大连宝生物RT-PCR说明书RR820A
宝生物PCR试剂盒说明书
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mRNA
使用 AMV 反转录酶，配制反转录反应液合成 cDNA 的第一条链。
按以下条件进行反转录反应：
（ 30℃
10 min.）*
42℃～60℃ 15～30 min. 1 Cycle95℃5 min.
5℃
5 min.
* 使用 Random 9 mers 进行反转录时，首先在 30℃下保温 10 min，使 Random
1 ml
1 ml 150 μl
1 ml 25 μl
25 μl
25 μl
【各种引物序列】
引物名称 Random 9 mers Oligo dT-Adaptor Primer Control F-1 Primer Control R-1 Primer M13 Primer M4
各引物序列 5′-（P）NNNNNNNNN-3′ 包含 dT 区域及 M13 Primer M4 序列。 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′
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●引物选择
用于反转录的引物可视实验具体情况选择 Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer 或特异性下游引 物。对于不具有 Hairpin 构造的短链 mRNA，3 种引物中的任何一种都可以使用，但一般应按以下方法进 行选择。
Random 9 mers
Oligo dT-Adaptor Primer
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●RNA 样品制备
本试剂盒是把 RNA 合成 cDNA，然后再对此 cDNA 进行扩增的试剂盒。RNA 的纯度会影响 cDNA 的合成 量，而制备 RNA 的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。因 此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话 等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。
一步法RT-PCR试剂盒使用说明书
一步法RT-PCR 检测试剂盒 (一步法RT-PCR 扩增试剂盒)(目录号HS0612-2)产品包装保存条件-20℃产品简介本试剂盒是专为一步法RT-PCR 实验研制，逆转录和PCR 在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。
本试剂盒包括全新高效逆转录酶、快速热启动DNA 聚合酶，同时包含适用于逆转录和PCR 扩增的反应缓冲液和实验中所必需的反应组分。
经过重组表达的SuperRT 逆转录酶RNase H 活性缺失，减少了逆转录反应中RNA 的降解，更容易获得全长的cDNA 。
该逆转酶逆转录效率高，可对少量 RNA 模板进行良好的逆转录反应。
SuperRT 逆转录酶与RNA 亲合性高，能通读GC 含量高，二级结构复杂的RNA 模板，获得高产量的cDNA 。
PCR 反应使用的DNA 聚合酶具有扩增效率高、延伸速度快的优良性能。
独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。
使用该试剂盒能够方便快捷的在同一个反应管内完成逆转录和PCR 扩增反应。
使用本试剂盒扩增得到的目的产物3′端附有一个″A ″碱基，可直接用于T/A 克隆。
北京厚生博泰科技有限公司Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.产品特点1. 效率高，可以高效转录GC含量高，二级结构复杂的RNA模板。
2. 耐热性及稳定性强。
3. 操作简单迅速,最大限度的避免污染。
4. 独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。
使用方法1）一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为20 ~ 30秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2）延伸时间根据所扩增的片段大小设定，本产品中所包含的DNA Polymerase的扩增效率为1 kb/30s。
3）可根据扩增产物的下游应用设定循环数。
宝生物荧光定量PCR使用说明
① 按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂 SYBR® Premix Ex TaqTM（2×） PCR Forward Primer（10 µM） PCR Reverse Primer（10 µM） DNA 模板 dH2O（灭菌蒸馏水） Total
司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。
●操作注意 以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。
1． 本制品请于 4℃避光保存，避免冻结制品。实验证明，4℃保存一年半制品性能稳定，反复冻融制品性 能可能下降。
2． 使用时请上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。 3． 本制品中含有荧光染料SYBR® Green I，保存制品或配制PCR反应液时应避免强光照射。 4． 反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube 等，尽量避免污染。
1．热变性
Primer
荧光物质
2．引物退火
Polymerase
3．延伸反应
●试剂盒特长
1． 适用于 Real Time PCR 反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。 2． 在 2×浓度的Premix中，预先混有SYBR® Green I，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、灭菌
蒸馏水便可进行Real Time PCR反应，操作简单方便。 3． DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRa Ex TaqTM HS，可以进行Hot Start法PCR反应，再与TaKaRa公
*3 建议反应液体积为 25 ～ 50 µl。
PCR试剂盒-RR820A
1.0 ml×5 支 200 μl×1 支 200 μl×1 支
内含 TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg ，Tli RNaseH，SYBR Green I。 ROX Reference Dye 是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。 例如使用 Life Technologies 的 Real Time PCR 扩增仪进行实验就需要校正。
