大肠菌群计数方法

版本:A/1 日期:2012-05-25

页数: Page 1 of 12

标题： 大肠菌群计数方法

文件修改记录

分发号 : ______(仅适用于控制文件) (仅盖有红色印章的文件才有效)

版本 修订

次数 修订日期 修 订 内 容

0 0 2011-02-14 A 1 2012-05-25 修订

版本:A/1

日期:2012-05-25页数: Page 2 of 12标题：大肠菌群计数方法

1.0目的

规定大肠杆菌计数的方法。

2.0适用范围

适用于加多宝凉茶、浓缩汁或原辅材料中的大肠杆菌群的计数。

3.0术语

3.1大肠菌群：一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧格

兰仕隐形无芽孢杆菌。

3.2MPN最可能数（most probable number）：基于泊松分布的一种间接计数方法。

4.0职责

4.1质检部：负责按此方法对加多宝来凉茶、浓缩汁或原辅材料中大肠菌群进行计数。

5.0流程图

见附录A、附录B。

6.0内容及要求

6.1设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：

6.1.1恒温培养箱：36℃±1℃

6.1.2冰箱：2℃-5℃

6.1.3恒温水浴箱：46℃±1℃

6.1.4天平：感量0.1g

6.1.5振荡器

6.1.6无菌吸管：1ml（具0.01刻度）、10ml（具0.1刻度）或微量移液器及吸

头。

6.1.7无菌锥形瓶：容量500ml

6.1.8无菌试管：18×200ml

6.1.9小导管

6.1.10无菌培养皿：直径90mm

6.1.11菌落计数器

6.2培养基和试剂

6.2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤

6.2.2煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤

版本:A/1

日期:2012-05-25页数: Page 3 of 12标题：大肠菌群计数方法

6.2.3乳糖胆盐发酵培养基（LBB）

6.2.4乳糖蛋白胨培养基（LPB）

6.2.5伊红美蓝琼脂培养基（EMB）

6.2.6结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）

6.2.775%乙醇溶液

6.2.8无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌

15min

6.3大肠菌群MPN计数法

6.3.1加多宝凉茶、浓缩汁等产品及原辅材料中大肠菌群的测定

6.3.1.1样品稀释

a、固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225ml无菌生理盐水的无菌均质

袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1：10的样品匀液。

b、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置于盛有225ml的无菌生理盐水的无

菌锥形瓶中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。

c、用1ml无菌吸管吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注入盛有9ml无菌生

理盐水的试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，制

成1：100的样品匀液。

d、根据对样品污染状况的分析，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样

品匀液。注意每递增稀释一次，换用一支1ml无菌吸管。从制备样品匀液至

样品接种完毕，全过程不得超过15min。

6.3.1.2初发酵试验

a、每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原

液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml

（如果接种量超过1ml，则用双料LST肉汤）。

b、将以上接种好的试管置于36±1℃培养24±2h，观察导管内是否有气泡产

生，如未产气则继续培养至48±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管

数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。

6.3.1.3复发酵试验

版本:A/1

日期:2012-05-25页数: Page 4 of 12标题：大肠菌群计数方法

用接种环从所有48±2h内发酵产气的LST肉汤中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察产气情况。产气

者，计为大肠菌群阳性管。

6.3.1.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告

根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表（见附录C），报告每克（或每毫升）样品中大肠菌群的MPN值。

6.3.2工艺水等水样中大肠菌群的测定

6.3.2.1推测性试验

a、取待检样品10ml，接种到10ml双料的乳糖胆盐发酵培养液或乳糖蛋白胨培

养液中，共接种5管；对于可能存在污染的水源，取待检样品10ml、1ml、

0.1ml（取样品1ml于9ml无菌生理盐水中稀释，取稀释后的样液1ml），分

别接种于含10ml双料、单料和单料乳糖胆盐发酵培养液或乳糖蛋白胨培养

液中，各接种5管。

b、如果水样污染较严重，应加大稀释度，可接种1ml、0.1ml、0.01ml甚至

0.1ml、0.01ml、0.001ml，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。

接种1ml以下水样时，必须做10倍递增稀释后，取1ml接种，每递增稀释

一次，换用1支1ml无菌刻度吸管。

c、将以上接种好的试管置于36±1℃培养箱内培养24±2h，如所有乳糖胆盐发

酵管或乳糖蛋白胨发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气

者，则按下列程序进行。

6.3.2.2确证性试验

6.3.2.2.1方法一

a、分离培养

将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置于36±1℃生化培养箱内，培养18-24h取出。观察菌落形态，用接种环挑取符合下列特征

的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。

①菌落呈深紫黑色，表面有金属光泽；

②紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；

③淡紫红色、中心较深的菌落。

b、证实试验