鱼类DNA提取方法
鱼类线粒体DNA研究新进展
鱼类线粒体DNA研究新进展一、本文概述线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）作为生物体内的一种重要遗传物质，近年来在鱼类研究中逐渐展现出其独特的价值和潜力。
鱼类线粒体DNA研究新进展不仅深化了我们对鱼类遗传多样性的理解，还为鱼类遗传育种、系统发生、种群遗传结构分析等领域提供了有力的工具。
本文旨在综述近年来鱼类线粒体DNA研究的新进展，探讨其在鱼类生物学中的应用前景，以期为鱼类遗传资源保护和可持续利用提供理论支持和实践指导。
本文将首先回顾线粒体DNA的基本结构和特点，然后重点介绍鱼类线粒体DNA的提取方法、测序技术及其在鱼类遗传多样性、系统发生和种群遗传结构分析中的应用。
还将讨论鱼类线粒体DNA在遗传育种和遗传资源保护中的潜在应用价值，并展望未来的研究方向和挑战。
通过本文的综述，希望能够为从事鱼类线粒体DNA研究的学者提供有益的参考和启示，共同推动鱼类线粒体DNA研究的深入发展。
二、鱼类线粒体DNA的结构与功能鱼类线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是一种双链、闭合环状的分子，通常大小为16-20千碱基对（kb），是细胞器中唯一的DNA分子。
鱼类mtDNA的结构主要包括重链（H链）和轻链（L链），其中H链编码了大部分基因，而L链则编码了剩余的少数基因。
这些基因主要编码线粒体氧化磷酸化系统的13个蛋白质亚基，以及2个rRNA和22个tRNA，这些成分共同构成了线粒体的核糖核蛋白体，负责线粒体内蛋白质的合成。
鱼类线粒体DNA的功能主要体现在以下几个方面：mtDNA是鱼类线粒体遗传信息的载体，通过母系遗传的方式传递给后代，因此，在鱼类遗传学和进化生物学研究中，mtDNA被广泛应用为分子标记。
mtDNA编码的蛋白质是线粒体氧化磷酸化系统的重要组成部分，这些蛋白质参与线粒体的能量代谢过程，对鱼类的生命活动起着至关重要的作用。
mtDNA的突变和变异也被广泛用于鱼类种群遗传结构、遗传多样性和系统发育等研究。
福尔马林固定鱼类标本DNA提取方法的优化
中国水产科学 2012年11月, 19(5): 1068−1073 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2012−01−23; 修订日期: 2012−04−25.基金项目: 广东省重大科技计划项目(2009B030600002); 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2010ZD01,2011YD03); 广东省科技计划项目(2011B031100001); 广东省自然科学基金资助项目(9451030002002475).作者简介: 孔啸兰(1986−), 女, 硕士研究生, 研究方向: 渔业生态保护. E-mail: weilankong.2005@ 通信作者: 李纯厚, 研究员. E-mail: scslch@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2012.01068福尔马林固定鱼类标本DNA 提取方法的优化孔啸兰1,2, 陈作志1, 林琳1, 李纯厚1, 梁沛文11. 中国水产科学研究院 南海水产研究所, 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东 广州 510300;2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306摘要: 气候变化和人类活动胁迫致使许多海洋鱼类种群结构发生了显著变化。
为了摸清鱼类种群结构对气候变化和人类胁迫活动的响应机理, 利用福尔马林固定标本研究较早年代海洋鱼类DNA 是一种有效的途径。
为了解决福尔马林固定鱼类样本DNA 提取质量差的难题, 以福尔马林固定近50年的金线鱼(Nemipterus virgatus )标本为例, 研究DNA 提取过程中多个因素对DNA 提取产量的影响。
