酶蛋白的结构

❖ 2) 丹磺酰氯法（DNS法） ❖ a) 原理：
❖ b）分离检测：DNS-Aa溶于乙酸乙酯，Aa不溶
❖ 标准Aa + DNS——反应——纸层——荧光显色 ❖ 未知DNS-Aa——纸层——荧光显色
❖ 比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有几 条肽链组成
❖ c）优点：灵敏度高；是前种方法的100倍；用量少， 样品量为0.1-2ng
❖ R基团对a-螺旋的影响：a) 构成a-螺旋要求R不 太大，不带电荷 b）几个相连的氨基酸的R带同 种电荷，不形成a-螺旋 c）R带电荷但间断，可 形成a-螺旋
❖ *φ= -57°，Ψ= -47°是形成a-螺旋的条件，不满 足此条件不能形成a-螺旋
❖ *Gly不参与a-螺旋，原因：Gly的a-C上连两个H， 故φ、Ψ无法确定
❖ 这种改变导致血红蛋白表面电荷减少，在脱氧状态下溶解度下 降，发生不正常聚集，形成镰刀状红细胞，严重时造成红细胞 破裂。血红蛋白分子共有574个氨基酸残基组成，仅仅两个β亚 基上各改变了一个氨基酸残基，生理功能就发生了如此大的变 化，可见蛋白质的一级结构对功能的影响之大。
❖ 牛胰核糖核酸酶复性实验
❖ 8个Cys－SH形成4个二硫键的组合方式有 7×5×3=105种，因而重新形成正确配对的概率仅 1/105，
第一节 蛋白质一级结构研究方法
❖ 1. 蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定 ❖ 2.确定蛋白质分子中多肽链的数目 ❖ 3. 拆分并分离蛋白质分子的多肽链 ❖ 4. 测定每条多肽链的氨基酸组成 ❖ 5. 多肽链的N-末端和C-末端分析 ❖ 6.多肽链的局部断裂和肽段的分离 ❖ 7. 测定各个肽段的氨基酸顺序 ❖ 8.确定肽段在多肽链中的次序从而排列出多肽链的氨基酸顺序 ❖ 9. 多肽链中二硫键位置的确定
❖ *Pro、Hyp不参与a-螺旋，原因：不形成φ角； 空间障碍不形成氢键
❖ φ= -119°，Ψ= +113°时，蛋白质分子成平行的 b-片层
❖ 到目前为止，已有10万种以上的蛋白质完成了 一级结构的测定，对于大多数常见蛋白质，通 过查阅数据库，可得到关于一级结构的资料。
第二节 蛋白质空间结构的研究方法
❖ 二级结构：a-螺旋（a-helix) ；b-片层(β-sheet) ； b-转角(β-turn) ；无规卷曲(random)
❖ 维持键：氢键、疏水键、范德华力、离子键、配 位键等
❖ 除了上述经典的蛋白质一级结构测定方法外， 由于核苷酸序列测定技术发展迅速，目前DNA 的核苷酸序列测定已完全实现自动化，而蛋白 质的氨基酸顺序是由DNA所决定的，人们通过 提纯指导蛋白质合成的mRNA，再将mRNA通 过逆转录作用得到cDNA，并扩增cDNA，然后 测定其核苷酸序列，根据三联体遗传密码规则 可确定出蛋白质的氨基酸顺序。
8.确定肽段在多肽链中的次序从而排列出 多肽链的氨基酸顺序
❖ 至此，已经得出了多肽链被断裂成的各个肽段的氨基 酸顺序，但由于没有这些肽段在多肽链中次序的信息， 还是无法排出整个多肽链的氨基酸顺序。为此，必须 用两种或者两种以上的方法来断裂多肽链，比如用两 种蛋白酶分别水解多肽链，将得到两套断裂位点不同 的肽段，分别确定这两套肽段的氨基酸顺序，然后利 用这两套肽段的氨基酸顺序彼此之间有交错重叠，可 以确定整条多肽链的氨基酸顺序。
第三章 酶蛋白的结构
❖ 蛋白质的一级结构（primary structure） ❖ 蛋白质的二级结构（secondary structure） ❖ 蛋白质的三级结构（tertiary structure） ❖ 蛋白质的四级结构（quaternary structure）
蛋白质结构和功能的关系
❖ 9. 多肽链中二硫键位置的确定
