微生物检验 第十一章 厌氧菌

• 下列标本无送检价值，不宜做厌氧菌培养：①鼻咽 拭子；②齿龈拭子；③痰和气管抽取物；④胃和肠 道内容物、肛拭；⑤接近皮肤和粘膜的分泌物；⑥ 褥疮溃疡及粘膜层表面；⑦排出的尿或导尿；⑧阴 道或子宫拭子；⑨前列腺分泌物
• 标本运送中应尽量避免接触空气，不要冷藏
• 标本运送方法
• 1.无氧小瓶运送法 • 2.厌氧袋运送法 • 3.针筒运送法 • 4.其他运送法
厌氧菌感染的微生物学检验
• 选择培养基
• 卡那—万古霉素冻溶血琼脂平板（KVLB）： 可抑制大多数兼性厌氧菌，使产黑色素普雷沃 菌早期形成黑色素。只需2-3d出现黑色菌落。 绝大多数类杆菌属、普雷沃菌属和紫单胞菌属 都生长良好，梭杆菌和厌氧球菌不能生长。是 常用的选择性培养基。卡那霉素含量为75100μg/ml，万古霉素为75μg/ml
厌氧菌感染的微生物学检验
• 其他
• 气液相色谱技术（GLC）： 应用GLC分析厌氧 菌的终末代谢产物，因各种厌氧菌的代谢产物 不同，故已成为鉴定厌氧菌及其分类的比较可 靠的方法．可在数十分钟至数小时即可作出诊 断
• PCR：如采用PCR方法检测抗生素相关性腹泻 病人粪便中艰难梭菌的毒素基因阳性率高达 82．8％，明显高于厌氧培养法的检出率19.2 ％，且与厌氧培养法的一致性为 100％
厌氧菌感染的微生物学检验
• 直接镜检
• 结合标本来源，性状与气味，可提供许 多有用的信息,对估计标本中含菌量、细 菌种类和选择培养基等都有意义
• 除血液外，各种标本均须直接涂片作革 兰染色镜检，标本发臭，镜检发现细菌 染色不均，形态奇特者常是厌氧菌的表 现
厌氧菌感染的微生物学检验
• 直接镜检
• 标本呈琥珀酸味，带血性或用紫外灯照射发红 色荧光，涂片镜检为G-球杆菌，间或有长短不 一的多形性，并有恶臭者，常为产黑色素普雷 沃菌
厌氧菌感染的微生物学检验
• 厌氧培养方法
• 气袋法：原理相同，只是将厌氧罐用无毒、透 明的塑料袋代替
• 厌氧手套箱培养法：厌氧手套箱公认的培养厌 氧菌最佳仪器。它是密闭的大型金属箱，前面 有透明面板，板上装两个手套，可通过手套在 箱内进行操作。适用于在无氧环境中连续进行 标本接种、培养和鉴定等全部工作
厌氧菌感染的微生物学检验
• 培养基
• 七叶苷胆汁平板（BBE）：本培养基含20％胆 汁，1 g/l七叶苷和100 μg/ml的庆大霉素。抑制 需氧菌，胆汁抑制对之敏感的厌氧菌。只有耐 胆汁的脆弱类杆菌与可变梭杆菌和死亡梭杆菌 不被抑制，反被刺激菌落较大，还能水解七叶 苷，菌落周围有棕黑色的晕
厌氧菌感染的微生物学检验
厌氧菌感染的微生物学检验
• 厌氧培养方法
• 厌氧罐培养法：应用物理或化学方法造成无氧 环境。如冷触媒法：利用气体发生器产生氢及 二氧化碳，产生的氢在触媒作用下，与罐内的 氧结合成水，将氧消耗掉，造成无氧环境。产 生的二氧化碳约为10％，也适宜厌氧菌生长。 方法为：先将触媒(金属钯或铂)及美蓝指示剂 放入罐内，然后将已接种的平板置于罐内，将 气体发生袋的指定角剪开，加入10 ml水，立即 放入罐内，封闭厌氧罐即可
很少且变形破碎，标本来自战伤或肢体严重肿 胀者，大多是产气荚膜梭菌 • G+杆菌，有芽胞，并有异丁酸或异戊酸等气味， 标本来自抗生素相关性肠炎者，大多是艰难梭 菌
厌氧菌感染的微生物学检验
• 根据镜检结果选择合适的培养基，常用的 有非选择性和选择性培养基两种
• 非选择培养基
• 强化血琼脂平板(BAP)：即布氏琼脂或牛心、 牛脑浸出液琼脂为基础培养基，补加酵母浸膏 （0.5％）、动物血（5％-10％）、维生素K1 （0.1μg/ml）和氯化血红素(5μg/ml)，是一种 非选择性培养基，几乎能培养出所有的厌氧菌
• 无芽胞的G+及G-杆菌与球菌，包括40多个 属，300 多个菌种和亚种
• 厌氧菌的感染遍及临床各科，且多为混合 感染；对氨基糖甙类抗生素耐药，而对甲 硝唑(灭滴灵)普遍敏感
厌氧菌
无芽胞菌
有芽孢菌
G+杆菌
G-杆菌
G+球菌
G-球菌
G+杆菌
丙酸杆菌属
类杆菌属
消化球菌属
韦荣球菌属
梭状芽孢杆 菌属
双歧杆菌属
• 菌群失调：长期应用氨基糖甙类抗生素，或长 期应用头孢菌素、四环素等无效者，均可诱发 厌氧菌感染