以取样部位、除甲醛处理、消化时间、抽提方法为考察因素, 以DNA 提取浓度为评价指标, 通过SPSS 软件设计L 8(4×24)正交实验。
结果, 得到的最优处理组为: 肌肉组织样品经GTE 缓冲液浸泡与酒精梯度处理后, 90℃水浴30 min, 真空干燥处理, 加入裂解液与蛋白酶K, 55℃水浴消化3 h, 试剂盒法提取DNA 。
基于DNA条形码技术的鱼类物种鉴定
基于DNA条形码技术的鱼类物种鉴定一、DNA条形码技术简介DNA条形码技术是指使用DNA序列作为生物种类鉴定的一种方法，通过对生物基因组中保守的基因区域进行PCR扩增，将DNA序列转化为数字化的条形码序列，从而实现对不同物种进行鉴定的技术。
二、DNA条形码技术在鱼类物种鉴定中的应用鱼类是一类重要的水生生物，其中含有数以千计的不同物种。
传统的鱼类物种鉴定通常通过形态学、生态学等手段进行鉴定。
但是这些方法存在着一定的局限性，因为同一物种在不同生长阶段、生长环境和物种群体之间存在着显著的形态变异。
而DNA条形码技术在鱼类物种鉴定中的应用为克服这些局限性提供了新的途径。
DNA条形码技术可以在鱼类种群中确定遗传标记，通过对不同物种DNA序列的差异进行分析，可以快速准确地进行鉴定。
此外，DNA条形码技术还可以鉴定从鱼类组织样本、食品中提取的DNA，为鱼类种质资源保护、海产品贸易等方面提供了技术手段。
三、鱼类物种鉴定中的实践应用DNA条形码技术在鱼类物种鉴定中的应用已经得到了广泛的实践。
例如，在中国，对崖州湾、琼东南沿海海域和福建沿海地区的多个鱼类群体进行了DNA条形码分析，成功鉴定了大量物种，进一步丰富了鱼类资源数据库。
此外，在欧美等地区，也已经使用DNA条形码技术对许多鱼类进行了鉴定，例如北极鱼类、白鱼类、小丑鱼类等等。
总之，DNA条形码技术在鱼类物种鉴定中的应用已经得到了广泛的实践，并且还在不断发展与提高。
随着技术的不断进步，相信DNA条形码技术在鱼类物种鉴定中的应用将会越来越广泛，发挥出越来越多的作用，对促进鱼类资源保护和开发利用等方面将会产生重要的影响。
fish核型鉴定步骤
fish核型鉴定步骤
样本制备
收集新捕获的活鱼或从冷冻保存组织中取样。
组织样本包括鳍条、鳃丝或血液（取决于物种）。
核酸提取
使用专门的核酸提取试剂盒或标准的酚-氯仿法提取基因组DNA。
DNA 浓度和纯度应通过分光光度法或荧光定量进行评估。
DNA 消化
选择性地用限制性内切酶消化 DNA，产生特定的片段大小分布。
消化条件（温度、时间、缓冲液）根据所选限制性内切酶而优化。
电泳分离
将消化的 DNA 样品加载到琼脂糖凝胶上并进行电泳分离。
DNA 片段根据大小和电荷迁移，形成称为核型的条形图样。
探针标记
制备物种特异性探针，这些探针是经过荧光或放射性标记的DNA 片段。
探针针对特定的染色体区域或基因序列。
杂交
将标记探针与分离的 DNA 片段进行杂交，允许探针与互补序列结合。
结合过程在受控的条件下进行，例如温度和时间。
洗涤和检测
洗涤杂交膜以去除未结合的探针。
检测结合的探针，通常使用荧光成像仪或放射性自显影法。
数据分析
分析杂交信号强度和图案，以确定特定染色体的存在或缺失。
杂交信号强度可以反映染色体拷贝数变化或突变。
结果解读
根据探针定位和杂交模式，确定核型异常。
异常可能包括：
染色体数目的增加或减少（非整倍体）
染色体结构异常（缺失、易位、倒位）
等位基因的丢失或获得（杂合或纯合）
应用
鱼类核型鉴定广泛用于：
繁殖和遗传管理
物种鉴定和进化研究
疾病诊断和治疗
保护和生物多样性研究。
龙头鱼ISSR-PCR多态性引物最佳退火温度的筛选
龙头鱼ISSR-PCR多态性引物最佳退火温度的筛选1. 引言1.1 研究背景龙头鱼（Siniperca chuatsi）是一种重要的淡水经济鱼类，具有重要的经济价值和科研意义。
随着人们对龙头鱼遗传资源研究的深入，分子生物学技术在龙头鱼研究中得到了广泛应用。
ISSR-PCR技术是一种基于PCR扩增的分子生物学技术，可以用于鱼类遗传多样性研究。
