PCR扩增检测乙肝病毒

电泳槽、电泳仪
紫外分析仪
台式高速离心机
2.主要试剂：
HBV阳性标本 PCR反应管
HBV-PCR定性检测试剂盒
DNA提取液
四、操作步骤
1.标本处理：取患者血清40μl，加入DNA
提取液40μl，沸水浴10分钟，10000转离心 5分钟，取上清液4μl做PCR反应。
10×扩增缓冲液
2.加样：
取试剂盒中PCR反应管
4种dNTP混合物
TapDNA聚合酶 Mg2+
引 物(小分子DNA片段）
加入提取好的标本4μl，6000转离心10秒。
3.PCR仪上扩增：
三个扩增步骤温度及时间
变性
温度 93℃
时间 45″（首次5′）
退火
55 ℃
45″
延伸
72 ℃
60″（末次5′）
循环次数：25次
加入标本
6000转离心10秒
PCR仪上扩增
一、实验目的
1.掌握PCR技术扩增的原理 2.熟悉PCR扩增检测乙肝病毒的基本操作
过程。
二、实验原理
聚合酶链反应(Polymerase Chain
Reaction) 简称PCR,是在体外条件下利 用DNA聚合酶、催化一对引物间的特 异性DNA片段合成的基因体外扩增技 术，它包括三个基本过程：
1.变性：加热使双链DNA变为单链 2.退火：急速降温使引物和互补模板
实验三：PCR扩增检测乙肝病毒
乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎， 我国发病率很高 ，HBV的检测极其重要。
HBV DNA存在就可以引起乙肝的传染，乙 肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒复 制的发动机 。
PCR技术可以检测出极微量的病毒，是判 断其传染性最直接、最可靠的证据。PCR技术 已成为公认的对病毒性肝炎的诊断、疗效观察 及预防研究工作最理想的方法之一。
在局部形成杂交链 3.延伸：耐热DNA聚合酶按5 ′→3′
方向催化以引物为起始点的 延伸反应
一 次 循 环
5’
3’
5’
3’ 模板DNA
3’
5’
高温变性
低温退火
适温延伸
5’
3’
引物
Tap酶
3’
两条子代DNA
5’
经过25-35次循环后，目的片段扩增2n倍
三、主要器材及试剂
1.主要器材：
9700型PCR仪
离心
4.电泳检测：Fra Baidu bibliotek
①制备2%琼脂糖凝胶
电泳槽的准备：
2%琼脂糖的制备：
称取 0.8g琼 脂糖
40mlTBE 加入 电泳缓冲液 冷却
（PH8.0) 60℃左右 煮沸溶解
加入 溴乙啶
EB20μl
倒胶
``
②加样：取扩增后的产物10 ul点样于凝胶孔
取样
点样
③电泳：点样端接“-”，稳压，50V，电泳30分钟。
五、结果观察：紫外分析仪下观察，出现橙黄色
条带则为HBV阳性
点样孔
HBV阳性对照
HBV阳性
HBV阴性对照
HBV阴性
正极
负极
五、注意事项
1. 试剂盒内阳性标本及DNA提取液使用前需充 分融化离心。
2. 反应液的表面为固体封盖剂，电泳取样时从 反应管底部吸液。
3. EB为强致癌物，操作过程应注意防护。 4. 注意无菌操作，以免出现假阳性。
Thank you!