PCR Forward Primer（10 μM） PCR Reverse Primer（10 μM） ROX Reference Dye（50×）or ROX Reference Dye II（50×）*2 DNA 模板 (<100 ng)*3 dH2O（灭菌蒸馏水） Total
*1 通常引物终浓度为 0.4 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.2～1.0 μM 范围内调整引物浓度。 *2 ROX Reference Dye II（50×）比 ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用 ABI 7500 /7500 Fast Real-Time PCR System 时，请使用 ROX Reference Dye II（50×） 。 使用 ABI 7300 和 StepOnePlus Real-Time PCR System 时，请使用 ROX Reference Dye（50×） 。 *3 在 20 μl 反应体系中，DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的 DNA 模板添 加量。另外，2 Step RT-PCR 反应的 cDNA（RT 反应液）作为模板时的添加量不要 超过 PCR 反应液总体积的 10%。 *4 按照各仪器推荐体系进行反应液配制。 2. 进行 Real Time PCR 反应。 建议采用下列图表显示的两步法 PCR 反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行 PCR 条件的优化。由于使用 Tm 值较低的引物等原因，两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三 步法 PCR 扩增反应。有关 PCR 的具体反应条件请参照「实验条件的选择」 。 <Applied Biosystems 7300/7500 和 StepOnePlus Real-Time PCR System > 两步法 PCR 扩增标准程序： Stage 1：预变性 Reps：1 95℃ 30 秒 Stage 2：PCR 反应 Reps：40 95℃ 5 秒 60℃ 30～34 秒* Dissociation stage * 使用 StepOnePlus 时请设定在 30 秒。 使用 7300 时请设定在 31 秒。 使用 7500 时请设定在 34 秒。 -3-
宝生物工程(大连) LA PCR TM Kit Ver.2.1 说明书
TaKaRa Code：DRR013ALA PCR TM Kit Ver.2.1（50次量）宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 页 码●制品说明 1●制品内容 1●保存 2●LA PCR TM技术原理 2●使用注意 3●基因组DNA的纯化方法 3●实验操作 5●DNA电泳时的琼脂糖凝胶选择 8 ●Q&A8●参考文献 10●制品说明PCR（Polymerase Chain Reaction）法是一种体外快速扩增DNA的简单而有效的方法。
在现代分子生物学研究中，PCR法广泛应用于DNA的扩增、DNA重组、基因克隆以及DNA测序等多种领域。
但是，一般PCR法具有一定的局限性，特别是难以扩增5 kbp以上的长链DNA，这严重限制了PCR法的推广和应用。
我们通过改变PCR用DNA聚合酶、PCR用Buffer、PCR扩增条件等，使48 kbp的长链DNA的扩增成为可能，这就是LA（Long and Accurate）PCR TM技术。
LA PCR技术的开拓，为PCR技术的推广提供了有力保障，特别是在基因组DNA研究方面展现了广阔的前景。
本制品可以以基因组DNA为模板扩增长链DNA片段。
此外，本制品中还配备了GC rich专用Buffer （GC Buffer I、GC Buffer II），可以对扩增GC rich的DNA片段、DNA重复序列、具有复杂立体结构的DNA片段等发挥强大威力。
当然，本制品同样适用于扩增一般的DNA片段，反应性能强。
并且在本试剂盒中含有Mg2+ Free Buffer，可以通过调整Mg2+的浓度，确定最佳的PCR反应体系。
●制品内容（50 μl的PCR反应体系；50次量）1. TaKaRa LA Taq®*1（5 U /μl） 125 U2. dNTP Mixture（各2.5 mM） 400 μl3. 10×LA PCR TM Buffer II（Mg2+ plus；Mg2+浓度25 mM） 250 μl4. 10×LA PCR TM Buffer II（Mg2+ free） 250 μl5. MgCl2（25 mM） 500 μl6. Control Template（100 ng/μl）*2 10 μl7. Control Primer LA3（10 μM） 10 μl8. Control Primer LA4（10 μM） 10 μl9. λ-Hin d III digested MW Marker（100 ng/μl）*4 20 μl10. 2×GC Buffer I（Mg2+ plus；Mg2+浓度5 mM）*3 1.25 ml11. 2×GC Buffer II（Mg2+ plus；Mg2+浓度5 mM）*3 1.25 ml12. Control Primer GC1（10 μM） 10 μl13. Control Primer GC2（10 μM） 10 μl*1 TaKaRa LA Taq TM酶说明【酶贮存液】20 mM Tris-HCl（pH8.0），100 mM KCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，0.5% Tween20，0.5% Nonidet P40，50%甘油溶液。
Premix Ex Taq TM(Probe qPCR)说明书宝生物工程公司Premix Ex Taq TM(Probe qPCR)说明书
Takara Code ：DRR390APremix Ex Taq TM(Probe qPCR) （200次量）宝生物工程(大连)有限公司目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●适用的Real Time PCR扩增仪1●保存 1 ●试剂盒原理 1 ●试剂盒特长 2 ●操作注意 2 ●操作方法 2 ◆应用Thermal Cycler Dice Real Time System扩增仪的操作方法2◆应用ABI PRISM 7000/7700/7300 Real-Time PCR System，StepOnePlus Real-Time PCR System的操作方法4◆应用ABI PRISM 7500/7500 Fast Real-Time PCR System的操作方法 5 ◆应用LightCycler Real Time PCR扩增仪的操作方法7◆应用Smart Cycler II System Real Time PCR扩增仪的操作方法8 ●PCR反应条件说明9 ●进行RT-PCR反应时的实验方法9 ●引物设计说明10 ●特别提示：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务11 ●问答11●制品说明本制品是采用探针法（TaqMan®，Molecular Beacon等）进行Real Time PCR（qPCR）反应的专用试剂。
