生鲜乳皮革水解蛋白操作规程

生鲜乳中碱度和皮革水解蛋白操作规程
一、碱度
1检测原理和方法
参照GB/T 5009.46-2003《乳与乳制品卫生标准的分析方法》规定的方法进行。

原理：鲜乳中如加碱，可使溴麝香草酚蓝指示剂变色，由颜色的不同，判断加碱量的多少。

2检测步骤
试剂：溴麝香草酚蓝-乙醇溶液（0.4g/L）——准确称取40mg指示剂用乙醇溶解并定容
与100mg容量瓶。

5%碳酸氢钠——称取2.5克碳酸氢钠用水溶解，并定容在50mL容量瓶中。

检测步骤：量取5mL生鲜乳式样，至于试管中，沿管壁小心加入5滴指示剂倾斜轻转2-3圈，静置2min根据环层指示剂特征确定结果，同时用为参碱的生鲜乳做
空白对照实验。

添加实验——向5mL原料奶中加入50微升浓度为5%的碳酸
氢钠溶液，牛奶中碳酸氢钠浓度为0.05%
备注：1碳酸氢钠的检测限为0.05%
2指示剂加入时，注意沿壁小心加入，剧烈晃动会导致指示剂同乳样混合，稀释颜色。

3加入指示剂2min后注意颜色变化，在滴加后的2-10min中内观察结果，因为颜色随时间的延长而加深。

二、皮革水解蛋白
1、检测方法和原理
检测牛奶中的皮革水解物就是检测牛奶中的L-羟脯氨酸（分子量131.13，C3H9N03）羟脯氨酸是人体内非必需氨基酸，是胶原蛋白特有的氨基酸，是衡量机体胶原含量的一个重要指标。

且牛奶中不含羟脯氨酸。

原理：生鲜乳经过水解后释放出羟脯氨酸，被氯胺T氧化，生成含有吡咯环的氧化物加入含有高氯酸的显色剂，高氯酸破坏过量的氯胺T，终止氧化，含有吡咯环的氧化物与显色剂对二氨基苯甲醛生成红色化合物，显色。

2、检测步骤
试剂：盐酸（优级纯）
50g/L苯酚水溶液（新蒸馏苯酚）
缓冲溶液——将50g柠檬酸、26.3g氢氧化钠和146.1g结晶乙酸钠溶于水，稀释
至1000mL，此溶液与200mL水和300mL正丙醇混合。

氯胺T——将1.41g氯胺溶于10mL水中，依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲溶
液。

（现用现配）
显色剂——称取10g对二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸溶解，缓慢加入65mL
异丙醇。

L-羟脯氨酸标准溶液：
储备液(500µg/mL)：取50mgL-羟脯氨酸100mL容量瓶中。

工作液(5µg/mL)：精密量取2mL储备液置于200mL容量瓶中，加水定容至刻度
摇匀
检测步骤：
准确称取约5.0000g生鲜乳样品，加入5.00mL浓盐酸（优级纯），滴加3滴50g/L苯酚水溶液，氮吹后封口，在150℃水解1小时（110℃水解6小时），
取出冷却。

同时做空白和样品加标（计算回收率）。

打开水解管，用滤纸过滤到100mL容量瓶中，用蒸馏水反复冲洗滤纸和漏斗，定容。

吸取20mL水解液与25mL烧杯中，使用1mol/L的氢氧化钠调节PH
至8±0.2,转移定容到50mL容量瓶中，摇匀待测。

分别准确移取配置好的标准工作曲线（浓度为0.0、0.5、1.0、1.5、2.0µg/mL （分别吸取工作液1、2、3、4mL到10mL容量瓶中）和待测水解液5.00mL加
入到25mL的比色管中。

加入2.00mL的氯胺T溶液（现用现配），摇匀后在室温静置20min，再加入2.00mL的显色剂，摇匀在60℃水浴20min.
迅速冷却，在558nm波长下测定样品吸收值。

3检测结果
含量X（%）= C×A 回收率（%）= （X阳性-X空白）×100
m×10000X添加
备注：1生鲜乳空白样品中含有一定量的羟脯氨酸，可能个是由检测过程中使用的试剂引入，计算结果是要扣除空白。

2试样水解须在充氮状态下保持密封。

3水解时不要漏液，少量多次的转移水解液。

4试样前处理过程中调节PH，控制在8±0.2。

5前处理过程需多次稀释，注意稀释倍数
6回收率中的添加量%+=C*V/最后定容体积
7检出限为0.01%。

乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定—L(-)-羟脯氨酸含量测定法
1 主题内容与适用范围
本方法规定了乳与乳制品制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定方法。

本方法适用于乳与乳制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定。

本方法通过对L(-)-羟脯氨酸含量的测定，可判定是否为动物水解蛋白。

2 引用标准
GB9695.23-90 肉与肉制品L(-) - 羟脯氨酸含量测定
3 原理
试样经酸水解,释放出羟脯氨酸。

经氯胺T氧化,生成含有吡咯环的氧化物。

用高氯酸破坏过量的氯胺T。

羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,在波长558nm处进行比色测定。

4 试剂
所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水或同等纯度的水。

4.1 氯化亚锡(GB638):0.75％溶液。

将氯化亚锡7.5g溶于500mL水中,再加入500ml浓盐酸(GB 622)。

4.2 盐酸(GB622):6mol/L溶液。

4.3 氢氧化钠(GB629);1mol/L、10mol/L溶液。

4.4 缓冲液:将50g柠檬酸,26.3g氢氧化钠和146.1g结晶乙酸钠(GB694)溶于水,稀至1L,此溶液与200mL水和300mL正丙醇混合。

4.5 氯胺T(HG3-972)溶液:将1.41g氯胺T,溶于10mL水中,依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲溶液(用时现配)。

