nm的球形的蛋白质（分 子量450kD）,它含有致密的铁胶粒核心（直径约 7.5nm），该核心含2000～5000个铁原子，分布于四
个区域，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，
因此可用于电镜观察。抗体与铁蛋白通过低分子量的
偶联剂形成抗体-铁蛋白复合物，此复合物既保留抗体
尔后进行酶与底物反应，终产物沉淀在抗原抗体反应部位。 ② 间接法：依次使用两种不同抗体，先使用未标记的特异性 抗体即第一抗体，后者与标本中的抗原反应。然后使用过 氧化物酶标记第二抗体，最后酶与底物反应，生产沉淀。
结果判定 在已知阳性、阴性样品成立的前提下，出现高 电子密度的颗粒，即指示抗原抗体的存在。
（二）胶体金免疫电镜技术
利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，使其
与抗体相互吸引从而将抗体标记。再以金标记的抗体
与待检抗原相互结合，由于金颗粒的电子密度高，电
镜观察到金颗粒的位置，即抗原所在。
2、胶体金的特性 ①颜色：胶体金的颜色与金粒子的直径有关，5-60nm时 为红色，95nm是为蓝色，用于免疫细胞化学的胶体金 呈红葡萄酒色。 ②影响胶体金稳定的因素： a.电解质：少量有促进稳定的作用，过量则破坏。 b.胶体金的浓度：浓度越高容易导致胶体金凝集。 c.温度：长时间加热可使稳定性有所下降。
根据抗体凝聚的病毒颗粒的多少和程度以（+）
表示。
如果检查不到抗体包被的病毒颗粒，可离心，将
沉淀重悬浮于1-2滴蒸馏水中，再用同样方法滴
膜、负染。
利用免疫电镜技术发现和鉴定了许多重要的病毒。
2．通过冰冻切片或震动切片获得厚切片。 冰冻切片 8µm ，震动切片20～80µm。 3．漂洗后的厚切片可按免疫组化步骤进行标记染色。
4．DAB显色后再进行锇酸后固定以及电镜包埋切片处理。 5. 如果确定待测抗原的抗原性不会由于脱水包埋引起失活 的前提下可在包埋切片后做标记染色。
三、免疫染色 包埋前染色：是指在未经包埋的预切厚片上先进行免疫染色，然后 再进行脱水包埋超薄切片。 优点：（1）切片染色前未经四氧化锇固定、脱水、包埋等处理，
⑥ 第一抗体4℃孵育过夜后室温继续放置2h。 ⑦ TBS漂洗，5min×3次， ⑧ 室温下适当稀释度的胶体金标记探针（二抗胶体金探 针或蛋白A胶体金探针等）孵育60min。 ⑨ TBS漂洗，3min×3次，后再用双蒸水漂洗切片。 ⑩ 2%戊二醛-2多聚甲醛固定1h，1%锇酸固定30～ 60min，常规脱水，包埋，切片染色后电镜观察。
的免疫活性，同时因为铁蛋白含有高电子密度的铁胶 粒核心，便于电镜观察。
病毒免疫电镜技术
5. 影响因素：
1）样品的纯度：
负染色样品纯度要求不是很高，最好进行适当纯化；样品杂 质太多，如大量的细胞碎片、培养基残渣、糖类、各种盐类 结晶均会干扰染色效果及电镜观察。
2）样品的浓度：
被检查的样品要有适当的浓度。太浓 太稀均影响电镜观察。
3、假复型技术：