是一种2×浓度的Premix Type试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。
Mix中添加了Tli RNaseH（耐热性RNaseH），以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以最大限度抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。
制品中的DNA聚合酶使用了改良后的Hot Start法用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS，与Takara精心研制的Real Time PCR用Buffer组合使用，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR扩增反应。
TaKaRa MutanBEST Kit （20 次量） 说明书
TaKaRa Code：D401TaKaRa MutanBEST Kit（20次量）宝生物工程(大连)有限公司目录内容页码●制品说明 1●制品内容 1●保存 1●试剂盒原理 1●操作方法 2I . PCR反应 2II. Blunting Kination反应 2 III. Ligation反应3 IV. 结果 3 ●注意事项 3●制品说明本制品是利用PCR技术进行定点突变操作的试剂盒。
其原理是利用导入变异点的引物进行PCR反应后，对PCR产物进行末端平滑化及5′磷酸（P）化处理，再用高效连接试剂Ligation Solution I进行自身连接（环化反应），然后转化、提取突变体DNA。
本试剂盒的原理十分简单，但Taq酶在PCR过程中的错配率限制了这一技术的应用。
现在，TaKaRa的Pyrobest DNA Polymerase使这一技术得到了最大程度的发挥。
Pyrobest DNA Polymerase不仅具有超高的保真性（Fidelity），并且和TaKaRa Taq具有同样的扩增效率。
与其他突变试剂盒相比，本试剂盒的最大特点是操作方便、简单，只需一天时间便可完成整个操作，并且不受载体、宿主菌的限制。
●制品内容（20次量）Pyrobest DNA Polymerase（5 U/μl） 15 μl10×Pyrobest Buffer II 200 μldNTP Mixture（2.5 mM each） 180 μl10×Blunting Kination Buffer 50 μlBlunting Kination Enzyme Mix 25 μlLigation Solution I 150 μl●保 存： -20℃●试剂盒原理试剂盒原理见图1，全套操作约需5小时，简单说明如下。
1. 设计一对5′端邻接，3′端方向相反的引物用以导入变异点。
2. 进行PCR扩增（使用高保真DNA聚合酶Pyrobest DNA Polymerase）。
一步法 RT-PCR 说明书
一步法RT-PCR使用说明书本试剂盒适用于各种动、植物、病毒RNA的PCR 检测，反转录PCR反应体系为50µl，用户在使用此试剂盒之前请详细阅读此说明书。
规格：10次试剂盒组成：名称浓度体积dNTPs10 mM50µl5×反应缓冲液100µlAMV反转录酶5u/µl20µlTaq DNA聚合酶5u/µl20µlDEPC-ddH2O 1.5mlRNasin 40u/µl 20µl实验操作:1．取103-106拷贝的特异目的模板或1pg-5µg的总RNA于一支0.2或0.5ml离心管中，65-70℃保温5-10分钟，离心数秒，放置冰浴中。
2．按照指定的体积将DEPC-ddH2O，5x 反应缓冲液，dNTPs，特异上下游引物及25mM MgSO4加入到置于冰上的0.5ml薄壁反应管中，配制成反应混合物。
反复吹吸使混合物中各组分混合均匀。
然后向反应体系中加入AMV反转录酶和Taq DNA聚合酶和RNasin。
将反应管轻柔震荡10秒以使该混合物混匀。
如需要做多个样品的RT-PCR反应，则应在冰上先配制一总的混合物，该混合物由反应体系中各组分按其指定体积的适当倍数组成，然后取该总混合物48µl加入到每一反应管中。
向各反应管中加入模板以启动反应。
每次加样均应使用单独的加样器枪头，小心勿使样品之间相互污染。
体积终浓度DEPC-ddH2O（加至终体积为50µl）Xµl5× 反应缓冲液10µl 1×dNTP混合物（每dNTP 10mM）1µl 0.2mM下游引物* 50pmol 1µM上游引物* 50pmol 1µM25mM MgCL2 2µl1mM AMV反转录酶（5U/µl）1µl 0.1U/µlTaq DNA聚合酶（5U/µl）1µl 0.1U/µlRNasinRNA样品或对照** Yµl终体积50µl* 计算引物为50pmol时所对应的质量（纳克）的通用公式为：50pmol=16.3ng×b；b为引物碱基数目。
一步法RT-PCR说明书
一步法RT-PCR说明书
TaKaRa PrimeScript TM One Step RT-PCR Kit Ver.2
试剂盒使用说明书
该试剂盒采用一步（One step）RT-PCR法。
RNA→cDNA →PCR反应操作在同一反应体系中连续进行，反应中途不需添加任何试剂。
实验操作
1.配制RT-PCR反应液，以n个反应管为例。
首先，配制如下混合体系，混匀后分加到n个PCR反应管中。
RNase Free dH2O 20μI X (n+1)
2x1 Step Buffer 25μI X (n+1)
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μI X (n+1)
其次，向PCR反应管中加入欲检测病原的扩增引物（即上下游引物）和样品抽提RNA。
上游引物1μI
下游引物1μI
样品RNA 1μI
总体系：50 μI
2．进行RT-PCR反应
50℃30 min
94℃ 2 min
94℃30 sec
50～65℃（以相应的引物而定） 30 sec 30 循环72℃ 1 min
72℃ 10 min
试剂盒自带有确保试剂有效性的阳性对照RNA以及相应的扩增引物（Positive Control RNA, Control F-1 Primer, Control R-1 Primer）,扩增产物为462bp。
扩增后如果试剂盒阳性对照电泳结果为阳性说明试剂盒所有试剂有效，RT-PCR反应液体系没问题。
宝生物石蜡切片DNA提取试剂盒说明书
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Template：
DNA 提取液 5 μl
PCR 反应体积： 50 μl
Polymerase： TaKaRa Ex Taq
PCR 反应条件：
94℃ 30 sec
54℃ 60 sec
35 Cycles
72℃ 60 sec
72℃ 5 min
4． 加热后立即进行 12,000 rpm，4℃离心 10 分钟，离心后的 Microtube 中将呈图 1 状态。 5． 用移液枪吸取水层。避免吸取石蜡膜、树脂以及组织残渣（见图 2）。 6． 吸取的水层可直接作为 PCR 反应的模板，进行 PCR 反应。加入量为 PCR 反应总体积的 1/10，50
