胚胎和幼体的原位杂交

胚胎和幼体的整体原位杂交方法

1. 主要溶液

大量DEPC处理过的重蒸水加入0.1%的DEPC，充分摇匀，放

置2小时以上，高压灭菌

3M 醋酸钠,pH5.2 DEPC处理,高压灭菌

NaPBS 0.9 % NaCl

20mM磷酸钠缓冲液pH7.4

(1M Na2HPO4 1.548mL, 1M

NaH2PO4 0.452mL, 加H2O至

100mL)

DEPC处理,高压灭菌

4%多聚甲醛—Na PBS溶液 4 %多聚甲醛溶于NaPBS

新鲜配制

NaPBSTw NaPBS加0.1% Tween-20，冻存0.1M三乙醇胺DEPC水配制，冻存Proteinase K 10mg/mL贮存液，DEPC水配制，

冻存

10%甘氨酸DEPC水配制，冻存

2mg/mL甘氨酸- NaPBSTw NaPBSTw溶液配制，冻存

20x SSC 3M NaCl

0.3M 柠檬酸三钠

DEPC处理, 高压灭菌，冻存

50×Denhardt’s溶液0.1g Ficoll 8000

0.1g PVP

0.1g BSA, 加DEPC水至10mL

杂交缓冲液50%去离子甲酰胺

100μL/L肝素,

5×SSC

0.1 % Tween-20

5mM EDTA

1×Denhendt’s

1mg/mL酵母总RNA

DEPC水配制, 分装1mL /支, 冻存洗涤液1 50%去离子甲酰胺

5×SSC

1%SDS

DEPC水配制, 分装50mL/管冻存

洗涤液2 50%去离子甲酰胺

2×SSC

1%SDS

DEPC水配制, 分装50mL/管冻存

洗涤液3 2×SSC

0.1% Tween-20

DEPC水配制,分装50mL /管冻存

洗涤液4 0.2×SSC

0.1%Tween-20

DEPC水配制, 分装50mL /管冻存

洗涤液5 NaPBS

0.1% Tween-20

2mg/mLBSA

DEPC水配制, 分装50mL /管冻存RNase贮存液10mg/mL RNaseA, TE配制

预煮沸10分钟, 冻存

绵羊血清55℃30分钟预处理, 1mL/管冻存

5M NaCl DEPC处理，高压灭菌

1M Tris, pH9.6 DEPC水配制，高压灭菌

1M MgCl2DEPC处理，高压灭菌

Levamisole 100mM(24mg/mL)贮存液，避光，冻存NBT/BCIP 贮存液18.75mg/mL NBT

9.4 mg/mL BCIP in 67% DMSO(v/v),

Boehringer Mannheim

2．胚胎和幼体材料的准备

定时收集早期发育各期的胚胎和幼体，4% 多聚甲醛-MOPS固定液室温固定30分钟或4℃过夜。固定后将胚胎转移至70%乙醇中，1小时或更长时间后换一次70%乙醇（或甲醇），-20℃保存。

3．胚胎和幼体的整体原位杂交

通过胚胎和幼体的整体原位杂交，确定表达区的位置。共设4个实验组：

A.反义RNA探针杂交实验组，用以检测表达；

B.正义RNA探针杂交阴性对照组；

C.无探针杂交阴性对照组；

D.无抗DIG抗体杂交阴性对照组。

所有器皿都经去RNase处理。实验的具体步骤如下：

第一天:

(1)选择胚胎和幼体：一般每个时期20个，未孵化胚胎要用眼科镊

去除受精膜。置于直径2~3cm的胚胎手术杯中(预先经DEPC处理并高压灭菌)。

(2)用NaPBSTw洗2-3次，每次5分钟，置摇床上，缓慢摇动。

(3)换液至200μL/每个胚胎手术杯7.5μg/mL蛋白酶K中，缓慢

摇动(新配：加1μL10mg/mL蛋白酶K至100μL NaPBSTw, 混匀，取75μL加入1mL NaPBSTw)，24小时以下胚胎消化10分钟，1天至一周的幼体消化20分钟，时间要准确.

(4)向手术杯中(含200μL蛋白酶K溶液)加入4μL 10%甘氨酸贮存

液。

(5)迅速换液至2mg/mL甘氨酸(NaPBSTw配制)

(6)再迅速换液至4%多聚甲醛-NaPBS, 室温1小时,不要转动

(7)换液至0.1M三乙醇胺, 静置1分钟

(8)换液至0.1M三乙醇胺, 摇动5分钟

(9)吸去上清，于无菌离心管中加1mL 0.1M三乙醇胺, 2.5μL乙酸

酐, 混匀, 每杯加300μL, 静置5分钟

(10)于无菌离心管中加1mL 0.1M三乙醇胺, 5μL乙酸酐, 混匀, 每

杯再加300μL, 静置5分钟

(11)换液至NaPBSTw, 摇动5分钟, 水浴(37-60℃)加热一管杂交缓

冲液

(12)换液至100μL温热的杂交缓冲液, 室温摇动1分钟(小心：胚胎

在此溶液中变得透明, 极易丢失)

(13)换液至200μL新的杂交缓冲液, 于恒温摇床中60℃缓慢摇动1

小时或更长

(14)正义和反义RNA探针解冻, 在2个离心管中各加200μL预热

的杂交缓冲液,再各加2μL探针混匀，加热至60℃

(15)小心移去手术杯中的杂交缓冲液(越干净越好), 加入预热的含

探针杂交缓冲液, 盖上手术杯, 70℃水浴5分钟

(16)将手术杯用胶带密封好,于恒温摇床中60℃轻摇过夜.

第二天

(1)预热洗涤液1至60℃,洗涤液2-5解冻。

(2)移去杂交液，加0.8mL洗涤液1，60℃轻摇5分钟

(3)用洗涤液1洗3次, 60℃，5、15、15分钟

(4)换为洗涤液2，60℃轻摇5分钟,换至室温轻摇10分钟

(5)换洗涤液2，室温轻摇15分钟

(6)换为洗涤液3，并立即吸掉

(7)换洗涤液3，室温轻摇5分钟

(8)无菌离心管中加1mL洗涤液3、2μL RNaseA贮存液(10mg/mL), 混匀

(9)移去洗涤液，加RNase溶液, 37℃保温20分钟

(10)用洗涤液3洗2次，各20分钟, 室温摇动

(11)换至洗涤液4, 室温摇动20分钟

(12)用洗涤液5洗5分钟,同时配封闭液: 1mL洗涤液5加100μL 绵羊血清

(13)移去洗涤液, 加200μL封闭液, 室温摇动1小时或更长

(14)换为200μL碱性磷酸酶偶连抗DIG抗体(1:3000, 用成体粉预吸收), 封好手术杯, 4℃轻摇过夜。

第三天

(1)吸去抗体

(2)用NaPBSTw洗4次各20分钟, 室温摇动

(3)在最后一次洗涤中,配碱性磷酸酶缓冲液( 8.3mL无菌水,1mL 1M Tris(pH9.6), 500μL 1M MgCl2, 200μL 5M NaCl,10μL Tween-20)

(4)除去NaPBSTw, 加500μL碱性磷酸酶缓冲液, 涡旋, 再吸掉(会产生沉淀)