实验1 试剂盒方法提取基因组DNA组和质粒DNA

实验一试剂盒方法提取基因组DNA和质粒DNA

黄华如

（生命科学学院，生技091，29号）

摘要：实验用试剂盒方法提取nchpzh008植物DNA组，本组可以在电泳图谱中清晰看到DNA条带，而在用不同引物组合来对DNA进行PCR，在聚丙烯凝胶电泳图谱中可以看到，引物组合me4em3、me5em2、me5em3对植物DNA使比较好的，这些引物组合可以用在不同物种的遗传特性分析。利用柱式试剂盒提取PUC18和500bp质粒DNA，其中1-3组提取PUC18，4-6组提取500bp质粒DNA。结果是提取PUC18质粒DNA的同学没能将质粒提取出来，而提取500bp的全部都可以提出来。说明了PUC18质粒没有成功转化大肠杆菌，而500bp则转进了大肠杆菌。

关键词：试剂盒；DNA基因组；PCR技术；质粒DNA

植物细胞通常有三套基因组，即染色体基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组，其对应的DNA分别称为基因组DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA。植物细胞的总DNA中95%以上是基因组DNA，而且在常规提取条件下，mtDNA和ctDNA因裸露存在，没有蛋白质的保护，会由于提取缓冲液中酸、碱的水解而丢失。

质粒是存在于细菌细胞中的染色体外小分子DNA，一般呈双链闭合环状，能自我复制和垂直遗传，并赋予宿主细胞一些新表性，但质粒的存在对细胞本身的存在并不是必需的。质粒本身或经过一定改造后的质粒常被用作基因载体，将外源基因带入受体细胞中复制和扩增，甚至表达。质粒有严谨型和松弛型之分，基因工程研究中所用的质粒主要是松弛型质粒，或是经过遗传修饰的人工质粒。

DNA提取是植物分子生物学研究的基础技术。目前，已经发展了多种方法，成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出DNA。但是有些情况下，不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异，在提取基因组DNA时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理。从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取的方法难度就相对大于大多数的禾谷类及蔬菜类植物。从这些植物中分离出的DNA由于多酚被氧化成棕褐色，多糖、单宁等物质与DNA会结合成粘稠的胶状物，获得的DNA常出现产量低，质量差、易降解，影响了DNA质量和纯度，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚至不能作为模板进行PCR扩增。用试剂盒方法提取DNA组是一种比较方便和高效的方法。

1 材料与方法

1.1 试供材料

nchpfszh004、nchpfzh01101、nchpfzh01102、农场和平1号、nchpzh021、nchpzh008、大肠杆菌

1.2 试剂配制

氯仿、异丙醇、Tris、Hcl、EDTA、75%乙醇、灭菌水、TBE缓冲液、硼酸、PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、琼脂糖等

1.3 实验设备及用具

高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH 计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。

1.4 试剂盒方法提取DNA组步骤

1)65℃预热柱式植物DNAout溶液A，使其沉淀融化，充分混匀，取0.75ml加入到5ml

朔料离心管中并放置65℃待用；

2)称取植物组织0.3g，液氮研磨后加入到5ml离心管中；

3)将匀浆物全部转移到新的1.5ml离心管中；

4)在匀浆液中加入0.5倍体积预热的溶液B到离心管中，颠倒数次混匀，此时溶液中可能

有白色丝状悬浮物产生；

5)65℃水浴4min，如果室温放置，DNA产量会降低10~20%；

6)加入200ul自备氯仿，震荡混匀20s，此时溶液呈乳白色；

7)12000rpm室温离心2min，吸取上清液到一个新的1.5ml离心管中；

8)加入1.5倍体积的溶液C，颠倒数次后全部转移到离心吸附柱中，室温放置至少2min；

9)将0.5ml通用洗柱液加入离心柱中，12000rpm室温离心1min，弃穿透液；

10)重复上述操作一次；

11)空甩半分钟去除残留液体，将离心吸附柱转移到新的1.5ml离心管中；

12)将离心吸附柱放置在一新的1.5ml管中，加50ul通用洗脱液，室温放置5min；

13)12000rpm室温离心1min，即得植物DNA溶液；

14)由于本产品使用的离心吸附柱吸附DNA的能力较强，可以重复上步操作一次，以洗脱

得到更多的DNA；

15)直接取用5~10ul电泳检测DNA，其余放冰箱待用。

1.5 柱式试剂盒方法提取质粒DNA步骤

1)先将全部RNase A溶液全部加入到溶液A中，摇匀后再取用，未用完的溶液A最好在

4℃保存。

2)从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中，37℃振荡培养12-16小时（摇床转速

200-300）。注意：建议使用LB培养基，营养更丰富的培养基会使浓度过高，超过纯化系统处理能力二降低DNA质量。另外，延长培养时间有利于提高质量DNA浓度，但是菌液培养过长时间会因细胞死亡、裂解而造成质粒DNA浓度降低。

3)用1.5mL离心管收集1-4mL过夜培养饱和菌液，室温12，000rpm离心1分钟，弃上清，

在短暂离心，吸弃残留液体。

4)加入250uL溶液A，用枪头充分吹打使菌体重悬（此步在冰上操作效果更佳）。注意：

细胞未充分悬浮会影响后续操作，可以使用悬锅振荡器帮助混匀或使用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀。

5)加入250mL溶液B(如果溶液B有沉淀，用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用)，

温和反复颠倒混匀4-6次，看到溶液变粘即可，然后冰上放置不超过4-5分钟。注意：次步处理不能超过5分钟，否则DNA的碱损伤比较严重。同时千万不要剧烈震荡，否则基因组DNA断裂产生的片段非常容易污染质粒DNA，形成碳酸，中和溶液B中的NaOH，降低其效率。

6)加入350mL冰上预冷的溶液C，反复颠倒混匀4-6次，可见白色沉淀物产生，然后冰

上放置至少5分钟。

7)最高速（12,000rpm以上）4℃离心5分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于

此时的溶液比重较大，有时候出现沉淀漂浮是正常现象，取上清时避开漂浮的沉淀即可。

如果此步的离心在室温进行，更容易出现沉淀漂浮的现象。

8)静置2分钟以上让质粒DNA与吸附柱充分结合，此步十分重要。

9)室温12，000rpm离心1分钟，弃管中的废液。

10)加入500mL的通用洗柱液，室温12，000rpm离心1分钟，弃管中的废液。注意：通用

洗柱液中含乙醇，用后需要将盖拧紧存放，否者乙醇会挥发。

11)重复上步1次。