② 100℃加热 10 分钟。
③ 12,000 rpm，4℃离心 10 分钟。
④ 取上清液用于 PCR 扩增。
3． PCR 扩增：
Template：
DEXPAT®提取液 1 μl、2.5 μl
Target:
K-ras 12（107 bp）、β-globin（408 bp，262 bp）
PCR 反应体积： 25 μl
Polymerase:
TaKaRa Ex Taq
PCR 反应条件：
94℃ 60 sec
94℃ 30 sec
55℃ 60 sec
35 Cycles
72℃ 60 sec
72℃ 5 min
【冷冻切片来源 DNA 的 K-ras 12 基因、β-globin 基因的扩增结果】
K-ras 12 107 bp
β-globin 408 bp
p53 基因
hMLH1 基因
口蹄疫RT-PCR检测试剂盒使用说明
口蹄疫病毒 RT-PCR检测试剂盒使用说明书用途口蹄疫病毒( FMDV)反转录聚合酶链反应( RT-PCR)，用于检测疑似感染动物的水疱皮或水疱液中所有血清型的 FMDV，适用于 FMDV的检测、诊断和流行病学调查。
原理利用离心柱内硅基质膜提取 RNA，在反转录酶的作用下，以 RNA为模板，以引物为起点合成与 RNA模板互补的 cDNA链。
在 TaqDNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异 DNA片段的拷贝数放大一倍。
经过 35次循环，最终使扩增 DNA 片段放大了数百万倍。
将扩增 DNA片段进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到 DNA片段的扩增带。
试剂1．试剂盒组成2．试剂盒保存期：6个月。
Store:4℃需要自备的器材1．仪器：分析天平、离心机、 PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器(2µL、20µL、200 µL、1000 µL)。
2．耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、 20mL一次性注射器、生理盐水、琼脂糖、 500mL量筒、500 mL锥形瓶、经焦碳酸二乙酯( DEPC)水处理的灭菌 1.5mL离心管和吸头( 10 µL、200µL、1000 µL)、灭菌双蒸水。
使用注意事项1．所有接触病料的物品均应合理处理，以免污染实验室。
2．PCR整个试验分配液区、模模板提取区扩增区电泳区。
严禁器材和试剂倒流。
1所有试剂应在规定的温度储存， -20℃保存的各试剂使用前应放于室温完全融化，使用后立即放回 -20℃。
2染色液低毒，应于室温条件避光保存，操作时应戴上手套。
3注意防止试剂盒组分受污染。
使用前将红盖管8000 rpm离心15 s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。
1不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。
宝生物荧光定量PCR使用说明
宝生物荧光定量PCR使用说明宝生物荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种基于荧光技术的PCR方法，用于测量目标DNA分子或RNA的数量。
它具有高灵敏度、广泛的动态范围和精确测量能力，被广泛应用于分子生物学研究、临床诊断和药物研发等领域。
本文将详细介绍宝生物荧光定量PCR的使用说明。
一、宝生物荧光定量PCR实验前的准备1.根据实验需要准备所需试剂，包括PCR反应体系的组分（如引物、荧光探针、酶和模板DNA/RNA），以及样品处理所需试剂（如提取试剂盒、RNA提取试剂盒等）。
2.准备实验所需的设备和耗材，如实时荧光PCR仪、离心机、PCR微孔板等。
3.检查PCR仪和离心机的工作状态，确保设备正常运行。
4.检查试剂的保存条件和有效期，确保试剂可用。
二、样品处理及转录本合成1.根据实验需要，选取适当的样本类型（如组织、细胞、血液等）进行处理。
对于RNA分析，需要进行RNA提取流程。
2.根据提取试剂盒的说明书，使用相应的提取试剂对样品进行RNA/DNA的提取。
3.对提取的RNA/DNA进行纯度和浓度检测，确保样品质量和浓度符合实验要求。
4.采用逆转录反应，将RNA转录为cDNA。
根据逆转录试剂盒的说明书进行操作。
三、引物和荧光探针设计及合成1.根据目标序列，设计引物和荧光探针。
确保引物和荧光探针与目标序列高度特异性结合，避免非特异性放大。
2.荧光探针通常是使用DNA合成技术进行合成。
确保合成的荧光探针的纯度和浓度符合实验要求。
四、PCR反应液的配制1. 根据PCR反应的需要，确定反应体系的组分和配比。
一般包括PCR引物、荧光探针、PCR酶（Taq DNA聚合酶）、反应缓冲液、模板DNA/RNA、dNTPs等。
2.按照指导手册中的配方比例，将上述试剂按需求加入PCR反应管中。
注意保持反应试剂的冷藏状态，避免反应体系中出现污染。
五、PCR反应条件的设置1. 根据目标序列的特点，设定PCR反应的温度和时间参数。
Premix Ex Taq TM(Probe qPCR)说明书宝生物工程公司Premix Ex Taq TM(Probe qPCR)说明书
Takara Code ：DRR390APremix Ex Taq TM(Probe qPCR) （200次量）宝生物工程(大连)有限公司目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●适用的Real Time PCR扩增仪1●保存 1 ●试剂盒原理 1 ●试剂盒特长 2 ●操作注意 2 ●操作方法 2 ◆应用Thermal Cycler Dice Real Time System扩增仪的操作方法2◆应用ABI PRISM 7000/7700/7300 Real-Time PCR System，StepOnePlus Real-Time PCR System的操作方法4◆应用ABI PRISM 7500/7500 Fast Real-Time PCR System的操作方法 5 ◆应用LightCycler Real Time PCR扩增仪的操作方法7◆应用Smart Cycler II System Real Time PCR扩增仪的操作方法8 ●PCR反应条件说明9 ●进行RT-PCR反应时的实验方法9 ●引物设计说明10 ●特别提示：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务11 ●问答11●制品说明本制品是采用探针法（TaqMan®，Molecular Beacon等）进行Real Time PCR（qPCR）反应的专用试剂。
是一种2×浓度的Premix Type试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。
Mix中添加了Tli RNaseH（耐热性RNaseH），以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以最大限度抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。
