细菌病毒培养技术

三 细菌的计数技术
细菌性疫苗在制造中，往往需要计算每毫升所含细 菌的总数。 1.显微镜直接计数法 2.活菌计数法 ➢倾注平板培养法 将被测样品根据菌数含量多少， 用普通肉汤或生理盐水作10倍递进稀释。分别取其 1ml加在灭菌的平皿中，然后取预先加热融化且冷至 45～50℃，立即摇匀放平，凝固后培养，统计平皿上 长出的菌落数，乘以稀释倍数，即为每毫升样品中含 有的活菌数。
吸附 侵入
病毒大分 子合成
装配 释放
早期：病毒特异性酶的合成 病毒核酸复制 病毒结构蛋白质合成
病毒培养技术
1 病毒的复制 2 病毒的动物培养技术 3 病毒的禽胚培养技术 4 病毒的细胞培养技术
1 病毒的动物培养技术
➢ 动物的选择
应当选择SPF动物。选择动物的条件下： ✓ ①选用对病毒易感性高。 ✓ ②动物健康、体重、年龄尽可能一致，符合培养病毒要求。 ✓ ③遗传特性相似，实验结果具有一致性、准确性和可比性。 ✓ ④外购动物要了解当地动物群健康，饲养及免疫接种情况，
➢ 微量点板计数法 接种量为0.02ml
3 比浊计数法
是对比细菌悬液与标准管的浊度，求出大致的 菌数。
原理：菌液中含数多少与其浑浊度成正比。
方法：比浊管比浊法和分光光度计法。
优点：快速简便
应用：常用于菌苗及其他生物制剂的生产、细 菌毒力的测定和攻毒量的确定等。
标准比浊法
比浊管 由国家生物制品检定部门提供，每套包括一 支细菌比浊标准管、数支对照空管和一张比浊用的图 片。
温1次，做好记录。
2.出现反应症候动物，按规定方法剖杀，采取 含病毒高的组织脏器。
病毒培养技术
1 病毒的复制 2 病毒的动物培养技术 3 病毒的禽胚培养技术 4 病毒的细胞培养技术
2 病毒的禽胚培养技术
工序过程：
如何完成此 项任务？
选择禽胚 前孵育 接种
后孵育
收获病毒
操作要点
➢ 1 禽胚的选择
鹦鹉热衣原体和立克 次氏体等，6～8日龄
流感、新城疫、传 支等，9～11日龄
操作要点
比浊方法 将空管拭刷干净，加入待测菌液1ml。将 标准管与待测管并列紧贴在图片前，使两管受光均匀， 然后透过两管管壁对比观察，目测图片的清晰度，并 将两管左右换位，反复对比。
例如：测定大肠杆菌的菌数，若1ml菌液加入4ml的生 理盐水后，与标准管的浊度相同，即表示该菌液经5 倍稀释后相当于标准管。大肠杆菌标准管的菌数相当 于8亿个／ml，故被测菌数为8×5=40亿个／ml。
接前要经过健康观察，以免误用带有病原体动物。
➢动物接种途径和方法
1.皮内接种 2.皮下接种 3.肌肉接种 4.静脉接种 5.腹腔接种
➢ 动物接种后的饲养管理与收获病毒
1.接种病毒后的动物,每天观察和检查规定的
各项指标，主要有精神、食欲、粪便、尿液、被毛
状态、活动情况和接种部位的局部反应，每天测体
细菌培养技术
1 细菌的培养基本知识 2 细菌的规模化培养 3 细菌的计数技术
（一） 细菌生长繁殖的条件
①水
ຫໍສະໝຸດ Baidu
②碳源
1、营养物质 2、温度
③氮源 ④无机盐 ⑤生长因子 有些细菌需要
3、渗透压 4、PH
4、对气体要求
①对氧气要求：专性需氧菌 微需氧菌 兼性厌氧菌 专性厌氧菌
②对CO2要求： 5% CO2
➢ 平板表面散布法 接种量为0.1ml
➢ 琼脂板的制备 计数
稀释菌液
接种
培养
➢ 选择菌落数在30～300之间的平皿用以计数，每个稀释度应取
-8
其菌落平均数。
活菌数／ml=2个平板平-均8 菌落数×10 10×稀释倍数。
举例：在10 稀释的平板中所得平均菌落数为78个。
计算结果：78×10×10 =7.8×10 个活菌／ml
分光光度计法
借助于分光光度计。在一定波长下测定菌液的 光密度值
注意 ：测量时一定要控制菌浓度与光密度成 正比的线性范围内，否则不准确。
病毒培养技术
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病毒复制：以病毒基因为模板，在酶的作用下，分别合成基因和蛋 白质，再组装成完整的蛋白颗粒，这种方式称为复制（ replication) 。
透析器
1.螺栓 2.培养基贮存室 3.视镜 4.透析膜 5.培养室
5、连续培养
连续培养 系统是一个恒 定体积的流动 系统，新鲜培 养基以恒定的 速度流入，又 以相同的速率 流出除去多余 的液体，细菌 始终保持在对 数生长期。
细菌培养技术
1 细菌的培养基本知识 2 细菌的规模化培养 3 细菌的计数技术
是目前菌苗生产的主要培养法。安装有自动控温、消泡、 调pH、自动控制通气量、自动磁力搅拌等装置。细菌接 种1～2h，再通入滤过除菌空气，并适当搅拌分散通入 的气体，以增加培养液中的溶氧量。及时补充营养 。
4．透析培养法
在细菌培养液与培养基之间隔有一层透析 膜，使培养基中高浓度小分子量的营养成 分通过透析膜（不能透过大分子的细菌或 毒素）不断扩散到细菌培养液中，供细菌 生长繁殖，获得高浓度的细菌或毒素。
二、细菌的规模化培养
➢ 种子接种 是指菌体增殖培养物。 ➢ 收获时间 最佳培养时间依据细菌的生长曲线而定。
对 数 生 长 期
➢培养方法
1．固体培养基表面培养法
用于制备抗原、灭活苗、冻干苗。
2．液体静置培养法
需氧菌（深度1/2）和兼性厌氧均可用，厌氧菌（深度 3/4），还需加肝块。
3．深层通气培养法
（二）细菌生长繁殖的方式 链球菌
繁殖方式： 二分裂法
八 叠 球 菌 葡萄球菌
（三）细菌生长繁殖的速度
（四）细菌生长繁殖的速度
分为四期：迟缓期 、 对数期、稳定期、衰退期
（五）常用培养基种类
厌氧培养基
选择培养基
增菌培养基
鉴别培养基
基础培养基
细菌培养技术
1 细菌的培养基本知识 2 细菌的规模化培养 3 细菌的计数技术
理想的禽胚是SPF鸡胚，常以非免疫鸡胚补充。
2 禽胚的接种前孵育
孵化前消毒，温度37.5～38.5℃，相对湿度50%～60%， 定时翻蛋，保证通风。孵化4～5d照蛋检查，淘汰无精蛋 和死胚，孵化至所培养病毒需要的日龄即可接种。
3 禽胚的接种途径
痘病毒和疱疹病 毒，10～13日龄
正粘病毒和副粘病 毒，10～11日龄