通过设计特定的引物，可以扩增鱼类基因组中的多态性DNA序列。
而引物的退火温度是影响ISSR-PCR扩增效果的重要因素之一。
对龙头鱼ISSR-PCR多态性引物最佳退火温度的筛选具有重要的理论和实践意义。
本研究旨在通过对龙头鱼ISSR-PCR多态性引物的最佳退火温度进行筛选，为进一步研究龙头鱼遗传多样性提供可靠的技术支持。
通过对龙头鱼不同退火温度下的ISSR-PCR扩增效果进行比较分析，可以为龙头鱼的遗传多样性研究提供重要参考。
1.2 研究意义龙头鱼是一种重要的商业性淡水鱼类，具有很高的经济价值和研究意义。
随着生物技术的不断发展，ISSR-PCR技术在遗传多态性研究中得到了广泛应用。
通过对龙头鱼ISSR-PCR多态性引物最佳退火温度的筛选，可以揭示龙头鱼遗传多样性的分布和差异，为种质资源的保护和利用提供重要理论依据。
研究龙头鱼ISSR-PCR多态性引物最佳退火温度也有助于深入了解龙头鱼的遗传背景和进化历史，为龙头鱼的种质改良和遗传育种提供参考。
本研究的意义在于为龙头鱼遗传多样性研究和种质资源保护提供理论支持，同时也为龙头鱼的遗传育种提供重要的参考信息，推动龙头鱼产业的可持续发展。
2. 正文2.1 实验材料与方法龙头鱼样品：从实验室保存的龙头鱼个体中随机选择10个个体作为实验样本。
ISSR引物：选择了5个ISSR引物作为实验引物进行多态性分析。
PCR试剂盒：包括Taq DNA聚合酶、引物、dNTPs、PCR缓冲液等。
琼脂糖电泳试剂：包括琼脂糖、TAE缓冲液等。
1. DNA提取：采用CTAB法从龙头鱼尾鳍组织中提取总DNA。
[整理版]鱼类dna提取方法
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主要步骤如下：（1）取50mg左右的经无水乙醇浸泡过的肌肉样品，用灭菌的牙签挑成细丝状，自然晾干。
转入1.5ml离心管中，加入500μl DNA裂解液，加入5ml 20mg/ml蛋白酶K振荡混匀。
55℃水浴保温2～3小时，每隔10min摇匀一次。
（2）加入等体积的Tris饱和酚，摇匀,用封口膜封好，37℃水浴2～3小时。
每隔10min摇匀一次。
（3）10，000rpm离心10min，小心转移上清液至一新离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1：1），摇匀5～10min。
（4）10，000rpm离心10min，小心转移上清液至一新离心管中，加入等体积的氯仿，摇匀5～10min。
（5）10，000rpm离心10min，转移上清液至一新离心管中，加入0.9倍体积的异丙醇以及0.1体积的3mol/LNaAc，摇匀1～2min。
（6）置于-20℃冰箱中3小时。
2.2鱼类总DNA的纯化试剂：70％乙醇，无水乙醇，1XTE（Ph8.0）、1%琼脂糖。
（1）将2.2.1（6）的总DNA溶液，10，000rpm离心10min，去上清液，留下沉淀。
用70％乙醇500μl洗脱，剧烈摇匀，用手指弹击。
重复此步骤一次。
（2）10，000rpm离心10min，去上清液，留下沉淀，加入500μl无水乙醇洗脱，剧烈摇匀，用手指弹击。
（3）10，000rpm离心10min，去上清液，把离心管斜置于超净工作台中，自然晾干。
（4）加入50μl 1XTE溶解DNA沉淀，用手指弹击，室温放置30min，取3μl DNA 用1％琼脂糖进行电泳检测。
（5）每个DNA样品分成两份，一份－20℃保存备用，另一份4℃保存进行下一步实验。
1.3.1 DNA的提取总DNA的提取采用改进的高盐法。
1、取鱼背部肌肉约0.01g，挥发乙醇后放入1.5mlBuffer管中用无菌小剪刀剪碎，加入400μL SDS提取缓冲液和8μL20mg/mL的蛋白酶K，混均，放在55℃水浴锅中水浴2 h或者37℃过夜，中间震荡数次。
鱼类血液基因组DNA的提取