制品中的DNA聚合酶使用了改良后的Hot Start法用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS，与Takara精心研制的Real Time PCR用Buffer组合使用，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR扩增反应。
宝生物工程(大连) PrimeScript Reverse Transcriptase 说明书
TaKaRa Code：D2680APrimeScript® ReverseTranscriptase宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 页 码●制品说明 1 ●包 装 1 ●保 存 1 ●酶贮存溶液 1 ●起 源 1 ●活性定义 1 ●纯 度 1 ●用 途 1 ●添附Buffer组成 1 ●1st-Strand cDNA合成的实验操作方法 2 ●使用Mouse Heart Total RNA进行RT-PCR反应的实验例 2 ●使用HL60 Total RNA进行Human TFR基因（4.4 kbp）的RT-PCR反应的实验例 4 ●使用本制品进行2 Step Real Time RT-PCR反应的实验例 5●制品说明P rimeScript Reverse Transcriptase是TaKaRa公司独自开发的一种新型RNase H-型反转录酶。
本酶具有极强的延伸能力，能够有效地合成1st-strand cDNA，即使对有复杂二级结构的RNA，在42℃条件下也能得到良好的反应效果，无需进行高温反转录反应，高温的反转录反应会导致RNA的降解。
本酶适合于长链cDNA的合成及高比例的全长cDNA文库的构建等。
本酶具有以下特性：z超强的延伸能力本反转录酶可以对10kb以上的RNA模板进行良好的反转录反应。
z良好的反转录效率本反转录酶可以对极少量的RNA模板进行良好的反转录反应。
z复杂结构RNA的反转录性能本反转录酶在标准的反转录温度条件下（42℃）对高GC含量的RNA模板能够进行良好的反转录反应。
●包 装：PrimeScript Reverse Transcriptase（200 U/μl） 10,000 Units5×PrimeScript Buffer500 μl●保 存：-20℃。
●酶贮存溶液Tris-HCl（pH7.8） 20mMNaCl 100mMEDTA 1.0mMDTT 1.0mMGlycerol（V/V） 50%●起 源：Purified from an E.coli strain expressing a recombinant enzyme●活性定义以Poly（rA）·Oligo（dT）为模板/引物，在37℃、10分钟条件下，掺入1 nmol的 [3H] dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
RT-PCR试剂盒说明书
R T-P C R试剂盒说明书-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1RT-PCR试剂盒说明书公司：TIANGENOrder:0Toll-free:800-990-6057/400-810-6057TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD版本号：KR121221TIANScript RT KitTIANScript cDNA第一链合成试剂盒目录号：KR104储存条件：-20℃保存。
产品介绍：TIANScript RT Kit（cDNA第一链合成试剂盒）是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的，具有高灵敏度的RT-PCR反应系统，可以从极低量的总RNA或poly (A)+ RNA合成第一链cDNA。
与PCR反应相结合，可用于检测稀有基因的表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA 片段等。
产品特点：合理配备了与cDNA第一链合成反应相关的各种组分，该试剂盒中的TIANScript M-MLV具有高效的逆转录酶活性，对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好，适合于各种PCR耐热聚合酶。
注意事项：1. 用于cDNA合成反应的溶液试剂尽量可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。
有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。
2. RNA样品要避免基因组DNA污染。
3. 避免多次反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处融化状态。
4. 试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。
5. cDNA产物应置于-20℃保存。
操作步骤：1. 在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：1-5 μg总RNA或50-500 ng mRNA；2 μl oligo (dT)15或2 μl Random或2 pmol基因特异引物；2 μl Super Pure dNTPs mM each);补RNase-Free ddH2O定容至μl。
Takara基因组抽提试剂盒说明书
16. 重复操作步骤 15。 17. 将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12,000 rpm 离心 1 分钟。 18. 将 Spin Column 安置于新的 1.5 ml 的离心管上，在 Spin Column 膜的中央处加入 60 μl 的灭菌
2. RNase A1 为混浊溶液，首次使用本试剂盒时，请把 RNase A1 溶液全量加入至 SP Buffer 中，均 匀混合后供实验使用。加入 RNase A1 溶液后的 SP Buffer 请于 4℃保存。
3. 准备 65℃水浴。 4. Solution A、Solution B 若出现沉淀，请于 65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。 5. Rinse B 在首次使用前，请添加 56 ml 的 100%乙醇。 6. 洗脱结合于 DNA 制备膜上的基因组 DNA 时，把 Elution Buffer 或灭菌蒸馏水加热至 65℃使用将
② 菌体本身富含 DNA 酶活性。可以增加一次 Rinse A 的洗净操作。
Q3. 提取的基因组 DNA 中有 RNA 污染，为什么？ A3. ① 请确认在首次实验前是否把 RNase A1 加入至 SP Buffer 中。
② RNase A1 可能失活。RNase A1 须在-20℃下保存，加入了 RNase A1 的 SP Buffer，请于 4℃下保存。RNase A1 比较稳定，一般不易失活。
宝生物反转录说明书
①的反应液 10.0 μl
