植物生物技术:第6章 原生质体培养

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不被染色,死亡的被染上色。 • 2)双醋酸盐荧光素(FDA)染色法:在荧光显
微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。
第2节、原生质体分离及纯化
四、影响原生质体分离的因素
➢ 从理论上讲,只要用适当的酶处理,就能从任何活组织中分离得到原生质 体
➢ 但对于原生质体培养来说,要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、 最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响
➢ 多数情况下,甘露醇是常用的渗透剂,可能是由于它的钝性及扩散 入原生质体的速度很慢的缘故,来保证一个稳定的渗透压
第2节、原生质体分离及纯化
➢ 叶肉细胞是常用的材料, 叶片很易获得而且能充分供应。取材时,一般用刚展 开的幼嫩叶片
➢ 愈伤组织或悬浮细胞,避免植株生长环境的不良影响,可以常年供应,易于控 制新生细胞的年龄,处理时操作方便,无需消毒
A
B
C
第2节、原生质体分离及纯化
2、酶液及酶解方法
➢ 用来分离植物原生质体的酶制剂 ➢ 纤维素酶、半纤维素酶:降解构成细胞壁的纤维素 ➢ 果胶酶:降解连结细胞的中胶层,使细胞从组织中分开,以及细胞与细 胞分开 ➢ 酶解花粉母细胞和四分体小孢子时还要加入蜗牛酶 ➢ 离析酶(果胶酶)
➢ 纤维素酶浓度在1%-3%,果胶酶在0.1%-1%,但也有例外
第2节、原生质体分离及纯化
3.分离培养基
➢ 常用的配制分3 离渗原透生压质:体原酶生液质的体溶操 液作 以需 及要 洗涤在原一生定质渗体透的压溶存液在为下进行,
CPW液
分离原生质体酶液的溶液以及洗涤原生质体的溶液为 盐成分为:
➢ CPW盐成分为
(3)分离原生质体
方法有二:
两步分离法
一步分离法
第2节、原生质体分离及纯化
图示原生质体分离过程(以叶片为例)
过滤、离心
加果胶酶 和纤维素酶
第2节、原生质体分离及纯化
叶片
愈伤组织
第2节、原生质体分离及纯化
二、 原生质体纯化
离心沉淀法
方法三种 漂浮法
界面法
第2节、原生质体分离及纯化
1、 离心沉淀法
第2节、原生质体分离及纯化
2、漂浮法
➢ 原理:应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。 • 步骤: • 第一步:400目网筛过滤。 • 第二步:离心。 • 第三步:取上清液,洗涤液重悬,离心。2-3次。 • 第四步:收集溶液表面原生质体,用培养液洗1次。
第2节、原生质体分离及纯化
3 、 界面法
植物生物技术
第6章 原生质体培养
第6章 原生质体培养
本章主要内容
第一节 原生质体研究的发展和应用 第二节 原生质体的分离与纯化 第三节 原生质体培养及植株再生
第6章 原生质体培养
本章教学目的与要求
名词:原生质体 了解原生质体培养的应用 掌握原生质体分离的步骤 掌握原植物分离原生质体的经典材料----叶肉细胞。
愈伤组织或悬浮细胞。
第2节、原生质体分离及纯化
(二) 分离方法
机械分离法 酶法分离法
第2节、原生质体分离及纯化
1、机械分离法(Machanical isolation)
优点: (1)能排除酶的有害影响; 缺点: (1)原生质体的产量低; (2)方法繁琐费力; (3)局限性大
KH2PO4
27.2mg/L
KNO3
101.0mg/L
CaCl2.2H2O
1480.0mg/L
MgSO4.7H2O
246.0mg/L
KI
0.16mg/L
CuSO4.5H2O
0.025mg/L
pH 5.8
第2节、原生质体分离及纯化
➢ 根据渗透剂的浓度和成分可分为以下几种培养基: ➢CPW13M: CPW盐+13%甘露醇(mannitol) ➢CPW9M: CPW盐+9%甘露醇 ➢CPW21S: CPW盐+21%sucrose ➢CPW0M: CPW盐溶液。
• 原理:应用原生质体的比重大于溶液,离心后原生质体沉于底部。 • 步骤: • 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 • 第二步离心(500-1000r/min,离心5-6min)。 • 第三步吸取上清液,洗涤液重新悬浮,再离心沉淀,如此2-3次。 • 第四步用原生质体培养液洗1次,收集原生质体。
原生质体(Protoplast)
• 含义:去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
高尔基体
微丝 叶绿体 线粒体
质膜
液泡
细胞核 内质网 微管 细胞壁
第一节
第一节 原生质体研究的发展和应用
一、原生质体研究的发展
➢ 1892年,Klercker用机械法分离植物原生质体 ➢ 1960年,Cocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功 ➢ 1971年,Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株 ➢ 1986年,单个原生质体培养获得成功
第2节、原生质体分离及纯化
2、酶法分离(Enzymatic isolation)
(1)酶的种类
纤维素酶类:降解构成细胞壁的纤维素 果胶酶类:降解连接细胞的中胶层,分开细胞 半纤维素酶类 蜗牛酶:花粉母细胞和四分体小孢子
第2节、原生质体分离及纯化
(2)酶液的配制
酶的配比及浓度
渗透压稳定剂及pH
第2节、原生质体分离及纯化
原理:选两种不同渗透浓度的溶液,其中一种溶液密 度大于原生质体的密度,另一种溶液小于原生质体的 密度。
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
第2节、原生质体分离及纯化
三、原生质体活力测定
1、形态识别:形态上完整,呈圆形,含有饱 满的细胞质,颜色鲜艳的即为存活的原生质 体。
2、染色识别 • 1)0.1%酚番红或Evans蓝染色:有活力的
第一节
二、原生质体的应用
➢ 种质资源超低温保存 ➢ 原生质体融合,克服生殖障碍 ➢ 筛选突变体 ➢ 遗传转化 ➢ 基础研究:细胞壁的发生过程、膜的结构等的研究
研究案例
第2节、原生质体分离及纯化
第二节、原生质体分离、纯化
• 一、原生质体分离
双子叶外植体
胚性细胞
第2节、原生质体分离及纯化
(一)外植体来源
➢ 原生质体分离时主要应考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解 时间、温度等。
第2节、原生质体分离及纯化
1、基因型和外植体:
➢ 生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键, 并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生
➢ 用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、 茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物、原球茎、花瓣和叶表皮等
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