❖ 对于含有二硫键的蛋白质，我们在分析多肽链氨基酸顺序前先 将其拆开，然而在测定完多肽链氨基酸顺序后需要确定链内和 链间二硫键的位置，常用的方法是对角线电泳法。不拆开二硫 键直接用蛋白酶水解蛋白质，所得肽段样品点样到滤纸中央的 电泳原点，在第一个方向上进行电泳，则不同的肽段按其所带 电荷和分子大小分离。结束后将滤纸在过甲酸蒸气中熏，二硫 键被氧化和拆开。将滤纸旋转90°，在相同条件下进行第二个 方向上的电泳。这时，对于不含二硫键的肽段，由于没有发生 变化，电泳迁移率不变，电泳后位置应处于对角线上；而含有 二硫键的肽段，其大小和电荷发生了变化，电泳迁移率也要改 变，电泳后位置偏离对角线，将这些肽段提取出来，进行氨基 酸顺序分析，与已经测定的多肽链氨基酸顺序相比较，即可推 断出二硫键的位置。
坏5-10%，应予以校正 ❖ c） Asn → Asp Glu → Gln ❖ d） 胱氨酸→半胱氨酸 ❖ e） 大部分氨基酸不破坏
❖ 2）碱水解： ❖ 特点：a)Trp不破坏 b）大部分氨基酸破坏
❖ 分离检测：1）纸层；2）薄层；3）离交；4） 氨基酸自动分析仪
5. 多肽链的N-末端和C-末端分析
❖ 目的：有几条肽链；N、C末端是何氨基酸
❖ 测不出末端的几种原因：蛋白质分子为环肽；末端被 保护试剂保护；末端是Pro
❖ 5-1 N端测定（介绍原理、分离检测方法和优缺点） ❖ 1）FDNB法（Sanger法；2.4-二硝基氟苯法） ❖ a）原理：
❖ b) 分离检测：乙醚萃取，DNP-Aa溶于乙醚而 Aa不溶
❖ 第一套肽段： N-末端 ISR MTYAGK DALK CAFR EAL C-末端
❖ 第二套肽段： N-末端 ISRM TY AGKDAL KCAF REAL C-末端
❖ 推出完整肽链顺序：
ISRMTYAGKDALKCAFREAL
❖ 在上例中，两套肽段之间正好能够相互跨过切口而重 叠，从而能确定出肽段在多肽链中的位置，拼凑出整 条肽链的氨基酸顺序。
❖ Edman 降 解 法 的 原 理 是 利 用 前 述 苯 异 硫 氰 酸 酯 （PITC），又称Edman试剂与N-末端氨基酸残基的α氨基之间的特异性反应，每轮反应后N-末端氨基酸脱 落，并生成PTH-氨基酸。通过层析等方法鉴定PTH氨基酸的种类，就可以确定肽链中对应位置的氨基酸。 通过n轮反应，即可确定由肽段中N-末端起n个氨基酸 的顺序。
❖ 羧肽酶A：a）Lys、His、Arg在C-末端不能水解
❖ b）C-末端是Pro不能水解
❖ c）C-末端第二个是Pro，无论第一个是何氨基酸都不能水解
❖ 羧肽酶B：a）水解C-末端为Lys、His、Arg的
❖ b）C-末端第二个是Pro，无论第一个是何氨基酸都不能水解
❖ 6.多肽链的局部断裂和肽段的分离
❖ 举例：镰刀状细胞贫血病
❖ 镰刀状细胞贫血病是最早被认识的一种分子病，流行于非洲的 一些地区，患者的红细胞形态异常，有很多呈新月状或镰刀状， 在红细胞脱氧时镰刀状细胞数量增加，严重时导致红细胞破裂、 溶血而致命。
❖ 镰刀状红细胞产生的原因是患者的血红蛋白异常。血红蛋白是 红细胞内起携带氧气功能的一种重要的蛋白质，是一种四聚体 蛋包含白1质41，个由氨两基个酸α残亚基基，和β两亚个基β包亚含基1组46成个（氨α基2β酸2）残，基其。中镰α亚刀基状 细胞贫血病患者由于基因突变，其血红蛋白（HbS）的β亚基 N-末端第6号位的氨基酸由原来正常血红蛋白（HbA）的高度 极性的Glu变成了非极性的Val
4. 测定每条多肽链的氨基酸组成
❖ 蛋白质完全水解：要求完全水解且不破坏氨基酸 ❖ 1）酸水解：
❖
❖ 作水解程度时间图确定最佳时间 ❖ 1-10mg蛋白样品 → 加HCl → 抽真空 → 封闭 → 烘箱 ❖ 特点：a）Trp完全破坏，生成不溶性物质 ❖ b） Ser、Thr、Tyr部分破坏，Ser破坏10-15%，Thr、Tyr破
❖ 1. 蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定 ❖ 电泳单一带 ❖ SDS-PAGE测分子量（质谱法）
❖ 2.确定蛋白质分子中多肽链的数目 ❖ 末端分析法
3. 拆分并分离蛋白质分子的多肽链 ❖ 氧化法 ❖ 氧化法的优点在于二硫键一旦拆开，
不会重新形成连接，但在氧化过程中 伴随着一些副反应，Met侧链被氧化 生成亚砜，Trp侧链被破坏。 ❖ 还原法 ❖ 为了防止游离巯基重新氧化，还需加 入烷化剂如碘乙酸，使巯基上发生取 代反应而不会重新被氧化