RNase Free dH 2 O up to 20 μl*5
37℃ 15 min*6
85℃ 5 sec
4℃*7
*1 20 μl 反应体系可最大使用 1 μg 的 Total RNA。
*2 室温反应时，可以延长至 30 分钟。
低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量
的标准曲线。EASY Dilution 也可以单独购买（TaKaRa Code：D9160） 。
EASY Dilution 请与本公司 Real Time PCR 试剂组合使用， 对于其他公司的同类制品的适用性本
是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。因此，在实验中必须采
取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办
法可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。
【使用器具】
尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列（1）或者（2）方法进行处理。
体系。
5． 制品中附加了标准曲线制作用稀释液 EASY Dilution（for Real Time PCR） ，将 Total RNA 或 cDNA 稀
释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。
● ● RNA 样品制备
本制品是将 RNA 反转录成 cDNA 的专用试剂。RNA 的纯度会影响 cDNA 的合成量，而制备 RNA 的关键
璃容器盛装 （也可使用 RNA 实验用的一次性塑料容器） ， 使用的无菌水需用 0.1%的 DEPC 处理后进行高
大连宝生物RT-PCR说明书RR820A
Code No. RR820A 研究用SYBR®Premix Ex Taq TM II(Tli RNaseH Plus)说明书v201405Da目录内容页码●制品说明 1 ●试剂盒原理 1 ●制品内容 2 ●试剂盒外必备主要试剂和仪器 2 ●保存 2 ●使用注意 3 ●操作方法 3 ●实验条件的选择8 ●附录9 ●质量标准11 ●关联产品11●制品说明本制品是采用SYBR® Green I*嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。
制品中含有Real Time PCR 反应的最适浓度SYBR® Green I，是一种2×浓度的Premix Type试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。
本制品中还添加了Tli RNaseH(耐热性RNaseH)，以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以最大限度抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。
本制品Buffer经过改良，使反应特异性比SYBR®Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)（Code No.RR420A）更高。
能抑制非特异性反应，可以在宽广的范围内进行更加准确的定量。
本Buffer和Hot Start法用DNA 聚合酶TaKaRa Ex Taq HS组合使用，可以进行重复性好、可信度高的Real Time PCR解析。
特长：1. 适用于Real Time PCR反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。
2. 在2×浓度的Premix中，预先混有SYBR® Green I，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、灭菌蒸馏水便可进行Real Time PCR反应，操作简单方便。
3. DNA聚合酶使用了TaKaRa Ex Taq HS，可以进行Hot Start法PCR反应，再与Takara Bio公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度之特点。
阶梯式离心法血小板提取及鉴定方法的建立
阶梯式离心法血小板提取及鉴定方法的建立杨祥丽;王佃鹏;李培茂;张志敏;邓丽丹;张艳芳;周飞;黄先青【摘要】Objective To establish a method for the isolation and identification of platelets.Methods 10 healthy volunteers were selected to collect the EDTA anticoagulant venous blood of 3 tubes,each tube was 2 ml,which was divided into the whole blood cell tube,platelet rich plasma (control group),and stepped centrifugal platelet extract (experiment group).Platelet was isolated by simple centrifugation method(PRP) and stepped centrifugal method.The two groups were full blood count and analyzed by microscopic morphology and platelet activity test.Leukocyte specific HGB gene and platelet mitochondrial ND1 gene content was analyzed by real time PCR.Results Platelets were extracted and detected in control group and experimental group.Platelets were found and white blood cells and red blood cells were not remained in experimental group.Platelets and sporadic white blood cells were found in control group.The platelet pick up rate of experiment group was significantly higher than control group,the difference was statisticallysignificant.Experimental gene content HGB of experiment group was significantly lower than control group,the difference was statistically significant (t=-3.281,-2.865,P＜0.05).ND1 gene content of experiment group higher than the control group,the difference was not statistically significant.There was no significant difference for platelet activity test between experimental group and control group (t=-0.046,-0.799,P＞0.05).Conclusion A isolation and identification method of stepped centrifugal platelet was established.The method can be used for the study of platelet gene and the functional analysis of platelets.