鱼类血液基因组DNA的提取1.取0.3ml血液于1.5ml离心管中，加入1/6体积(0.05ml)ACD抗凝剂，再加入1ml 0.35 %NaCl 淡水鱼生理盐溶液, 混匀,12 000 r/ min离心2 min (若上清仍带红色可加入0.35 % NaCl 再洗一次) 去上清;2.沉淀加入100μl 0.35 %NaCl 摇匀, 加入400μl 无离子水作低渗处理15 min , 13 000 r/min离心3 min , 去上清, 获乳白色沉淀( 细胞核) ;3.向沉淀中加入100 μl0135 % NaCl , 混匀, 再加入400μl 裂解液缓缓混匀后, 加入蛋白酶K (20mg/ml) 10μl , 温和混匀，置入50 ℃水浴5 h。
4.将消化的样品加入等体积的Tris饱和酚，充分摇匀，12000rpm离心10min；5.将上层水相转入另一无菌1.5ml离心管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），旋涡振荡至充分混匀，12000rpm离心10min；6.将上层水相转入另一无菌1.5ml离心管中；并加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），充分振荡混匀，12000rpm离心10min；7.将上清液转移到另一无菌1.5ml离心管中；加入2倍体积的冰乙醇，1/10体积醋酸钠(NaAc)水平摇动，直到可见絮状DNA析出；8.将样品置-20℃冰箱冷冻30min或冰浴15～20min，取出后再次12000rpm离心10min，使DNA沉淀；9.倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
用700μl 70%乙醇洗涤并晃动，以洗出DNA的杂质；10.倒出乙醇，将DNA用真空干燥或自然晾干，加入适量的TE缓冲液或无菌水回溶，-20℃保存备用。
水产养殖中的鱼类采样与监测技术
水产养殖中的鱼类采样与监测技术在水产养殖业中，鱼类采样与监测技术起着重要的作用。
它们可以帮助养殖者了解鱼类的健康状况，预测鱼类生长和发育情况，及时采取措施预防疾病，并监测水质状况。
本文将探讨水产养殖中常用的鱼类采样与监测技术，并探讨其应用。
一、鱼类采样技术1. 网箱捕捞法网箱捕捞法是一种常用的鱼类采样技术。
养殖者可以将一定数量的鱼类放入网箱中，然后从网箱中捕捞出一部分鱼类进行采样。
这种方法相对简单，操作方便，适用于小规模的养殖场。
同时，网箱捕捞法还可以对鱼类进行分类和计数，有助于了解不同鱼类的生长情况。
2. 拖网捕捞法拖网捕捞法是一种适用于大规模养殖场的鱼类采样技术。
养殖者可以将大型拖网放入养殖池或水体中，然后将拖网牢固地固定在两侧。
接下来，通过拉动拖网来捕捞出一定数量的鱼类进行采样。
相比于网箱捕捞法，拖网捕捞法的采样范围更广，采样数量更大，可以更好地反映整个养殖场的情况。
3. 无创采样技术无创采样技术是一种新兴的鱼类采样技术，它可以在不伤害鱼类的情况下获取样本。
目前，无创采样技术主要包括鳞片DNA采样和尾鳍切片采样。
鳞片DNA采样是通过收集鱼类表面的脱落鳞片，提取其中的DNA进行分析。
尾鳍切片采样则是通过取下鱼类尾鳍的一小部分组织，进行遗传学、病理学等方面的分析。
这两种无创采样技术不仅减少了对鱼类的伤害，还可以提高采样的效率和准确性。
二、鱼类监测技术1. 鱼类健康监测技术鱼类健康监测技术可以帮助养殖者及时发现和防治鱼类疾病。
常用的鱼类健康监测技术包括血液生化指标监测、鳃盖细胞检测和基因测序等。
血液生化指标监测可以通过采集鱼类的血液样本，分析其中的生化指标如糖类、脂类和酶类含量，了解鱼类的健康状况。
鳃盖细胞检测是通过采集鱼类鳃盖组织，观察其中的细胞形态和结构，判断鱼类是否存在病变。
基因测序技术则可以用来分析鱼类的基因组，寻找与疾病抗性相关的基因。
2. 水质监测技术水质是影响鱼类生长和健康的关键因素之一。
近海鱼类多样性调查新方法-环境DNA分析技术
