细胞核与线粒体的分离
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②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离 心管一侧会出现沉淀；
③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变 形、聚集而失活。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation
常用介质(高溶解性的惰性物质): 氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖
密度梯度离心 （Density-gradient centrifugation）
• 当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下， 颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形 成区带的方法。
• 两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，线粒体和 比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉 降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
(4)将肝组织捣碎液分装在50ml离心管中， 1500rpm 4 °下 （位于五楼的实验室）离心 2min (去除大组织块）
注意事项： 尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间， 整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
2. 细胞核与线粒体的分离（两人一组）：
⑴ 先将0.5mL 0.34mol/L蔗糖缓冲液放入1.5ml离心管，然后沿 管壁小心地加入0.5mL肝组织匀浆使其覆盖于上层。 2700rpm 4 °下离心10min，沉淀为粗提的细胞核。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 1st Step: Differential centrifugation
细胞器鉴定
细胞破碎的注意事项：
1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液 （0.25mol/L ）。它比较接近细胞质的分散相，具有 足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小， 在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。
2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。 3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中
力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。 主要包括差速离心、密度梯度离心等方法。
差速离心法 (Differential centrifugation)
根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别， 分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方 法。从低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降 系数相差较大（10倍及以上）的颗粒。
三、实验材料及用品：
器具：高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、组织捣碎机，培养 皿，离心管
2700/12800rpm
1500/21000rpm （五楼实验室）
试剂：生理盐水、 1. 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、 2. 0.34mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 3. 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 4.1.0 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5. 5.1.5 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5 6. 固定液【甲醇-冰乙酸(9:1)】、姬姆萨染液(Giemsa) 7. 1%詹纳斯绿B染液(Janus Green染液)。
的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束 不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长， 导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。
二、实验原理
（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心
成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术。 离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮
密度梯度离心分离线粒体（一位同学完成） (4) 去一支1.5ml离心管，先加入0.4ml 1.5 mol/L 的蔗糖溶液， 然后小心地在 1.5 mol/L 的蔗糖溶液上加0.4ml 1.0 mol/L 的蔗 糖溶液，随后将(2)中获得的上清液0.5ml轻轻地加在蔗糖溶液 上，60000 g（21000 r/min左右，五楼实验室）离心 20 分钟。 线粒体会在 1 mol/L 和 1.5 mol/L 蔗糖界面处形成一薄层。
⑵ 将上清缓缓取出转入另一个离心管中，沉淀用1mL预冷的 0.25mol/L蔗糖缓冲溶液洗1次 (2700rpm离心10min)，离心管中 的沉淀为细胞核与部分细胞碎片。
差速离心分离线粒体（一位同学完成）
⑶ 将上一步得到的上清液12800rpm离心10min，沉淀即为粗提 的线粒体。（如果沉淀足够多，也可以用1mL预冷的0.25mol/L 蔗糖缓冲溶液洗1次 (2700rpm离心10min)，获得线粒体）
Supernatant
(上清液)
Pellet
(颗粒团)
沉降顺序：细胞核—线粒体,溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核糖体。Baidu Nhomakorabea
差速离心法 (Differential centrifugation)
优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀 分开，并可使用容量较大的角式转子。
缺点：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；须经反复 悬浮和离心加以纯化；
实验十二、细胞核与线粒体的分级分离 (差速离心法与密度梯度离心)
一、实验目的：
1. 初步了解细胞内各种成分的分离方法； 2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法； 3、对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。
二、实验原理
细胞器分离基本步骤
细胞破碎
分离、纯化
（一）细胞破碎的方法 1.杆状玻璃匀浆器法 2.高速组织捣碎机法 3.超声波处理法 4.化学裂解法 5.反复冻融法
材料：动物肝脏(蛙肝)。
四、实验方法与步骤：
1. 动物肝细胞匀浆制备： ⑴ 取出肝脏（2g左右），先用清水冲洗干净后，放在置于
冰块上的培养皿中用剪刀剪成小块，去除结缔组织，用生理盐 水反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
