细胞总蛋白提取方法

细胞总蛋白提取方法

一、溶液配制

1. 100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml

称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。

2. 100 mM PMSF

3. RIPA溶液 100ml

成分分子量终浓度

Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4)

NaCl 58.44 0.87 g 150 mM

EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM

NP-40 1 ml 1%

SDS 0.1 g 0.1%

脱氧胆酸钠 0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。※使用前加入

成分储存浓度加入量终浓度

PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM

NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM

Aprotinin 10μg/μl 0.2μl/1ml 2μg/μl

Leupetin 10μg/μl 0.2μl/1ml 2μg/μl

二、方法

1. 细胞收取

1) 细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞

2) 弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。 3) 加入0.05%胰酶2ml，37?温育1min。分两次将细

4) 待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml 胞收至一个

管中 ependorf 管中，10,000rpm×3min，4?

5) 弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×3min，4?

6) 重复PBS清洗一次

7) 弃上清，-80?冻存待裂解

2. 蛋白提取

1) 向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS、

加入缓冲液前先将1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin)，混匀细胞沉淀敲散～加

后冰上放置40mins 入后吹打细胞沉淀

使其松散2) 10,000rpm×15min，4?

将上清转移至一个新的ependorf 管中(约250μl)