%目的建立一种血小板提取及鉴定方法.方法选择10名健康志愿者,清晨空腹采集EDTA抗凝静脉血3管,每管2 ml,分为全血细胞管、富血小板血浆提取对照管(对照组)和阶梯式离心血小板提取实验管(实验组).对提纯的血小板进行得率计算、显微镜下形态观察和血小板活性功能试验,并对白细胞特有HGB基因和血小板线粒体ND1基因进行定量分析.结果对照组和实验组均提取和检测到了血小板,形态学观察发现实验组全部为血小板,无白细胞和红细胞残留;对照组可见血小板和零星的白细胞.实验组血小板获得率显著高于对照组,HGB基因含量显著低于对照组,差异有统计学意义(t=-3.281,-2.865;P＜0.05).实验组ND1基因含量高于对照组,单个血小板活性功能吸光度值低于对照组,差异无统计学意义(t=-0.046,-0.799;P＞0.05).结论建立了一种阶梯式离心血小板提取及鉴定方法,该方法可用于血小板基因研究和活性功能等实验分析.【期刊名称】《现代检验医学杂志》【年(卷),期】2017(032)002【总页数】4页(P135-137,140)【关键词】血小板;提取;鉴定【作者】杨祥丽;王佃鹏;李培茂;张志敏;邓丽丹;张艳芳;周飞;黄先青【作者单位】深圳市职业病防治院,广东深圳518001;深圳市职业病防治院,广东深圳518001;深圳市职业病防治院,广东深圳518001;深圳市职业病防治院,广东深圳518001;深圳市职业病防治院,广东深圳518001;深圳市职业病防治院,广东深圳518001;深圳市职业病防治院,广东深圳518001;深圳市职业病防治院,广东深圳518001【正文语种】中文【中图分类】R446.113血小板是血液中的有形成分之一，是巨核细胞成熟后脱颗粒释放到血液中，形状多样不规则，正常血小板直径2～4 μm，无细胞核。
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Code No. RR820A 研究用SYBR®Premix Ex Taq TM II(Tli RNaseH Plus)说明书v201405Da目录内容页码●制品说明 1 ●试剂盒原理 1 ●制品内容 2 ●试剂盒外必备主要试剂和仪器 2 ●保存 2 ●使用注意 3 ●操作方法 3 ●实验条件的选择8 ●附录9 ●质量标准11 ●关联产品11●制品说明本制品是采用SYBR® Green I*嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。
制品中含有Real Time PCR 反应的最适浓度SYBR® Green I，是一种2×浓度的Premix Type试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。
本制品中还添加了Tli RNaseH(耐热性RNaseH)，以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以最大限度抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。
本制品Buffer经过改良，使反应特异性比SYBR®Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)（Code No.RR420A）更高。
能抑制非特异性反应，可以在宽广的范围内进行更加准确的定量。
本Buffer和Hot Start法用DNA 聚合酶TaKaRa Ex Taq HS组合使用，可以进行重复性好、可信度高的Real Time PCR解析。
特长：1. 适用于Real Time PCR反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。
2. 在2×浓度的Premix中，预先混有SYBR® Green I，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、灭菌蒸馏水便可进行Real Time PCR反应，操作简单方便。
3. DNA聚合酶使用了TaKaRa Ex Taq HS，可以进行Hot Start法PCR反应，再与Takara Bio公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度之特点。
4. 在2×浓度的Premix中，预先添加了耐热性RNaseH(Tli RNaseH)，可以最大限度抑制以cDNA作为模板进行PCR反应时，由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。
*：Takara Bio使用SYBR® Green I作为研究试剂已得到Molecular Probes Inc.的许可。
SYBR®为Molecular Probes Inc.的注册商标。
●试剂盒原理本制品使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS进行PCR扩增，通过检测反应液中SYBR Green I的荧光强度，达到监控PCR产物扩增量的目的。
1．PCRPCR法是以微量DNA进行目的片段扩增的方法。
通过DNA链的热变性、引物退火、DNA聚合酶作用下引物的延伸三个步骤循环往复，可在短时间内扩增DNA达100万倍以上。
本制品中的DNA聚合酶由于使用了TaKaRa Ex Taq HS，从而抑制在调制反应液等低温条件下由引物产生的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，大大提高PCR扩增灵敏度。
2．嵌合荧光检测法SYBR®Green I与双链DNA结合后发出荧光，所以可以通过检测反应体系中的SYBR®Green I荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。
具体原理见下图。
通过PCR反应生成双链DNA，SYBR® Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。
-1-●制品内容（50 μl反应×200次）SYBR®Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×Conc.）*1 1.0 ml×5支ROX Reference Dye（50×Conc.）*2200 μl ×1支ROX Reference Dye II（50×Conc.）*2200 μl ×1支*1 内含TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR® Green I等。