4.6 显色剂:称取10g对二甲氨基苯甲醛,用35mL高氯酸(GB623)溶解,缓慢加入65mL 异丙醇。

4.7 L(-)-羟脯氨酸(C5H9NO3)标准溶液。

4.7.1 标准储备液500μg/mL:称取50.0mg/L(-)-羟脯氨酸用少量水溶解,加一滴6mol/L 盐酸,定容至100mL容量瓶中。

4.7.2 标准工作液5μg/mL:吸取标准储备液
5.00mL于500mL容量瓶中,定容。

5.1 实验室常规设备。

5.2 配有冷凝管的三角瓶:250mL。

5.3 恒温水浴。

5.4 试管加热器或水浴,可控温于60℃。

5.5 分光光度计。

6 试样处理：
6.1 方法1：准确称取样品2-5g（液体样品5-10g）放入250mL磨口三角瓶中。

加几粒沸石。

加入氯化亚锡溶液100mL,置于水浴上加热回流16h。

趁热将水解溶液过滤于200mL容量瓶中,用6moL/L热盐酸10mL反复三次冲洗三角瓶和滤纸,冷却,用水定容到刻度,混匀。

吸取5～25mL(V1)水解液于100mL烧杯中,用10mol/L、1mol/L
氢氧化钠溶液调节pH为8±0.2,过滤于250mL容量瓶中,用30mL水冲洗烧杯和滤纸上的氢氧化亚锡沉淀,反复三次,把洗液并入滤液中,以水洗至刻度,摇匀备用。

6.2 方法2：准确称取一定量样品，精确到0.0001g。

使样品蛋白质含量在10～20mg 范围内；将称好的样品放于水解管中。

在水解管内加6mol/L盐酸10～15mL（视样品蛋白质含量而定）或加入12mol/L盐酸10～15mL，含水量高的样品（如牛奶）可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚（3.3）3～4滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0 psi），然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110±1℃的恒温干燥箱内，水解24h后（如加入12mol/L盐酸，水解时间可缩短至6h）后，取出冷却。

打开水解管，趁热将水解溶液过滤于100mL三角瓶中,用6moL/L热盐酸10mL反复三次冲洗试管和滤纸,冷却,用水定容到刻度,混匀。

吸取5～25mL(V1)水解液于100mL 三角瓶中,用10mol/L、1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为8±0.2,过滤于50mL容量瓶中,用水冲洗烧杯和滤纸上的氢氧化亚锡沉淀,反复三次,把洗液并入滤液中,以水洗至刻度,摇匀备用。

7 分析步骤
7.1 测定
7.1标准曲线的绘制
吸取L(-)-羟脯氨酸标准工作液0.00,10.00,20.00,30.00,40.00mL,分别置于100mL容量瓶中,定容摇匀。

浓度分别为0.0,0.5,1.0,1.5,2.0μg/mL。

取不同浓度的上述溶液4.00mL,分别加入20mL具塞试管中,加氯胺T溶液2mL,摇匀后于室温放置20min。

加入显色剂2mL,摇匀,塞上塞子于60℃试管加热器(或恒温水浴)中保温20min后取出,迅速冷却,在波长558±2nm处测定吸光值,绘制标准曲线。

7.2 试样测定
从待测液中吸取已制备好的样液4.00mL于20mL具塞试管中,以下按7.1步骤进行,同时作空白试验。

8 分析结果的计算
C•A
计算公式: X= ───————×100
m×1000
式中:X——样品中L(-)-羟脯氨酸的含量,％;
C——从标准曲线上查得相应的L(-)-羟脯氨酸量,μg;
m——称取试样的质量,g;
A——稀释倍数
当符合允许差所规定的要求时,取两次测定结果的算术平均值作为结果,结果精确到0.01％。

9 允许差
同一分析者同时或相继进行的两次测定结果之差不得超过平均值的5％。

10 判定方法
因L(-)-羟脯氨酸为胶原蛋白中的特有组分，其含量占10%以上；而乳蛋白中不含有此成分，如若样品中含有L(-)-羟脯氨酸，可判定添加了动物水解蛋白。

牛奶中L-羟脯氨酸检验标准溶液及质控记录
第页共页检品编号：检验时间：年月日
天平编号：分光光度计编号：检验室温度：℃检验室相对湿度：%
检验依据：乳与乳制品中皮革水解蛋白鉴定-L-羟脯氨酸含量测定
检验人复核人室主任
牛奶中L-羟脯氨酸的检验记录
第页共页检验时间：年月日
天平编号：检验室温度：℃检验室相对湿度：%
分光光度计编号：稀释倍数n= X空：
检验依据：乳与乳制品中皮革水解蛋白鉴定-L-羟脯氨酸含量测定
检验人复核人室主任。