• 需氧菌、兼性厌氧菌的混合感染。需氧菌生长 耗竭了氧气，有利于厌氧菌的生长
厌氧菌感染的临床特征
• 感染局部产生气体，组织肿胀和坏死 • 粘膜附近的感染 • 深部外伤的继发感染，流产胃肠手术后发 生
的感染
• 菌落性状：不同厌氧菌其菌落形状和性质不同。 梭菌的菌落特点是形状不规则，而无芽胞厌氧 菌多呈单个的圆形小菌落
• 色素：产黑色素普鲁沃菌产生黑褐色或黑色色素。 龋齿放线菌产生粉红色色素。奈氏放线菌产生黄褐 色色素
• 溶血：产气荚膜梭菌在新鲜血琼脂平板形成双溶血 圈
• 荧光：产黑色素普鲁沃菌在紫外线灯下，显示砖红 色荧光；梭杆菌常发生黄绿色荧光；艰难梭菌发生 绿色荧光
• 局部组织的氧化还原电势降低：如血管损伤、 烧伤、动脉硬化、肿瘤压迫、组织坏死等，可 造成局部组织的缺血、缺氧等
• 皮肤黏膜屏障被破坏：如大面积外伤伴有需氧 菌感染，为厌氧菌感染提供了条件
厌氧菌感染的条件
• 机体免疫功能下降：如接受免疫抑制剂、放疗 或化疗的患者；糖尿病、慢性肝、肾疾病及老 人、婴幼儿、早产儿等
普雷沃菌属
消化链球菌 属
乳杆菌属
卟啉单胞菌 属
优杆菌属 梭杆菌属
放线菌属
• 正常情况下菌群之间保持着微生态平衡， 厌氧菌代谢产生的乙酸、乳酸等能抑制病 原菌生长
• 如长期使用广谱抗生素、激素、免疫抑制 剂等，在发生菌群失调或机体免疫力下降 或细菌进人非正常寄居部位时，这些厌氧 菌即可作为条件致病菌而导致内源性感染
• 通常寄居在人的体表和与外界相通的腔道 中，是人体正常菌群，在临床上可引起人 体各部组织和器官的感染，常与其他细菌 混合感染，如腹腔感染、肝脓肿等
微生物学检验
• G+，菌体圆形，直径0.3-1.3 μm，单个、 成双、短链或成堆排列，无芽胞，无荚膜
微生物学检验
• 生长缓慢，厌氧培养2-4d才形成黑色不溶 血的小菌落，接触空气后颜色变浅，传代 后黑色消失，通过庖肉培养后又可产生黑 色素
• 菌体细长，两端尖, 为梭形的G-杆菌，有紫色 颗粒沿菌体长轴排列，成双排列尖端相对，并 有丁酸臭味者，常是具核梭杆菌
• 菌体高度多形性，长短不一，菌体中部肿胀或 呈圆球者，可能是坏死梭杆菌
厌氧菌感染的微生物学检验
• 直接镜检
• 如两端钝圆着色深，中间着色浅不均匀，且有 空泡，长短不一的革兰阴性杆菌常脆弱类杆菌
无芽胞厌氧菌感染
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感染类型 外源性感染为主
内源性感染为主
致病因素 以外毒素为主,
内毒素侵袭因素为主,
毒性强
感染中比例 10%
90%
机体条件
多数与健康
毒性弱 与机体抵抗力
各科分布
关系不大 多见于外伤感染、
降低密切相关 分布临床各科,引起
临床病型 治疗
• 选择培养基
• 卵黄平板（EYA）和兔血平板：用于选择产气 荚膜梭菌，标本接种兔血平板，见有双溶血环， 内环是与菌落一样大小的透明溶血，外环是宽 的甲型溶血，放半小时后菌落变绿色或褐色， 同时可接种卵黄平板，以进行卵磷脂酶试验鉴 定产气荚膜梭菌
• FS培养基 梭杆菌选择培养基 • VS培养基 韦荣球菌选择培养基 • CCFA培养基 艰难梭菌选择培养基
厌氧菌感染的微生物学检验
• 其他
• 聚茴香脑磺酸钠试验：厌氧消化链球菌对50 g/l的 聚茴香脑磺酸钠溶液敏感，而绝大多数其他G+球 菌耐药
• 生化鉴定： 主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试 验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、 脂肪酶试验、蛋白溶解试验、明胶液化试验及胆汁 肉汤生长试验和硫化氢试验等。为简化厌氧菌鉴定， 有多种试验鉴定系统，如推测性平皿系统等。虽然 不完善，但可使厌氧菌的鉴定标准化，自动化
食物中毒
身体各部位炎症,
脓肿, 败血症
具有特殊临床病型
无特殊临床病型
以抗毒素治疗为主
以抗菌药物治疗为主
预防
多数可用抗毒素紧急
增强机体抵抗力
预防,以类毒素预防
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厌氧菌感染的条件
