大鼠皮层神经元细胞原代培养

6 消化：
实验步骤
7 终止消化： 用含20%血清的DMEM-F12培养液终止消化，
轻轻用吸管吹打均匀， 离心1000 rpm 10min。
8 过筛网：
弃去上清液，加入20%血清的DMEM-F12培养 液，轻轻用吸管吹打均匀，200目尼龙网过滤。
实验步骤
9 细胞计数：
4个大方格内细胞总数 ────────── × 10４×n(稀释倍数) 4
影响因素
材料选择
胎鼠就要胎鼠，新 生鼠就要新生鼠， 不能混淆
★易于操作
★有一些受体，在
培养的工作中失去 功能，会不能再生
影响因素
培养基选择
不建议血清培养
1 血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，影响神经元产量； 2 抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验； 3血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，
实验准备
仪器、材料与试剂
无菌操作台，培养箱
实验仪器
培养板，青霉素瓶，离心机，计数板 冰盒，滤器（200目自制），手术器械 新生鼠 DMEM F12培养基（ 20% 血清）， 025%胰酶 多聚赖氨酸，碘酒， 75% 酒精，PBS，阿糖胞苷
材料与 试剂
实验准备
实验前准备工作
培养板包被
制备冰盒
培养基，阿糖 胞苷配制
10 种 板：
以5×105 个/ml接种于用多聚左旋赖氨酸包被 过的培养板内，培养板置细胞培养箱中37℃、 5%CO2、饱和湿度下进行培养
实验步骤
5 纯化：
培养48小时全量换液，加入终浓10μmol/l 阿糖胞苷的培养液。 目的：抑制质细胞等非神经元细胞的生长。
影响因素
材料
培养基
包被
剥膜
消化
低温操作
0.1 %多聚赖氨酸包被
实验步骤
要点
细节决定成败
细心 耐心
实验步骤
胰酶消化法
取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外 线消毒30分钟。开始工作前先洗手、75%酒精 擦拭手及台面。
点燃酒精灯，安装吸管帽；准备离心管； 平皿及器 械放置妥当。
1 准备：
2 布局：
实验步骤
布局
剥离血管及筋膜
器械 酒精 PBS PBS 剪碎组织块 取脑，分离皮层神经 元 PBS 断头 冰盒
皮层神经元细胞原代培养
☞ 主要内容 :
1
实验原理
2
准备工作
3
实验步骤
4
影响因素
实验原理
◆细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之
一。可分为原代培养和传代培养两种。 ◆原代培养：将动物机体的各种组织从机体中取 出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用 EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适 的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
清洗血液
实验步骤
3 断头取脑： 超净台内，断头取脑，置于盛有PBS的培养皿
内，洗涤3次，弃除表面残余血迹，迅速置于无 菌的生理盐水冰浴上。
4 剥离软脑膜： 剥离大脑皮层至预冷的PBS中，用两把无齿弯
镊仔细剥离软脑膜和血丝，剥离干净后用PBS 液洗2-3遍。
实验步骤
5 剪碎：
将大脑皮层转移到另一装有PBS的平皿中，用 手术剪将其剪成小块（1mm3），用PBS液洗 三次，转移至离心管中离心1000 rpm 5min 。 加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化 20min,中间翻转振荡一次。使细胞分离。
96孔或128孔：细胞会倾向于 向中间集中也会照成发育不均 匀
影响因素
重点
吹打时候难，造成神经元死亡 剥膜 血管膜细胞会混入原代培养 中，培养成果根本不能用
影响因素
重点
消化习惯
消 化 速 度
胰酶
木瓜酶 DNA酶
消化
酶的选择
消化过程中震荡
谢谢！
而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么
都差，高度一致。 4 neurobasal和neurbasal-A被认为是最标准，最好的培养 基。需要的添加剂为 B27和谷氨酰胺。
影响因素
培养板选择
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
6孔板是最佳选择
大于6孔板（比如6CM DISH） 会使得中间很难和周围的细胞 密度一样，造成板中间和边缘 成熟度不一样，而这会给实验 带来很大干扰。