⑵ 加入10mL预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液 ⑶将悬浮的肝组织液倒入组织捣碎机中进行捣碎，直至没有 可见的组织块为止。
③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变 形、聚集而失活。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation
常用介质(高溶解性的惰性物质): 氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖
密度梯度离心 （Density-gradient centrifugation）
• 当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下， 颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形 成区带的方法。
• 两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，线粒体和 比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉 降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
(4)将肝组织捣碎液分装在50ml离心管中， 1500rpm 4 °下 （位于五楼的实验室）离心 2min (去除大组织块）
注意事项： 尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间， 整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
2. 细胞核与线粒体的分离（两人一组）：
⑴ 先将0.5mL 0.34mol/L蔗糖缓冲液放入1.5ml离心管，然后沿 管壁小心地加入0.5mL肝组织匀浆使其覆盖于上层。 2700rpm 4 °下离心10min，沉淀为粗提的细胞核。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 1st Step: Differential centrifugation
细胞器鉴定
细胞破碎的注意事项：
1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液 （0.25mol/L ）。它比较接近细胞质的分散相，具有 足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小， 在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。
2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。 3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中
力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。 主要包括差速离心、密度梯度离心等方法。
差速离心法 (Differential centrifugation)
根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别， 分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方 法。从低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降 系数相差较大（10倍及以上）的颗粒。
三、实验材料及用品：
器具：高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、组织捣碎机，培养 皿，离心管
2700/12800rpm
1500/21000rpm （五楼实验室）
试剂：生理盐水、 1. 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、 2. 0.34mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 3. 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 4.1.0 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5. 5.1.5 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5 6. 固定液【甲醇-冰乙酸(9:1)】、姬姆萨染液(Giemsa) 7. 1%詹纳斯绿B染液(Janus Green染液)。
的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束 不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长， 导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。
二、实验原理
（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心
成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术。 离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮
密度梯度离心分离线粒体（一位同学完成） (4) 去一支1.5ml离心管，先加入0.4ml 1.5 mol/L 的蔗糖溶液， 然后小心地在 1.5 mol/L 的蔗糖溶液上加0.4ml 1.0 mol/L 的蔗 糖溶液，随后将(2)中获得的上清液0.5ml轻轻地加在蔗糖溶液 上，60000 g（21000 r/min左右，五楼实验室）离心 20 分钟。 线粒体会在 1 mol/L 和 1.5 mol/L 蔗糖界面处形成一薄层。
⑵ 将上清缓缓取出转入另一个离心管中，沉淀用1mL预冷的 0.25mol/L蔗糖缓冲溶液洗1次 (2700rpm离心10min)，离心管中 的沉淀为细胞核与部分细胞碎片。
差速离心分离线粒体（一位同学完成）
⑶ 将上一步得到的上清液12800rpm离心10min，沉淀即为粗提 的线粒体。（如果沉淀足够多，也可以用1mL预冷的0.25mol/L 蔗糖缓冲溶液洗1次 (2700rpm离心10min)，获得线粒体）
Supernatant
(上清液)
Pellet
(颗粒团)
沉降顺序：细胞核—线粒体,溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核糖体。Baidu Nhomakorabea
差速离心法 (Differential centrifugation)
优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀 分开，并可使用容量较大的角式转子。
缺点：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；须经反复 悬浮和离心加以纯化；
实验十二、细胞核与线粒体的分级分离 (差速离心法与密度梯度离心)
一、实验目的：
1. 初步了解细胞内各种成分的分离方法； 2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法； 3、对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。
二、实验原理
细胞器分离基本步骤
细胞破碎
分离、纯化
（一）细胞破碎的方法 1.杆状玻璃匀浆器法 2.高速组织捣碎机法 3.超声波处理法 4.化学裂解法 5.反复冻融法
材料：动物肝脏(蛙肝)。
四、实验方法与步骤：
1. 动物肝细胞匀浆制备： ⑴ 取出肝脏（2g左右），先用清水冲洗干净后，放在置于
冰块上的培养皿中用剪刀剪成小块，去除结缔组织，用生理盐 水反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
⑵ 加入10mL预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液 ⑶将悬浮的肝组织液倒入组织捣碎机中进行捣碎，直至没有 可见的组织块为止。