收稿日期：2018-01-07基金项目：国家自然科学基金（41776171）作者简介：高天翔（1962-），男，辽宁辽阳人，教授，博士，研究方向：海洋鱼类分类及其种群遗传.E-mail:gaotianxiang0611@文章编号押2096-4730穴2018雪01-0001-07近海鱼类多样性调查新方法—环境DNA 分析技术高天翔1，陈治2，王晓艳1（1.浙江海洋大学水产学院，国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江舟山316022；2.中国海洋大学水产学院，山东青岛266003）摘要：由于受传统调查手段的限制，长期以来国内缺乏快速、有效的方法对近海鱼类多样性进行准确评估。
环境DNA 是一种稳定、高效、高灵敏度的物种监测新技术。
近年来，已成为监测物种多样性、生物量及其时空分布的重要手段。
本文首先综述了环境DNA 分析技术的概念、方法及该技术在水生生物调查和物种多样性分析中的研究现状。
随后以舟山近海为典型研究区域，探讨了环境DNA metabarcoding 技术在该海域鱼类多样性调查研究中的实际意义和应用前景。
关键词：环境DNA ；生物多样性；物种监测；舟山海域；metabarcoding中图分类号：S932.4文献标识码：AEnvironmental DNA,A New Method for Fish Diversity Investigation in the Coastal WatersGAO Tian-xiang 1,CHEN Zhi 2,WANG Xiao-yan 1(1.School of Fisheries of Zhejiang Ocean University,National Engineering Research Center for Marine Aquaculture,Zhoushan 316022;2.Fisheries College,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)Abstract:Due to the limitation of traditional investigation means,it was hard to evaluate effectively andaccurately domestic marine fish diversity.Environmental DNA (eDNA)is a new technique for species monitor -ing because of its reproducibility,high efficiency and high sensitivity.In recent years,eDNA has become an important technique to monitor the diversity,biomass,and temporal -spatial distribution of aquatic species.Firstly,this paper reviewed the concept,approaches and status about eDNA technique in the aquatic organism.And then,targeting the coastal waters of Zhoushan as typical sea area,we discussed the practical significance and application prospects of eDNA metabarcoding analysis in the fish diversity investigation.Key words:environmental DNA;biodiversity;species monitoring;coastal waters of Zhoushan;metabar -coding 传统鱼类多样性调查方法具有诸多缺点[1-2]。
不同鲤群体的形态差异比较及RAPD扩增分析的开题报告
不同鲤群体的形态差异比较及RAPD扩增分析的开题报告开题报告：不同鲤群体的形态差异比较及 RAPD 扩增分析一、研究背景与意义：随着经济的发展和人民生活水平的提高，人们对食品的要求也越来越高。
鲤鱼是我国最重要的经济鱼类之一，也是民间广泛食用的鱼类。