• 组织缺氧或氧化还原电势(Eh)降低可造成厌 氧菌生长的适宜环境，易于遭受厌氧菌感 染
保存菌种
分类鉴定
药物敏感试验
形态与染色 菌落特性 生化反应 药敏性鉴定 气液相色谱
第三节 厌氧球菌（Anaerobic cocci）
• 在临床标本中检出的厌氧菌大约有25％为 厌氧性球菌
• G+消化球菌和消化链球菌属 • G-韦荣球菌属
一、消化球菌属（Peptococcus）
临床意义
• 黑色消化球菌（P. niger）是消化球菌属中 唯一的菌种
• 厌氧工作站
厌氧菌感染的微生物学检验
• 鉴定试验：据厌氧菌的菌体形态、染色反 应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性 等作出初步鉴定。最后鉴定则要进行生化 反应及终末代谢产物等项检查
• 形态与染色：不仅能反映各种厌氧菌的特殊形 态，同时也为鉴定厌氧菌提供参考依据 ；可用 拉丝实验协助判定染色结果
厌氧菌感染的微生物学检验
• 无芽胞厌氧菌在临床厌氧菌标本检出 率中约占90％，分布广泛，多为条件 致病菌
• 无芽胞厌氧菌同需氧菌与兼性厌氧菌 共同构成机体的正常菌群，其中厌氧 菌占有绝对优势，例如肠道菌群占 99.9％
两类厌氧菌感染的不同点
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项目
有芽胞厌氧菌感染
厌氧菌感染的微生物学检验
• 其他
• 基因探针：如用地高辛标记脆弱类杆菌的基因 探针，检测标本中的脆弱类杆菌其敏感性为89 ％，特异性为91．7％，检测灵敏度为 10pgDNA，故其特异性强，敏感性和灵敏度均 高，并具有快速简便的优点
厌氧菌感染的微生物学检验
• 检验结果分析与报告
• 根据革兰染色镜检，菌落性状、耐氧试验及药 敏试验若发现厌氧菌可初步报告：“检出厌氧 菌，形似x x x菌”
第二十三章厌氧菌 Anaerobic bacteria
学习要点
• 厌氧菌感染的条件、临床特征和微 生物学检验
• 厌氧球菌、无芽孢厌氧杆菌的种类 和临床意义
• 梭状芽孢杆菌的种类、致病机制和 微生物学检验
第一节 概述
• 一大群在有氧条件下不能生长，必须在无 氧或低氧条件下才能生长的细菌
• 有芽胞的G+梭菌，只有一个属，即梭菌属， 共有130个种，以芽胞形式存于体外
• 极小的G-球菌，可能是韦荣球菌 • G+无芽胞杆菌，呈乳酸气味者，可能是乳酸杆
菌；呈丙酸气味者，并有特殊排列呈X、Y、或 栅状者可能是痤疮丙酸杆菌；有醋酸气味的可 能是双歧杆菌 • 菌体分枝，呈棒状或栅状排列，且发现黄色颗 粒，有琥珀酸气味者，多是放线菌
厌氧菌感染的微生物学检验
• 直接镜检
• G+芽胞杆菌，肯定是梭状芽胞杆菌属 • G+短粗两端钝圆杆菌，无芽胞，中性粒细胞也
厌氧菌感染的微生物学检验
• 快速鉴定：其原理是依据细菌在代谢过程中所 产生的胞外酶与少量生化基质迅速反应，能在 4小时观察结果，无需在厌氧环境下培养，只 需用浓菌液即可，自动化程度高
• 其他
• 耐氧试验：当在厌氧平板上有菌生长时，为确定 是否为厌氧菌，必须做耐氧试验
• 药物鉴定试验 ：用于鉴定厌氧菌的抗生素有卡那 霉素和灭滴灵。卡那霉素的敏感性将梭杆菌属与 类杆菌属区分开，大多数类杆菌对卡那霉素耐药； 灭滴灵纸片在鉴别厌氧菌(敏感)与非厌氧菌(不敏 感)有重要意义
• 再根据生化反应及终末代谢产物作最终报告： “分离鉴定出x x x菌”及“药物敏感试验： x x x结果”
• 有条件的单位可采用基因探针或PCR技术，快 速准确的检测厌氧菌
Байду номын сангаас 临床标本
肉眼观察 及直接镜检
需氧培养
分离培养
厌氧培养
2-7d
确定厌养培养
增菌培养 厌氧培养
生长
无生长
生长
兼性厌氧菌
专性厌氧菌
• 分泌物有恶臭，或为暗血红色，并在紫外光下 发出红色荧光
• 分泌物涂片镜检有细菌，而常规培养阴性者； 或在培养基深部长的细菌
• 长期应用氨基糖甙类抗生素治疗无效病例
第二节厌氧菌检验
• 标本采集
• 临床在进行厌氧菌培养前应与实验室联系，以便实 验室做好接种培养的准备
• 不能被正常菌群污染；应尽量避免接触空气。最理 想是能取得组织标本