1．溴化氰裂解法： ❖ BrC≡N：专一水解Met羧基形成的键 ❖ 优点：专一性强，切点少，产率高（85%） ❖ * 弱酸、弱碱也可使肽链水解但专一性不好
2．酶解法： ❖ 胰酶：水解碱性氨基酸羧基所形成的键（Lys，Arg） ❖ * 碱性氨基酸的羧基连接的是Pro则不能水解。 ❖ 糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：专一性水解芳香族氨基酸羧基所
❖ 在氨基酸顺序测定时，只要从肽链某一末端（通常是N-末端） 起逐个将氨基酸残基断裂下来，并对游离出来的氨基酸或其 衍生物进行鉴定，就可以确定氨基酸序列。但是实际操作时， 由于每次末端氨基酸残基发生断裂的效率不能达到100%， 或者说，在大多数肽段在断裂第二个氨基酸残基时，少数肽 段可能因为上一轮未发生反应而正在断裂第一个氨基酸残基， 这样势必给测定带来干扰。如果肽链很短，这样的干扰不会 对测定产生重大影响；但蛋白质肽链的长度都超出这一范围， 这样测定将无法进行下去。所以人们首先需将肽链进行适当 的分解，将其断裂成若干长度合适的肽段，再分别测定这些 肽段的氨基酸顺序。
❖ 通过末端分析得到：N-末端残基为I，C-末端残 基为L
❖ 用胰蛋白酶水解得到第一套肽段，测定出氨基 酸顺序分别为：
❖ MTYAGK ISR EAL CAFR DALK ❖ 用胰凝乳蛋白酶水解得到第二套肽段，测定出
氨基酸顺序分别为：
❖ TY REAL AGKDAL ISRM KCAF
❖ 由于N-末端残基为I，ISR和ISRM是N-末端肽段；又 由于C-末端残基为L，EAL和REAL是C-末端肽段。 利用两套肽段的氨基酸顺序彼此之间的重叠关系，得 出：
形成的键（Phe，Try，Tyr）。 ❖ * 若芳香族氨基酸的羧基连接的是Pro则不能水解。 ❖ 分离肽链可用：分子筛；离子交换；等点聚焦（电泳法）
7. 测定各个肽段的氨基酸顺序
❖ 测定肽段的氨基酸顺序的方法有：Edman降解法、酶 解法、气相色谱－质谱联用法等，其中最常使用的是 Edman降解法。
❖ b）分离检测：
❖ 苯甲醛+酰肼→沉淀→离心
❖ 上清液中含游离基酸
❖ 2) 还原法
❖ 用还原剂如硼氢化锂处理肽链，则C-末端残基 的α-羧基被还原成醇，将肽链完全水解后，分 析水解产物，其中的α-氨基醇对应的即为C-末 端氨基酸。
❖ 3) 羧肽酶法
❖ 羧肽酶是一种专一从多肽链的C-末端开始逐个水解氨基酸残基 的蛋白水解酶。由于该酶的专一性，当它作用于多肽链时，C末端残基首先被水解下来，然后是C-末端第二个氨基酸残基， 依此类推。根据氨基酸释放的动力学曲线，可以确定C-末端氨 基酸以及靠近C-末端的几个氨基酸的排列顺序。不过这是理想 的情况，实际测定中常常有多种因素干扰，很难确定C-末端多 个氨基酸的排列顺序。
❖ 缺点：DNS-Pro、DNS-Try被破坏；N端是Pro、百度文库Try测不出；不能进行N端测序
❖ 3) Edman降解法[苯异硫氰酸酯法（PITC法)] ❖ a) 原理：
❖ a）分离检测：PTH-Aa溶于乙酸乙酯、丁酸乙酯， Aa不溶
❖ c）优点：N端是Pro可测；能进行N端测序 ❖ 缺点：灵敏度稍差
❖ 标准Aa + DNP——反应——纸层——喷茚三酮
❖ 未知DNP-Aa——纸层——喷茚三酮
❖ 比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有 几条肽链组成
❖ c）优点：反应条件温和，末端产物易分离
❖ 缺点：N端是Pro测不出；不能进行N端测序
❖ Lys的另一氨基生成e-DNP-Lys，由于它不溶于 乙醚故不影响测定结果
❖ 4）DansyCl-Edman法 ❖ 既可检测N端序列又有较高灵敏度
❖ 5) 亮氨酸氨肽酶法
❖ 此酶专一水解N端羧基形成的肽键，可测N端序 列，但不能测N端为Pro.
❖ 5-2 C-末端分析 ❖ C-末端分析方法也有很多，但至今还不能令人
满意，常用的有肼解法、还原法、羧肽酶法等。
❖ 1）肼解法 ❖ 原理：