然而，由于种类繁多，不同品种之间存在巨大的形态差异和遗传差异，因此对这些差异的研究可以为鲤鱼的选育、饲养、质量检测等方面提供科学依据。
二、研究内容：本次研究选择了不同群体的鲤鱼，通过形态学分析和 RAPD 扩增技术，比较其形态差异和遗传差异。
1. 形态差异分析本次研究选择了不同群体的鲤鱼进行形态学分析。
首先在同样的条件下对其进行测量，然后采用一些数学方法对测量结果进行统计学分析，从而得出它们之间存在的形态差异。
2. RAPD 扩增分析RAPD 是随机引物扩增反应。
本次研究根据不同群体的遗传背景，选用适当的引物设计一些不同的反应体系，进行 PCR 扩增后，根据扩增产物的大小、数量等特征，判断它们之间的遗传差异。
三、研究方案：1. 选材：选择不同群体的鲤鱼，包括不同品种、不同地区等，共计50 条鲤鱼。
2. 形态差异分析（1）标本采集：在同样的条件下，对所有鲤鱼标本进行测量：体长、体重、鳞片数量、鳃弓长度等。
（2）数据分析：采用数学统计分析方法，对测量结果进行比较和分析，得出不同鲤鱼群体之间的形态差异。
3. RAPD 扩增分析（1）DNA 提取：从鳃部取样、提取鲤鱼 DNA，纯化后用 TE 缓冲液溶解。
（2）引物设计：按照同源性低、长度在 10-20 bp、 GC 含量在40%-60%、重复率低、富含头尾引物、易于合成等条件选择适当的随机引物。
（3）PCR 扩增：根据引物设计，构建 PCR 反应体系，进行 PCR 扩增，PCR 产物分离后，通过琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图谱判断不同鲤鱼群体之间的遗传差异。
四、预期结果与意义：通过本次研究，可以比较两个不同鲤鱼群体之间的形态差异和遗传差异，为鲤鱼的选育、饲养、质量检测等方面提供科学依据。
鱼类基因组DNA提取方法的优化及PCR扩增
液氮于研钵 中， ２ｇ 将 肝脏研成 粉末。将肝脏 粉末转移 玻 璃 匀 浆 器 中 ， １ １ 提 缓 冲 液 ， 浆 ５次 ， 匀 浆 器 加 ５ｎＬ抽 匀 至 底部为固形 物。将 肝脏 匀 浆 液转 移 至 离心 管 中， 加 ５ 再 ｎＬ抽提 缓冲液至匀浆器 中， １ 并将 匀浆 器 中的液体全 部转
０ ２ 一巯基 乙醇 ； ．５ Ｃ Ａ 。 Ｈ值 为 ８ ３ ； 化一 ．％ ０ ０ Ｍ Ｔ Ｂ ｐ ．）优 步法 抽提 缓冲液 ： ％Ｓ Ｓ ｌ ｍ ｌ Ｔ ｉ—ＨＣ， ． ｍｏ Ｌ １ Ｄ ，Ｏ ｍｏ／ ｒ Ｌ ｓ ｌ０ ３ ｌ ／
ＥＤＴＡＮａ ， ２ ２％ Ｐ ＶＰ ｐ ． Ｐ， Ｈ８ ０。
分 子 生 物学 研 究 带 来 了不 便 和 困难 。
１２ 提取基 因组 Ｄ ． ＮＡ方 法 １２ １ 经典蛋 白酶 Ｋ法 【 取军 曹鱼 新 鲜肌 肉或 肝脏 ．． ８ ］
２ ， 冷生 理 盐 水 洗 净 ， 成 小碎 片 ， 到 研 钵 中 ， 适 量 ｇ用 剪 放 加
为了探 讨适 应范 围广、 效果 好、 操作 简便 易 行的提取 鱼类 Ｄ ＮＡ方法 ， 选择 适 合海 洋鱼 类 快速 提取 Ｄ Ａ 的有 Ｎ
移 至 离 心 管 中 ， ７ 水 浴 １ｈ 加 蛋 白 酶 Ｋ（０ ｍｇｍＬ） ３℃ 。 ２ ／
法进行 了探索研究， 为今后广 泛开展 其亲 缘关 系分析、 基
因组比较、 遗传 多态 性和 某 些特 定基 因的标 记等分 子生 物 学 研 究 提 供 一定 的 基 础 【 Ｊ ｌ 。
（Ｈ ８ ０ ２ ｖ ｍＬ胰 Ｒ ｐ ．）， ０Ｖ， ／ ＮＡ 酶 ， ． ％ Ｓ Ｓ ２×Ｃ Ａ ０５ Ｄ ； Ｔ Ｂ 的 提 取 缓 冲液 （Ｍ ｒ —Ｈ １ ．Ｍ Ｄ Ａ； ． Ｎａ １ １ Ｔｉ ｓ Ｃ ； ２ Ｅ Ｔ １ ４ Ｍ Ｃ ； ０
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主要步骤如下：
（1）取50mg左右的经无水乙醇浸泡过的肌肉样品，用灭菌的牙签挑成细丝状，自然晾干。
转入1.5ml离心管中，加入500μl DNA裂解液，加入5ml 20mg/ml蛋白酶K振荡混匀。