*2 ROX Reference Dye是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
例如使用Life Technologies 公司的Real Time PCR扩增仪进行实验就需要校正。
♦需要使用ROX Reference Dye校正的仪器Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR SystemApplied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System (Life Technologies) ♦需要使用ROX Reference Dye II校正的仪器Applied Biosystems 7500和7500 Fast Real-Time PCR System(Life Technologies) ♦不需要校正的仪器Thermal Cycler Dice™Real Time System Single (Code No.TP850/TP870)LightCycler/LightCycler 480 System (Roche Diagnostics)CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)●试剂盒外必备主要试剂和仪器1. 试剂PCR引物：引物设计请参考“附录1.”。
灭菌蒸馏水2. 仪器特定的反应板或微量离心管微量移液器和枪头（高压灭菌）Real time PCR扩增仪（授权仪器）适用的Real Time PCR扩增仪Thermal Cycler Dice Real Time System II（Code No. TP900/TP960）Thermal Cycler Dice Real Time System Single（Code No. TP850/TP870）Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Code No.TP700/TP760)Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System、StepOnePlus Real-Time PCR System（Life Technologies）LightCycler®/LightCycler®480 System（Roche Diagnostics）CFX96TM Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）注：使用Smart Cycler II System（Cepheid）时，建议使用SYBR®Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(Code No. RR420S/A/B)。
●保存：4℃可保存6个月。
避光保存，避免污染。
干冰运输，到货后4℃避光保存。
长期保存请置于-80℃，勿存于-20℃。
产品融化后请于4℃保存，并在6个月内用完。
-2-●使用注意以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。
1．使用时请上下颠倒轻轻均匀混合，避免产生气泡，防止因混合不均匀造成的反应不足。
a)请勿涡旋振荡混匀。
b)SYBR®Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus) (2×conc.)在-80℃存放可能会产生白色或淡黄色的沉淀，可用手握缓慢溶解，于室温短时间避光放置，轻柔上下颠倒混匀直至沉淀全部消失。
c)沉淀会导致溶液成分不均匀，使用前务必充分混匀试剂。
2．配制反应液时，试剂请于冰上放置。
3．本制品中含有荧光染料SYBR® Green I，配制PCR反应液时应避免强光照射。
4．反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，尽量避免污染。
●操作方法*请按照不同仪器的操作手册提供的方法操作。
◆应用Applied Biosystems7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System和StepOnePlus TM Real-TimePCR System的操作方法1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。
反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM 范围内调整引物浓度。
*2 R OX Reference Dye II（50×）比ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用ABI 7500 /7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye II（50×）。
使用ABI 7300和StepOnePlus TM Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye（50×）。
*3 在20 μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。
因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。
另外，2 Step RT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
*4 按照各仪器推荐体系进行反应液配制。
2. 进行Real Time PCR反应。
建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR 条件的优化。
由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。
有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。
-3-< ABI 7300/7500和StepOnePlus TM Real-Time PCR System >两步法PCR扩增标准程序：Stage 1：预变性Reps：195℃30秒Stage 2：PCR反应Reps：4095℃5秒60℃30～34秒*Dissociation stage* 使用StepOnePlus TM时请设定在30秒。
使用7300时请设定在31秒。
使用7500时请设定在34秒。
<ABI 7500 Fast Real-Time PCR System >两步法PCR扩增标准程序：Stage 1：预变性Reps：195℃30秒Stage 2：PCR反应Reps：4095℃3秒60℃30秒Melt Curve Stage◆特别提示：本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。