55℃水浴保温2～3小时，每隔10min摇匀一次。
（2）加入等体积的Tris饱和酚，摇匀,用封口膜封好，37℃水浴2～3小时。
每隔10min摇匀一次。
（3）10，000rpm离心10min，小心转移上清液至一新离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1：1），摇匀5～10min。
（4）10，000rpm离心10min，小心转移上清液至一新离心管中，加入等体积的氯仿，摇匀5～10min。
（5）10，000rpm离心10min，转移上清液至一新离心管中，加入0.9倍体积的异丙醇以及0.1体积的3mol/LNaAc，摇匀1～2min。
（6）置于-20℃冰箱中3小时。
2.2鱼类总DNA的纯化
试剂：70％乙醇，无水乙醇，1XTE（Ph8.0）、1%琼脂糖。
（1）将2.2.1（6）的总DNA溶液，10，000rpm离心10min，去上清液，留下沉淀。
用70％乙醇500μl洗脱，剧烈摇匀，用手指弹击。
重复此步骤一次。
（2）10，000rpm离心10min，去上清液，留下沉淀，加入500μl无水乙醇洗脱，剧烈摇匀，用手指弹击。
（3）10，000rpm离心10min，去上清液，把离心管斜置于超净工作台中，自然晾干。
（4）加入50μl 1XTE溶解DNA沉淀，用手指弹击，室温放置30min，取3μl DNA 用1％琼脂糖进行电泳检测。
（5）每个DNA样品分成两份，一份－20℃保存备用，另一份4℃保存进行下一步实验。
1.3.1 DNA的提取
总DNA的提取采用改进的高盐法。
1、取鱼背部肌肉约0.01g，挥发乙醇后放入1.5mlBuffer管中用无菌小剪刀剪碎，加入400μL SDS提取缓冲液和8μL20mg/mL的蛋白酶K，混均，放在55℃水浴锅中水浴2 h或者37℃过夜，中间震荡数次。
2、上清加入300μL的6M/L NaCl溶液，充分摇均，10, 000g/min 离心30 min。
3、本文中加一步：上清移入新管加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)混合液，摇均，10, 000g/min 离心10min。
4、上清移入新管加入等体积异丙醇，-20℃下沉淀1h以上，10, 000g/ min 离心10 min。
5、弃去上清液，沉淀用70%的酒精冲洗两次，无水乙醇洗一次。
6、室温下晾干，加入50μL TE溶液溶解。
-20℃保存，备用。
1.3.2 总DNA电泳检测
取3μL DNA样品和1μL溴汾蓝buffer混合，用1%的琼脂糖凝胶在75V电压下电泳30min，EB溶液染色15~20min，电泳结果用凝胶成像系统观察照相。
1.3.3 PCR扩增体系与程序
PCR反应在UNOⅡBiometra仪上进行，PCR扩增引物序列为AFbL：5′-ACCG AGA CCAATGACTTGAARAACCACCGTTG-3′，AFbR：5′- CTTTGGGAGTTAG GGG TGGG AG-3′。
30 μL PCR反应体系包括：
10× Taq Buffer 3.0 μL
MgCl225 mM·L-1 3.0 μL
dNTPS 2.5 mM·L-1 2.4 μL
AFbL 20 mM·L-1 0.6 μmol/L
AFbR 20 mM·L-1 0.6 μmol/L
DMSO 1.5 μL
BSA 0.1mg/ml 1.0μL
Taq polymerase 0.9 U
DNA模板 1 -2μL(约10ng)
未足体积部分用无菌超纯水补足。
PCR反应程序为：95℃预变性3 min，然后95℃变性45s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，共进行32个循环，最后72℃延伸10 min。
反应设不含模板的反应液作空白对照，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测得到清晰谱带，产物纯化后在ABI 3730自动测序仪上用扩增引物双向测序。